практические навыки по микробиологии. 1. микроскопические методы исследования цели задачи виды микроскопии и их применение в микробиологической диагностике

• Название: 1. микроскопические методы исследования цели задачи виды микроскопии и их применение в микробиологической диагностике
• Анкор: практические навыки по микробиологии
• Дата: 10.01.2021
• Размер: 1.02 Mb.
• Имя файла: 1-8.docx
• Тип: Задача; #166876
• страница: 1 из 8

1. микроскопические методы исследования цели задачи виды микроскопии и их применение в микробиологической диагностике

Цель и задача микроскопического метода в определение форм, морфологических признаков возбудителей (наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений) а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах.

Виды

Световая микроскопия. Микроскопия в проходящем свете (светлопольная микроскопия). Используется для изучения окрашенных объектов в фиксированных препаратах.

Темнопольная микроскопия – применяется для прижизненного исследования микробов в нативных неокрашенных препаратах. Основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц (эффект Тиндаля). Для темнопольной микроскопии пользуются обычными объективами и специальными темнопольными конденсорами. Однако невозможно увидеть внутреннюю структуру микроорганизмов. Используется для идентификации возбудителя в живом состоянии

Иммерсионная микроскопия – применяют для увеличения разрешающей способности метода световой микроскопии. На объектив наносят иммерсионное масло, имеющее высокий коэффициент преломления, препятствует рассеивания света от объекта исследования. Используется для обнаружения и идентификации возбудителя в окрашенных микропрепаратов.

Фазово-контрастная микроскопия – нативный (неокрашенный , необработанный препарат) препарат, не окрашенный. Дает возможность увидеть прозрачные объекты, за счет усиления различия в оптической плотности. Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе. Выглядят как темный объект на светлом поле или наоборот. Используется для обнаружения и идентификации возбудителя в живых микропрепаратах.

Люминесцентная микроскопия основана на явлении фотолюминесценции. Люминесценция – свечение веществ, возникающее под воздействием внешнего излучения (ультрафиолетового). Используется для обнаружения возбудителя в окрашенных микропрепаратов.

Электронная микроскопия. световые лучи заменяет поток электронов. Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.) Сканирующая электронная микроскопия применяется для изучения поверхности объектов.

Микроскопические методы используются для обнаружения и идентификации возбудителя в исследуемом материале как часть микробиологического исследования.

2. Методы окраски по Бурри-Гинсу: назначение, техника окраски, результат.

Исп. для окраски капсульных бактерий; Основан на том, что капсула не воспринимает красители и ее выявляют негативно-контрастирующим фоном по Бурри.

Техника:

1.На серед. предмет.стекла наносят каплю черной туши и смеш. с каплей культуры капс. бакт. с помощью петли.

2.Краем др. предмет.стекла делаю мазок по типу кровяного=>сушат на возд. и фиксир. в пламени горелки.

3.Окраш. в теч. 5 мин р-ром карболового фуксина,развед. водой 1:3.

4.Промывают водой,высуш.,микроскопир. с иммерсией.

Рез-т: тело бактерии окраш. в красный цвет,неокраш. капсулы контраст. выдел. на темном фоне препарата.

3. Методы окраски по Циль-Нильсену: назначение, техника окраски, результат.

Назначение: для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза и лепры, актиномицитов)

Техника:

1) фиксиров-й мазок покрыв-т полоской бумаги, на нее наносят карболовый фуксин Циля и несколько раз подогрев-т над пламенем горелки для появл-я паров, каждый раз подливая краситель.

2) бумагу сним-т и обесцвечив-т мазок в 5% р-ре Н2SO4 , затем промыв-т водой.

3) на мазок налив-т р-р метиленового синего на 3-5 мин.

4) препарат промыв-т водой, высушив-т, микроскопир-т с иммерсией.

Рез-т:микобактерии окраш-ся в красный цвет; споры – красного цвета.

4. Метод окраски по Нейсерру: назначение, техника, результат.

Назначение: Исп. для выявл. зерен волютина.

Техника:

1.Фиксир. мазок окраш. уксуснокислой синей 1 мин, затем сливают краску.

2.Промывают водой и наливают р-р Люголя на 20-30 сек.

3.Не промывая водой, окрашивают везувином 1-3 мин.

4. Промывают водой, высуш., микроскопир. с иммерсией.

Рез-т: тела бактерий окраш. в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина - в темно-синий, почти черный цвет.

5. Метод окраски по Граму: назначение, техника окраски, результат.

Назначение: разделение микроорганизмов на 2 группы – грам– и грам+

Техника:

1) на фиксиров-й мазок накладыв-т полоску фильтров-й бумаги и налив-т карболовый р-р генцианового фиолетового на 1-2 мин.

2) сним-т бумагу и, не промывая мазок водой, налив-т р-р Люголя на 1 мин

3) обесцвечив-т преп-т в 96%-ном р-ре спирта в теч-е 1-2 мин.

4) промыв-т водой.

5) докрашив-т водным р-ром фуксина в теч-е 1-2 мин.

6) промыв-т водой, высушив-т, микроскопир-т с иммерсией.

Рез-т: грам+ – синего цвета , грам– – красного цвета.

6. Методы обнаружения жгутиков и подвижности бактерий.

1) Окраска жгутиков по Леффлеру.

Техника:

1. Взвесь бактерий переносят в каплю воды, не перемеш. и высушивают.

2. Обрабат. препарат 15-20 минут протравой (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина + смесь из 10 мл 25% водного р-ра танина с 5 мл насыщ. водного р-ра сернокислого железа).

3.Промывают водой и высушивают на воздухе.

4. Докраш. фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании.

5. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.

Рез-т: жгутики набухают, становятся видимыми и прокрашенными в красный цвет.

2)Окраска жгутиков по Морозову.

Техника:

Готовят три реактива:

а)1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл формалина, 100 мл дистиллированной воды;

б) 5 г таннина, 1 мл жидкой карболовой кислоты (фенола), 100 мл дистиллированной воды;

в)5 г кристаллического нитрата серебра (AgNO3), 100 мл дистиллированной воды.

1. Нефиксир. мазок помещ. в стакан с дистил. водой и фиксир. р-ром № 1, одну мин.

2. Препарат вынимают из стакана, промывают водой, протравливают раствором № 2 и нагревают до появления паров, 1 мин.

3. Мазок промывают водой, окраш. р-ром № 3, прогревая его до появления темно-коричневой окраски, 1-2 мин.

Рез-т:жгутики приобретают темный цвет.

3) Исследование подвижности:

а) Метод «раздавленная капля» - на середину предмет.стекла наносят каплю сут. культуры бактерий и накрывают ее предмет. стеклом так, чтобы жидкость не растеклась за его края и в нее не попадали пузырьки воздух.

б) Метод «висячая капля» каплю бактерий наносят на середину покров.стекла, наклад. на него спец. предмет. стекло с углублением, смазанным вокруг вазелином так, чтобы капля находилась в центре лунки, затем препарат осторожно переворачивают.

Рез-т: исслед. в тёмном поле микроскопа или фазовом контрасте на наличие подвижности.

7. Бактериологический метод исследования – цель, этапы.

Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.

Бактериологический метод исследования включает:

1. посев исследуемого материала в питательные среды

2. выделение чистой культуры

3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:

I этап (работа с нативным материалом)

Цель: получение изолированных колоний

1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре

2. Подготовка материала к исследованию

3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний

4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов

II этап

Цель: получение чистой культуры

1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).

2. Микроскопическое изучение изолированных колоний

3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).

4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.

III этап

Цель: идентификация выделенной чистой культуры

1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:

• 
  морфология и тинкториальные свойства
  
• 
  культуральные свойства (характер роста на питательных средах)
  
• 
  биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)
  
• 
  серологические свойства (антигенные)
  
• 
  вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)
  
• 
  патогенность для животных
  
• 
  фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)
  
• 
  чувствительность к антибиотикам
  
• 
  другие индивидуальные свойства
  

IV этап (Заключение)

По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре

Первый этап исследований.Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зонепламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.

Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Таккак материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырас­тает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии,очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изу­чают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет;полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).

Таблица 11. Схема изучения колоний

№	Признак	Возможные характеристики колоний
1.	Форма	Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая
2.	Величина, мм	Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм)
3.	Характер поверхности	Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая
4.	Цвет	Бесцветные, окрашенные
5.	Прозрачность	Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные
6.	Характер краев	Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые
7.	Внутренняя структура	Гомогенная, зернистая, неоднородная
8.	Консистенция	Вязкая, слизистая, крошковидная
9.	Эмульгирование в капле воды	Хорошо, плохо

Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.

Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют неболь­шое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).

Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для это­го из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).

При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые куль­туры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.

Третий этап исследований. 

Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического поло­жения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаим­ного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия куль­тивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием про­межуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).

Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают проб­ку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.

Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут про­бирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.

При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки.

ЗаключениеУчет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.

8. Биохимическая идентификация бактерий: питательные среды, постановка, учет результатов.

Биохимическая идентификация основывается на определении ферментов микроорганизмов. Присутствие ферментов определяют по их способности разлагать соответствующие субстраты, для такой идентификации необходимо 18 – 24 часа. В последнее время определяют непосредственно сами ферменты, для такой идентификации требуется 4 – 6 часов.

Согласно международной биохимической классификации ферментов, в зависимости от катализируемой реакции выделяют 6 основных классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Отдельные представители каждого класса ферментов имеют систематическое название, традиционное (тривиальное) название, а также четырехуровневый числовой код, который отражает класс, подкласс, под-подкласс и серийный номер фермента в под-подклассе. Кроме систематического названия ферменты микроорганизмов имеют традиционные названия, получаемые в зависимости от субстратной специфичности. Традиционно ферменты микроорганизмов классифицируются на сахаролитические, протеолитические, липолитические, окислительно-восстановительные ферменты, а также ферменты-токсины, которые определяют с помощью специальных сред или тестов.

Определение биохимических свойств микроорганизмов

Фермент	Среда для детекции	Положительная реакция
САХАРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
Амилаза	Крахмальный агар (агар с 0,2% крахмала) и раствор Люголя.	При нанесении раствора йода на среду с 18 - 24 часовой культурой микроорганизмов, вокруг колоний с амилазной активностью образуется светлый неокрашенный ореол, в то время как остальная среда приобретает сине-фиолетовый цвет из-за присутствия в ней крахмала.
Карбо-гидразы	Дифференциально-диагностические среды для энтеробактерий (Эндо, Левина, Плоскирева и др.); содержат лактозу, анилиновые красители.	Лактозопозитивные энтеробактерии (Escherichiacoli, Klebsiellaoxytoca, K. pneumonia), образуют ярко окрашенные колонии, лактозонегнативные энтеробактерии (Salmonella, Shigella) – бледно-розовые или бесцветные колоний.
	Полиуглеводные среды (Клиглера, Олькеницкого и др.). Среда Клиглера имеет малиново-красный цвет и содержит: 0,1% глюкозы, 1% лактозы, соли Fe 2+, феноловый красный (индикатор рН).	При разложении глюкозы желтеет столбик среды, при разложении лактозы желтеет скошенная часть среды, при разложении углеводов с образованием CO2 в среде также появляются газовые пузырьки или разрыв столбика; при образовании H2S наблюдается почернение по ходу укола.
	Жидкие или полужидкие моноуглеводные среды Гисса; содержат один из углеводов, индикатор рН (табл. 5); рН среды устанавливают 7,2±0,2. Для выявления газообразования в жидкие среды вносят поплавок.	При разложении углеводов образуются кислые продукты, снижающие рН среды, в результате чего индикатор рН изменяет цвет. Газообразование на жидких средах приводит к накоплению газа в поплавке, в полужидких – появлению разрывов или газовых пузырьков в среде.
Продукция ацетил-метил-карбинола	Выявляют с помощью реакции Фогес-Проскауэра, используют 10% КОН или 20% КОН.	После добавления к культуре равного объёма 10% или 20% КОН и инкубации 4-24 часа при 370С в случае образования ацетилметилкарбинола среда окрашивается в розовый цвет с жёлтым оттенком; в случае образования ацетоина и 2,3-бутиленгликоля окраска не изменяется.
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
Протеазы и пептидазы	5% обезжиренное молоко.	Происходит свёртывание с образованием сгустков казеина и пептонизация с лизис казеина, при которой молоко становится прозрачным. Обе реакции могут происходить последовательно или одновременно.
	Свёрнутая сыворотка.	Происходит разжижение.
	Столбик желатина.	Происходит разжижение (желатину разжижают Proteus vulgaris, Bacillusanthracis).
	Молочный агар в чашках Петри имеет мутно-белый цвет.	Появляются зоны просветления вокруг колоний на фоне мутно-белой среды.
Дезами-назы амино-кислот	Среда с одной из аминокислот и индикатором рН; рН среды 7,2±0,2.	Образуется аммиак, приводящий к защелачиванию среды и изменению цвета индикатора.
Декар-боксилазы	Среда с одной из основных аминокислот (аргинином, лизином, орнитином, гистидином, тирозином, глутамином) и индикатором рН.	При наличии декарбоксилазной активности среда подщелачивается за счёт образования диаминов, вызывая изменение цвета индикатора.
Трипто-фаназа	Мясо-пептонный бульон или среда с аминокислотой триптофаном, а также индикаторная бумажка, смоченная щавелевой кислотой и закреплённая под пробкой над питательной средой.	Образуется индол, который приводит к покраснению бумажки, смоченной щавелевой кислотой.
Десуль-фуразы (цисти-назы)	Среды с цистеином, метионином и качественным реактивом на H2S – солями железа, свинца, висмута.	Образуется H2S, который взаимодействует с Fe2+(Pb2+, Vi2+) с образованием сульфида железа черного цвета, что вызывает почернение среды.
Уреаза	Среда с мочевиной и индикатором рН  феноловым красным, рН среды устанавливают 6,8±0,2.	Образуется аммиак и окраска среды из красно-оранжевой переходит в малиново-лиловую за счёт сдвига рН в щелочную сторону.
ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
Липаза	Желточный агар или среда с твином-80.	Липазы гидролизуют жиры на глицерин и свободные жирные кислоты. Вокруг колоний в проходящем свете на поверхности среды видна радужная пленка (похожа на бензиновую пленку на поверхности воды).
Лецити-наза	Желточный агар (к 300 мл стерильного МПА, расплавленного и охлажденного до 45-500С, добавляют источник лецитина  желток куриного яйца).	Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид, и вокруг колоний появляются опалесцирующие зоны, или «венчики помутнения»; лецитиназа есть у Staphylococcusaureus, клостридий, фузобактерий.
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ (ОВФ)
Оксидаза	Фильтровальная бумага, смоченная свежеприготовленным 1% раствором тетраметилпарафенилен-диамина (реактив на оксидазу).	При нанесении бакпетлей 18-24 часовой культуры на поверхность фильтровальной бумаги в течение 1 мин появляется пурпурно-фиолетовое окрашивание; используют для дифференциации Pseudomonas spр. (оксидазопозитивные) и энтеробактерий (оксидазонегативные).
Каталаза	3% раствор Н2О2; присутствие каталазы определяют у микроорганизмов, выращенных на любой питательной среде, кроме кровяных сред.	При нанесении на колонию перекиси водорода, либо при внесении культуры в каплю перекиси на предметном стекле появляются пузырьки газа; используют для дифференциации Streptococcus spр. (каталазопозитивные) и Staphylococcusspp. (каталазонегативные).
Дегид-разы	Сахарный полужидкий агар (донор водорода) с 1% метиленовым синим (акцептор водорода).	Дегидразы способны восстанавливать некоторые органические красители, поэтому метиленовый синий обесцвечивается. Используют для определения бактериальной обсеменённости молока: подкрасив молоко метиленовой синькой, определяют время его обесцвечивания. Чем оно меньше, тем более обсеменено молоко. Качественное молоко долго остаётся синим.
Перокси-даза	Используют бензидиновый тест: на предметное стекло наносят 4-6 капель суточной бактериальной культуры добавляют по 1-3 капли 2 % раствора метилпарааминофенол сульфата и 3% раствора Н2О2.	В течение 5 – 10 мин бесцветная среда приобретает розовую или вишнёво-красную окраску. Положительная реакция характерна для Staphylococcus spp., отрицательная - Pseudomonas spp., Escherichia spp.
ФЕМЕНТЫ-ТОКСИНЫ
Гемо-лизины	510% кровяной агар.	-гемолизины приводят к неполному гемолизу с образованием вокруг колоний зоны неполного просветления среды, которая в течение 2-5 суток приобретает зеленовато-бурый оттенок. -гемолизины вызывают полный гемолиз с образованием прозрачной зоны вокруг колоний. -гемолизины не дают видимого глазом гемолиза.
О-стрепто-лизин	В пробирки с двукратными разведениями -гемолитических стрептококков добавляют равный объем 5% эритроцитов кролика, инкубируют при 370С 1 час; параллельно ставят контроль из взвеси эритроцитов в питательном бульоне.	В положительных случаях происходит гемолиз (лаковая кровь), в отрицательных случаях образуется осадок из эритроцитов. Определяют титр О-стрептолизина - наибольшее разведение микробной культуры при котором наблюдается гемолиз.
Плазмо-коагулаза	Стерильная цитратная плазма крови, разлитая по 0,4 мл в пробирки.	После внесения суточной агаровой культуры и инкубации посевов 25 часов при 370С происходит свёртывание плазмы и утрата ею текучести.
Гиалуро-нидаза	Побирка с гиалуроновой кислотой и уксусная кислота; при добавлении к гиалуроновой кислоте уксусной кислоты образуется сгусток муцина.	Если тест-культура образует гиалуронидазу, то после 15 мин инкубации культуры бактерий при 370С в пробирке с гиалуроновой кислотой и добавления 23 капель уксусной кислоты образуется сгусток муцина.
Нуклеазы	МПА с ДНК, среда опалесцирует (полупрозрачна).	Через 1824 часа культивирования на среде после нанесения на ее поверхность 0,1% H2SO4 из-за деполимеризации ДНК и РНК вокруг колоний образуется прозрачный ореол  «венчик просветления».
Фибри- нолизин	Сгустки фибрина.	Растворение сгустков фибрина.
Цито-токсины	Культура эпителиальных клеток или др. и токсин, выделенный путем фильтрования культуральной жидкости с использованием бактериальных фильтров.	При культивировании культуры клеток с безмикробным фильтратом токсина культура клеток утрачивает типичную тканевую морфологию: округляется, ядра пикнотизируются.
Летучие жирные кислоты	Газо-жидкостная хроматография кислото-эфирного экстракта ЛЖК из биологического материала или культуральной жидкости, содержащей анаэробы.	На хроматограмме появляются пики в зависимости от массы и полярности вещества: чем легче вещество, тем раньше появляется пик на хроматограмме, поэтому ЛЖК выходят в следующей последовательности: уксусная, пропионовая, масляная, валериановая, капроновая (рис. 25). Изомасляная, изовалериановая, изокапроновая кислоты выходят раньше соответствующей кислоты.

В последние годы в бактериологических лабораториях применяются одноразовые коммерческие тест-системы для биохимической идентификации. Они представляют собой пластиковые планшеты с лунками, заполненными дегидратированными субстратами с индикатором рН.

Схема идентификации с использованием таких тест-систем включает следующие этапы:

1) выделение чистой культуры или изолированных колоний на плотной питательной среде;

2) приготовление бактериальной суспензии с определенной концентрацией микроорганизмов, которую определяют путем сравнения со стандартами мутности;

3) внесение суспензии микроорганизмов в лунки тест-системы;

4) инкубация в термостате от 4 до 24 часов (длительность зависит от тест-системы) при 370С;

5) учёт результатов, который может быть:

а) визуальным по изменению цвета индикатора;

б) автоматическим с использованием микробиологического анализатора.

6) анализ результатов с использованием компьютерного банка данных, включающего биохимические профили разных видов микроорганизмов. Результаты ферментации учитываются по принципу +/- и вносятся в референс-таблицу, после чего происходит сравнение с компьютерным банком данных. Идентифицируемый микроорганизм относят к тому виду, с которым он проявляет наибольшее сходство и указывают степень сходства (в %). Хорошей идентификацией считается идентификация с 95% (и более) совпадением признаков.

9.Питательные среды, их классификация. Требования

Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Классификация питательных сред по составу:

1. Простые среды (МПБ, МПА, желатин, пептонная вода). Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.

2. Сложные среды готовятся на основе простых с определенными добавками (углеводы, кровь, желчь, яйца, сыворотка, молоко, соли, факторы роста и т.п.)

Классификация питательных сред по исходным компонентам:

1. Естественные питательные среды — это натуральный продукт животного или растительного происхождения.

Могут быть:

- Растительные (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т.п.).

- Животные (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко, животные ткани, желчь, сыворотка крови и т.п.).

- Смешанные (МПА, среда Левенштейна - Йенсена и т.п.).

2. Искусственные среды содержат переработанные естественные продукты (мясную воду, перевар), вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) и различные добавки.

3. Синтетические среды (известного химического состава) состоят из химически чистых соединений в точно установленных концентрациях (с добавлением углеводов, солей, аминокислот, витаминов и т.п.). На основе этих сред, добавляя к ним естественные или искусственные среды, получают полусинтетические среды.

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем добавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полужидкие — 0,3— 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки особого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80—86°С, затвердевает при температуре около 40°С и в застывшем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10—15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными.

По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференциально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бактерий.

Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или определенной группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона — в щелочной среде и т. д.

Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для разграничения отдельных видов (или групп) микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.

Требования, предъявляемые к питательным средам.

Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые для размножения микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме; иметь оптимальные влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по возможности прозрачной. Каждую питательную среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава.