практические навыки по микробиологии. 1. микроскопические методы исследования цели задачи виды микроскопии и их применение в микробиологической диагностике

• Название: 1. микроскопические методы исследования цели задачи виды микроскопии и их применение в микробиологической диагностике
• Анкор: практические навыки по микробиологии
• Дата: 10.01.2021
• Размер: 1.02 Mb.
• Имя файла: 1-8.docx
• Тип: Задача; #166876
• страница: 3 из 8

12.Методы культивирования анаэробов

Создание анаэробиоза достигается несколькими методами.

1. Физический метод. Заключается в том, что посевы помещают в герметичный сосуд, из которого выкачивают воздух и помещают его в термостат. В этих целях применяют ряд приборов, из которых наиболее распространенным является анаэростат.

После того как во внутрь анаэростата помещены чашки Петри с посевами, его закрывают крышкой, которую фиксируют винтом. К открытому крану присоединяют масляный вакуумный насос и необходимую степень разряжения устанавливают по показателю вакуум-манометра. Когда воздух откачен, кран закрывают и анаэростат отсоединяют от насоса, а затем помещают в термостат.

2. Химический метод

• 
  культивирование на плотных питательных средах в спе­циальных аппаратах, в которых кислород поглощается химиче­скими веществами (аппарат Аристовского, эксикатор):
  
• 
  культивирование в жидких средах в присутствии редуци­рующих веществ (аскорбиновая кислота, тиогликолевая кислота и др.).
  

4. Биологический метод создания анаэробиоза основан на совместном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в загерметизированных чашках Петри (рис.42). Вначале вырастают аэробы, которые используют кислород, при ого отсутствии начинают расти анаэробы. Этот метод ненадежен и может быть использован только для культивирования нестрогих анаэробов.

Питательные среды, на которых выращивают анаэробы, по своему составу аналогичны обычным средам. Отличаются лишь тем, что они сами по себе должны создавать анаэробные условия. С этой целью питательные среды разливаются высоким столбиком, до посева жидкие среды кипятят для удаления из них кислорода, а на их поверхность наслаивают вазелиновое масло для изоляции от атмосферного кислорода. Кроме этого в состав питательных сред входят различные редуцирующие вещества, уменьшающие содержание в них свободного кислорода. В качестве редуцирующих веществ обычно используют глюкозу (1-2%-ную), муравьинокислый натрий 0,3-0,5%-ный и пр. Часто в жидкие питательные среды опускают какие-либопористые вещества (кусочки тканей, пемзу, вату), которые адсорбируютна своей поверхности воздух.

Для выделения анаэробных бактерий из патологического материала, а также для их накопления и сохранения используют жидкую питательную среду Китта-Тароцци (мясо-пептонный печеночный бульон — МППБ). В состав МППБ входит печеночный экстракт с МПБ (1:1), который разливают по пробиркам высоким столбиком. На дно пробирки предварительно помещают кусочки вареной печени, а сверху после разлива среды наслаивают вазелиновое масло.

В ряде случаев к МППБ добавляют стерильный раствор глюкозы в количестве 0,5 % (в пересчете на сухое вещество).

Для дифференциации патогенных анаэробов используют среды: кровяной агар Цейсслера, сахарный МПА, молоко, железо-сульфатный агар (среда Вильсона-Блера) и др.

Кровяной агар (Цейсслера): 3%-ный мясо-пептонный агар с 1-2 % глюкозы, смешивают (при температуре 50 °С) с 15-20 % свежей де-фибринированной крови барана, крупного рогатого скота, лошади.

Сахарный агар готовят на бульоне Мартена с добавлением 0,1 % глюкозы и 2 % агар-агара.

Молоко обезжиривают и разливают по пробиркам высоким столбиком и сверху наслаивают вазелиновое масло.

Железо-сульфитный агар (Вильсона-Блера). К 100 мл 3%-ного МПАс 10% глюкозы прибавляют 10 мл 20%-ного раствора сульфита натрия и 1 мл 8%-ного раствора хлорида железа. Черные колонии образуют анаэробные бактерии за счет восстановления сульфита натрия в сульфат натрия, который, соединяясь с хлорным железом, образует черный осадок сульфида железа.

13Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов

Для получения изолированных колоний облигатных анаэробов используют следующие методы:

Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэростат и выдерживают в термостате при 37°С в течение 24-72 часов.

Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают. Пробирки инкубируют в обычном термостате.

Метод Виньяля-Вейона. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлаж­денным до температуры 40-45°С сахарным агаром вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Затем содержимым пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов.

Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала в 0,5% расплавленном агаре. Содержимое пробирки выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках располагается стеклянная пластинка размером 6x6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри.

Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод “перевернутых чашек”. При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель меж­ду краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином и термостатируют при 37°С до появления изолированных колоний анаэробов.

Первый день. Исследуемый материал засевают в несколько пробирок в среду накопления Китта-Тароцци градуированной или пастеровской пипеткой. Перед посевом эту среду прогревают в кипящей водяной бане 10-20 мин для удаления растворенного в ней воздуха, а затем охлаждают до 30-37 °С.

Часть пробирок с посевами прогревают в водяной бане при 80 °С 20 мин для уничтожения неспоровых форм бактерий. Затем все посевы культивируют в термостате при 37 °С.

В этот же день проводят заражение лабораторных животных исследуемым материалом.

Второй день. При росте анаэробов в среде Китта-Тароцци обнаруживают появление помутнения или помутнение и газообразование. Материал для приготовления мазков берут пастеровской пипеткой, которую опускают через слой масла до дна пробирки. Масло с поверхности стенок пипетки удаляют стерильной ватой при помощи пинцета. Эту операцию производят аккуратно над сосудом с дезинфицирующим раствором.

Мазки готовят обычным способом, фиксируют на пламени и окрашивают по Граму. При микроскопии регистрируют наличие грамположительных палочковидных форм (со спорами или без спор) и пересевают культуру из среды Китта-Тароцци на плотные питательные среды: для выделения чистой культуры и изучения культуральных свойств бактерий. Для этого подготавливают три чашки Петри с кровяно-сахарным МПА. Каплю материала со среды Китта-Тароцци наносят на поверхность плотной питательной среды, распределяют ее стеклянным шпателем. Этим же шпателем последовательно производят пересев на вторую и третью чашки.

Посевы на 24-48 часов помещают в анаэростат или другие приборы и инкубируют при 37 °С.

Изолированные колонии анаэробных микробов можно получить в глубине плотной питательной среды. Для этой цели используют также метод последовательного разведения с применением трубок Вейон-Виньяля или метод Перетца.

Третий день. Производят изучение выросших изолированных колоний и из типичных делают мазки и отсевают в среду Китта-Тароцци для выделения чистой культуры анаэробных бактерий.

Четвертый день. Из выросшей культуры на МППБ готовят мазки, окрашивают по Граму, проводят микроскопию и убеждаются в том, что выделена чистая культура бактерий.

Полученную культуру засевают на дифференциальные питательные среды: кровяно-сахарный МПА, сахарный МПА, молоко, на среду Вильсона-Блера.

Пятый день. Проводят идентификацию выделенной культуры из исследуемого материала по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, а также и вирулентным свойствам.

После гибели лабораторного животного от заражения производят бактериологическое исследование трупа. С этой целью из патологического материала готовят мазки, окрашивают их по Граму, проводят посев на МППБ и дифференциальные питательные среды.

При необходимости проводят исследования по обнаружению токсина биологическим методом на лабораторных животных.

Сроки лабораторного исследования на анаэробные инфекции колеблются от 8 до 15 дней.