практические навыки по микробиологии. 1. микроскопические методы исследования цели задачи виды микроскопии и их применение в микробиологической диагностике
 Скачать 1.02 Mb.
|
|
24.Определение чувствительности к антибиотикам методом серийных разведений. Метод СР (количественный) – позволяет определить мин. ингибир. концентрацию (МИК) данного антибиотика для данного штамма. 1)В ряд пробирок разливают МПБ в объеме 1 мл, а в первую – 1,9 мл. 2)В отделной пробирке готовят матричный р-р антибиотика с высок. концентрацией. 3)Из нее в первую пробирку вносят 0,1 мл, перемешивают и переносят 1 мл в следующую пробирку, ее встряхивают и переносят 1 мл из нее в следующую и т. д. 4)Из последней пробирки ряда по окончании приготовления разведения 1 мл выливают. 5)Затем во все пробирки вносят 0,1 мл взвеси суточной культуры со скошенного агара =>термостат(37°С на 24 ч) 6) Через сутки исследуют посевы и отмечают наим. концентрацию антибиотика, вызвавшую задержку роста –минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация -наименьшая концентрация антибиотика, которая подавляет видимый рост исследуемого микроорганизма in vitro (МИК). В контрольной пробирке (без антибиотика) бактерии размножаются, вызывая помутнение бульона. При постановке опыта на плотной среде: 1) по 20 мл расплавленного МПА разливают в несколько флаконов и в каждый добавляют определенное кол-во антибиотика, перемешивают и разливают по чашкам Петри. 2)После застывания среды производят посевы испытуемых культур =>термостат(37°С на 24 ч). 3)Через сутки исследуют посевы и определяют МИК. 25. характеристика и методы определения факторов патогенности микроорганизмов: коагулаза, лецитиназа, гиалуронидаза, гемолизин, фибринолизин, каталаза, фосфатаза, уреаза, некротоксин, летальный токсин, энтеротоксин. Патогенность - это видовой признак, определяющий способность определенного вида микроорганизмов вызывать инфекционный процесс у определенного вида макроорганизма. Вирулентность - фенотипический признак микроорганизма, мера патогенности Ферменты и механизм действия
а) плазмокоагулазной активности бактерий Посев выделенной культуры бактерий проводят в разведённую физ. раствором 1:4 стерильную цитратную плазму крови. Пробирки ставят в термостат при 37°С на 2 - 5 часов. При наличии у выделенной культуры фермента плазмокоагулазы происходит коагуляция плазмы, а при отсутствии данного фермента жидкость будет прозрачной. б) фибринолитической активности бактерий Продлив время пребывания пробирок в термостате, можно наблюдать растворение сгустка, что свидетельствует о наличии фибринолитической способности изучаемого штамма. в) лецитиназной активности бактерий Лецитиназная активность проявляется при посеве на агар с яичным желтком в образовании вокруг колоний характерного помутнения с радужным венчиком. Идентификация бактерий по гемолитической активности. Бактериальные гемолизины — мембранотоксины, которые вызывают нарушение целостности мембраны эритроцитов и их лизис. Гемолитической активностью обладают многие патогенные бактерии: S.aureus, S.pyogenes, C.рerfringens, C. tetani,C. botulinum, C. diphtheriae и др. Исследуемую культуру засевают в чашки Петри с 5%-м кровяным агаром, посевы инкубируют при 37°С в течение 24 ч. Гемолизин, выделяемый растущей культурой бактерий, диффундирует в толщу агара и вызывает лизис эритроцитов, что проявляется в виде светлой зоны вокруг колоний. Методы идентификации бактерий по токсигенности (по способности синтезировать экзотоксин). 1. Биологический метод. Испытуемые культуры или токсины в определенных дозах вводят лабораторным животным с последующей регистрацией их гибели (см. практические навыки 8.1) и расчетом летальных доз. 2. Иммунологические методы с применением стандартных антитоксических антител: реакция нейтрализации токсина (см.практические навыки 9.5), ИФА, РИА и РИФ; 3. ПЦР - выявление гена плазмид, детерминирующего синтез экзотоксина. Экзотоксины синтезируются в основном грамположительными (S.aureus, S.pyogenes, C.perfringens,C.tetani,C.botulinum, C diphtheriae и др.), также грамотрицательными бактериями (E.coli, V. сholerae и др.) 26. биологический метод исследования: цель, задачи, назначение, этапы. Биологический (экспериментальный) метод исследования Биологический метод исследования - совокупность способов искусственного воспроизведения клинической картины инфекционных болезней или их синдромов на лабораторных животных. Этот метод преследует также ряд других целей: 1. Диагностика инфекционных болезней. 2. Выделение и идентификация чистой культуры. 3. Определение вирулентности. 4. Выделение и идентификация экзотоксинов. 5. Культивирование вирусов. 6. Получение иммунопрепаратов. 7. Проверка безвредности и эффективности лечебных препаратов (в т.ч. химиопрепаратов, иммунопрепаратов) и другие. Этапы метода: 1. Забор материала (виды материала см. Бактериоскопический метод), 2. Обработка материала. 3. Выбор лабораторного животного, исходя из его чувствительности к предполагаемому возбудителю, его стандартизация и маркировка. 4. Заражение животных одним из способов (подкожный, внутрикожный, внутрибрюшинный, внутримышечный, интрацеребральный, внутривенный, в желудок, интраназальный и др.) в зависимости от тропизма микроба. 5. Регистрация признаков болезни зараженного животного или его смерти. 6. Прижизненный забор материала от животного и проведение бактериологического и серологического исследования, постановка аллергической пробы. 7. Вскрытие, изучение патологоанатомической и патоморфологической картины, протокольный посев органов павших или убитых животных (для выявления обсемененности и выделения чистой культуры). Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов. 8. Идентификация выделенной культуры. 9. Заключение по результатам исследования. Оценка метода: Метод высокочувствителен, может быть использован на ранних этапах болезни, но не всегда доступен, дорог, длителен, небезопасен 27. серологический метод исследования. Серологическим называют метод исследования, в основе которого лежит реакция специфического взаимодействия антигенов и антител. На основе ее специфичности возможно определение неизвестных антител при взаимодействии с известным антигеном или неизвестного антигена по связыванию с известным антителом. Метод решает следующие задачи: I. Серологическая диагностика инфекционных и иммунных заболеваний, основанная на обнаружении в сыворотке крови больных антител. Обоснованием для постановки диагноза является: а) обнаружение антител к возбудителю болезни ц диагностическом титое. т.е. в таком разведении сыворотки, в котором реакция может бытьположительна только у больных и отрицательна у здоровых; б) нарастание титра антител при повторном исследовании в динамикеболезни, что позволяет отличить заболевание от поствакцинального илипостинфекционного иммунитета. 2/Серологическая диагностика инфекционных заболеваний, основанная на обнаружении в биологических жидкостях или тканях антигенов патогенных микробов. 3. Серологическая идентификация неизвестных микробов, выделенных при бактериологическом методе диагностики инфекционных болезней. Обоснованием для отнесения микроба к определенной серофуппе, сёроварианту или виду является: а) взаимодействие микроба с адсорбированной моноспецифической сывороткой, содержащей антитела только к-специфическим для микроба антигенам (из таких сывороток в процессе их производства сорбируются антитела к групповым антигенам); б) взаимодействие микроба с моноклональными антителами, полученными методом гибридомной техники, т.е. метода культивирования гибрада из плазматической клетки, синтезирующей антитела одной специфичности, с опухолевой клеткой, способной к длительному размножению в культуре ; в) взаимодействие микроба с диагностической сывороткой в разведении, составляющем не менее половины титра этой сыворотки. Определение активности поствакцинального или постинфекционного индивидуального или коллективного иммунитета. Получение и определение титров иммунных диагностических, лечебных и профилактических сывороток, поли- и гамма-глобулинов.  Забор материала делают из вены. Необходимость в проведении серологического исследования возрастает, если имеется подозрение на инфекции половой системы. Чтобы подтвердить полученные данные, может назначаться дополнительный серологический анализ. Его проводят, чтобы узнать количество антител. Лаборантом в сыворотку крови вводится антиген возбудителя, а затем оценивается реакция. Возможно также определение инфекции по антигенам, тогда осуществляется введение антител для выявления антигенов. Второй вариант также подходит для получения информации о группе крови. Нормой считается отсутствие антител, такой результат анализов показывает, что инфекции нет. С помощью современной методики врачам удается на начальной стадии узнать о заболевании, постоянно контролировать его развитие, назначить эффективную терапию. Анализ крови дает быстрый и точный результат, больного не нужно готовить к проведению исследования. Исследование крови выполняется для определения количества антигенов, антител обследуемого пациента. Серологическое обследование определяет количество гормонов, других веществ в полученном материале. В функции иммунной системы входит блокировка инородных тел. При появлении инфекции вырабатываются собственные антитела, задачей которых является выявление возбудителей разных заболеваний, уничтожение их. Это используется в медицине для проведения исследования, постановки правильного диагноза, назначения лечения. 28. реакция агглютинации на стекле: значение, постановка, ингредиенты, учет результатов. Иммунобиологический или серологический метод диагностики -это метод, используемый для выявления титра (концентрации) антител в сыворотке крови (серодиагностика) и обнаружения антигенов в биологических жидкостях (сероидентификация). В основе иммунологического метода лежат серологические реакции- реакции взаимодействия между соответствующими антителами и антигенами. Для проведения серологических реакций используют: диагностические иммунные сыворотки и диагностикумы. Иммунные сыворотки готовят из крови людей или животных, иммунизированных определенным антигеном, которые лиофилизируют и указывают их титр. Сухую сыворотку растворяют в дистиллированной воде до первоначального объема. Виды сывороток: а) Нативные (неадсорбированные)- неспецифичны, способны давать перекрестные реакции; б) Адсорбированные - строго специфичны - реагируют только с гомологичным антителом; в) Агглютинирующие - используются только для реакций агглютинации; г) Преципитирующие - используются только для реакций преципитации; д) Моновалентные - состоят из одного вида антител; е) Поливалентные - содержат в своем составе несколько типов антител. В качестве диагностикумов применяют взвеси живых или убитых микробов, фракции микробных клеток, токсины бактерий. 1. Посуда для серологических реакций должна быть чистой и сухой, стерилизация для нее необязательна. Пробирки, пипетки не следует помещать в растворы дезинфицирующих веществ, кислот и щелочей. Стекло кипятят в простой воде, а пипетки затем просушивают этиловым спиртом и эфиром. 2. Для серологического исследования кровь (у обследуемого) берут натощак (во избежание мутноватости сыворотки, т. е. хилезности) из локтевой вены или уколом из пальца. При взятии крови необходимо соблюдать правила асептики: 5-6 мл. крови берут в стерильную пробирку (лучше центрифужную), которую тотчас после взятия ставят на 1, 5 - 1 час в термостат при 37ºС. Образовавшийся кровяной сгусток отделяют от стенок стеклянной палочкой, после чего ставят на 18-20 часов при 4ºС (в холодильник) или центрифугируют. Полученную сыворотку переносят в другую стеклянную пробирку при помощи пипетки. Сыворотка может оставаться на сгустке не более 48 часов после взятия крови, чистая сыворотка может храниться в стерильных условиях при температуре 4 - 10ºС до 1 месяца. Второй способ получения сыворотки крови - это центрифугирование крови в центрифуге. 3. Любая серологическая реакция ставится в определенном объеме, все компоненты, участвующие в серологических реакциях, берутся в рабочих дозах (т.е. заранее разводятся) и в равных объемах. 4. Необходимо строго соблюдать последовательность внесения ингредиентов, участвующих в серологических реакциях, а также условия, обеспечивающие взаимодействие Аг и Ат. 5. На каждый из компонентов, участвующих в серологических реакциях, ставится контроль. 6. Учет любой серологической реакции начинают с проверки достоверности результатов в контролях 7. При серодиагностике серологические реакции с сывороткой крови одного обследуемого ставят 2 раза с интервалом в 7-10 дней, в динамике должно отмечаться нарастание титра антител в положительном случае. Только тогда диагноз заболевания считается правильным. РА - это склеивание частиц антигена под воздействием специфических к ним антител в присутствии электролитов с образованием видимого осадка-агглютината (т.е. комплекса Аг+Ат). Алгоритм постановки реакции агглютинации на стекле (ОРА) 1. На обезжиренное предметное стекло нанесите пипеткой 2 капли специфической адсорбированной агглютинирующей сыворотки и 1 каплю ИХН (изотонического раствора хлорида натрия). Примечание: а) Агглютинирующие адсорбированные сыворотки для постановки РА на стекле не, разводят, а только растворяют (если они были сухие). б) Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:50-1:100. в) Капли вносятся так, что бы между ними было расстояние. 2. Культуру петлей (или пипеткой) внесите в каплю физиологического раствора («КА») и в одну из капель сыворотки («0»). Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является «КС». 3.Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 минут. Внимание! - Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю с ИХН. - Культуру петлей тщательно растирают на стекле на границе с каплей, а потом вносят в каплю. «КС» должен оставаться прозрачным, а в «КА» должна наблюдаться равномерная муть. Если в капле, где культура смешанна с сывороткой, появляются хлопья агглютинина на фоне прозрачной жидкости, то результат реакции считают положительным. Положительный результат РА свидетельствуют о гомологичности (соответствии друг другу) АГ и АТ. При отрицательном результате реакции в капле «О» будет равномерная муть, как в капле «КА», что свидетельствует о несоответствии Аг и Ат. 29. реакция развернутой агглютинации. с целью выявления титра специфических антител у больного. Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: ++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; — - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная). За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++) За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++ 30. реакция пассивной гемагглютинации. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) Реакция ставится: 1) для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий и других высокодисперстных веществ, риккетсий и вирусов, комплексы которых с агглютининами в обычных РА увидеть не удается, 2) для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперстным веществам и мельчайшим микроорганизмам. Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на инертных частицах (латекс, целлюлоза, полистерол, оксид бария и др. или эритроциты барана, I(0)-группы крови человека) В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика). Если нагрузить эритроциты антителами (эритроцитарный антительный диагностикум), то можно применять для выявления антигенов. Постановка. В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч. Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.  31. реакция термокольцеприципитации. Для ее проведения необходимы следующие компоненты: 1. Экстракт из исследуемого сырья. Исследуемые пробы кожи, нанизанные на проволоку, стерилизуют в автоклаве при 1,5 атм 30 минут. Пробы охлаждают, измельчают, помещают в баночки и заливают карболизированным физиологическим раствором (на 1 г сырья 10 мл экстрагента). Продолжительность экстрагирования от 16-20 ч (холодный способ). Пробы от свиных шкур и мяса экстрагируют горячим способом в водяной бане в течение 30 минут. Полученные пробы фильтруют через асбестовую вату. Экстракт из исследуемого сырья должен быть прозрачным. В экстракте, полученном из кожсырья больных животных, содержится сибиреязвенный антиген. 2. Сибиреязвенную преципитирующую сыворотку получают путем гипериммунизации лошадей на биофабриках. Для этого лошадям-продуцентам внутривенно вводят многократно (16-17 раз) возбудитель сибирской язвы (антиген) с интервалом в три дня в нарастающих дозах с 5 до 70 мл. Предварительно до гипериммунизации лошадей вакцинируют для создания грунд-иммунитета. Через 9-10 дн. после последнего введения антигена у лошадей берут кровь в количестве 5-6 литров и из нее получают преципитирующую сыворотку, которая содержит сибиреязвенные антитела. Эту полученную специфическую сыворотку консервируют 0,5%-ным раствором фенола и отстаивают в течение двух месяцев, фильтруют через стерилизующие пластины и расфасовывают в стерильные флаконы. Реакцию кольцепреципитации ставят в узких преципитационных пробирках, в которые разливают преципитирующие сыворотки. Затем наливают раствор преципитиногена. При положительной реакции на границе соприкосновения ингредиентов появляется мутное кольцо преципитации.Примером такого способа постановки РП является реакция термопреципитации по Асколи, применяемая для обнаружения термостабильного гаптена возбудителя сибирской язвы. В чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой и засевают исследуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги. Инкубируют при 37 ПС в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации.Реакция преципитации в геле носит название иммунодиф-фузии. Часто форезом в геле — иммуноэлектрофорез. Принцип метода: исследуемый антиген фракционируют электрофорети-чески. полученные фракции анализируют методом двойной диффузии при помощи антисыворотки. Постановка реакции кольцепреципитации. 1) В преципитэционную пробирку наливается 0,3 мл пре-ципитирующей сыворотки цельной или в разведении 1:5, 1:10. 2) По стенке пробирки осторожно наслаивается преципи-тиноген- Реакция считается положительной, если на границе двух жидкостей образуется мутное кольцо выпадающего белка не позднее 5-15 минут. При постановке реакции преципитации применяют следующие контроли: а) антиген и физиологический раствор; б) специфическая сыворотка и физ. раствор; в) антиген и неспецифическая сыворотка. Во всех контрольных пробирках помутнения не должно быть Для реакции преципитации пользуются специальными преципитационными пробирками высотой 40-60 мм и диаметром 4-5 мм, преципитация в узких пробирках наступает значительно скорее и проявляется более чётко, чем в обычных пробирках, их тщательно моют и высушивают, чтобы стекло их было совершенно прозрачным и сухим. 32. реакция диффузной преципитации. Методика постановки РДП в геле состоит в том, что в слое агарового геля делают несколько углублений (лунок) и в них наливают антигены и сыворотки так, чтобы антиген и сыворотка были в соседних лунках. Из лунок антигены и сыворотки начинают диффундировать в слой геля. Диффузия направлена во все стороны от каждой лунки. В пространстве между лунками, содержащими антиген и сыворотку, последние диффундируют навстречу друг другу (двойная диффузия в геле). Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс антиген + антитело, который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает (преципитирует) на месте образования в виде беловатой полосы преципитации, которая хорошо заметна на фоне прозрачного геля (рис. 32). Если же диффундирующие друг другу навстречу антиген и сыворотка будут негомологичны, полосы преципитации не образуется.  Рисунок 32. Схема РДП Методика постановки РДП в геле состоит в том, что в слое агарового геля делают несколько углублений (лунок) и в них наливают антигены и сыворотки так, чтобы антиген и сыворотка были в соседних лунках. Из лунок антигены и сыворотки начинают диффундировать в слой геля. Диффузия направлена во все стороны от каждой лунки. В пространстве между лунками, содержащими антиген и сыворотку, последние диффундируют навстречу друг другу (двойная диффузия в геле). Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс антиген + антитело, который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает (преципитирует) на месте образования в виде беловатой полосы преципитации, которая хорошо заметна на фоне прозрачного геля (рис. 32). Если же диффундирующие друг другу навстречу антиген и сыворотка будут негомологичны, полосы преципитации не образуется. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||