Биотехнология как межотраслевая область научнотехнического прогресса и раздел практических знаний, этапы ее развития
 Скачать 334.5 Kb.
|
|
Области применения достижении биотехнологии. Биотехнологическое использование микроорганизмов условно можно разбить на несколько основных групп: получение живой или инактивированной микробной биомассы (производство пекарских, винных, кормовых дрожжей; вакцин, белково-витаминных концентратов, средств защиты растений, заквасок для получения кисломолочных продуктов и силосования кормов, почвоудобрительных препаратов и т.д.); получение продуктов метаболизма микроорганизмов (антибиотики, гормоны, аминокислоты, витамины, органические кислоты и т.д.); получение ферментов микробного происхождения; получение рекомбинантных продуктов; биотрансформация веществ; утилизация неприродных соединений Биотехнология включает многие традиционные процессы пивоварение, хлебопечение, изготовление вина, производство сыра, пряных соусов, различные способы утилизации отходов. Иммунная биотехнология, с помощью которой распознают и выделяют из смесей одиночные клетки, может применяться не только непосредственно в медицине для диагностики и лечения, но и в научных исследованиях, в фармакалогической, пищевой и других отраслях промышленности, для получения препаратов, синтезируемых клетками защитной системы организма. Протоинженерия – технология изменения свойств природных белков на генетическом уровне, получение новых белков (напр. Новых стимуляторов роста растений, инсектицидов, активных и устойчивых ферментов, высококачественных пищевых продуктов, биосенсоров и биоэлементов, медицинских приборов). Биоэлектроника – область биотехнологии. Использование биосенсоров революционирует методы измерения и контроля в различных отраслях промышленности, медицине, научных исследования. Биотехнология внедряется в добывающую промышленность и это связано с переходом от тяжелой индустрии к высоким технологиям. Применение биотехнологии металлов перспективно для извлечения из руд платины и других драгоценных и стратегически важных металлов, а биотехнологических методов – для увеличения извлечения нефти из скважин, удаления серы из угля, метана из шахт. В настоящее время достижения биотехнологии перспективны в следующих отраслях: В промышленности (пищевая, фармацевтическая, химическая, нефтегазовая) – использование биосинтеза и биотрансформации новых веществ на основе сконструированных методами генной инженерии штаммов бактерий и дрожжей с заданными свойствами на основе микробиологического синтеза. В экологии – повышение эффективности экологизированной защиты растений, разработка экологически безопасных технологий очистки сточных вод, утилизация отходов агропромышленного комплекса, конструирование экосистем. В энергетике – применение новых источников биоэнергии, полученных на основе микробиологического синтеза и моделированных фотосинтетических процессов, биоконверсии биомассы в биогаз В сельском хозяйстве – разработка в области растениеводства трансгенных агрокультур, биологических средств защиты растений, бактериальных удобрений, микробиологических методов рекультивации почв, в области животноводства – создание эффективных кормовых препаратов из растительной, микробной биомассы и отходов сельского хозяйства, репродукции животных на основе эмбриогенетических методов. В медицине – разработка медицинских биопрепаратов, моноклонильных антител, диагностикумов, вакцин, развитие иммунобиотехнологии в направлении повышения чувствительности и специфичности иммуноанализа заболеваний инфекционной и неинфекционной природы. Микроорганизмы (бактерии и высшие протисты) - основные объекты биотехнологии (+конспект) В качестве объектов биотехнологии могут выступать: клетки микроорганизмов, животных и растений, трансгенные животные и растения, а также многокомпонентные ферментные системы клеток и отдельные ферменты. Преимущества использования микроорганизмов: 1) обладают огромным генетическим разнообразием, позволяющим им осуществлять: а) практически неограниченную биосинтетическую деятельность; б) разложение (деградацию) большого количества природных и неприродных соединений. 2) отличаются быстрым ростом, скорость которого намного превышает скорость роста высших организмов (растений и животных). Это позволяет за короткий промежуток времени осуществить синтез больших количеств требуемого продукта в строго контролируемых условиях. Микроорганизмы можно выращивать на различных питательных средах: на газах, нефти, отходах угольной, химической, пищевой, винно-водочной, деревообрабатывающей промышленности. • В настоящее время относительно хорошо охарактеризовано (или известно) более 100 тысяч различных видов микроорганизмов. • Это в первую очередь прокариоты (бактерии, актиномицеты, риккетсии, цианобактерии) и часть эукариот (дрожжи, нитчатые грибы, некоторые простейшие и водоросли). • Важной проблемой является правильный выбор организма, который способен обеспечить получение требуемого биотехнологического продукта. Основой большинства современных биотехнологических производств является микробный синтез, т. е. синтез разнообразных БАВ с помощью микроорганизмов. Независимо от природы объекта, первичным этапом разработки любого биотехнологического процесса является получение чистых культур организмов (если это микробы), клеток или тканей (если это более сложные организмы - растения или животные). Многие этапы дальнейших манипуляций с последними (т. е. с клетками растений или животных) являются принципами и методами, используемыми в микробиологических производствах. И культуры микробных клеток, и культуры тканей растений и животных с методической точки зрения практически не отличаются от культур микроорганизмов. Мир микроорганизмов крайне разнообразен. В н. время известно более 100 тысяч различных их видов. Это прокариоты (бактерии, актиномицеты, риккетсии, цианобактерии) и часть эукариот (дрожжи, нитчатые грибы, некоторые простейшие и водоросли). При большом разнообразии микроорганизмов важной проблемой является правильный выбор того организма, который способен обеспечить получение требуемого продукта, т. е. служить промышленным целям. Микроорганизмы: 1)Промышленные: кишечная палочка (Е. coli), сенная палочка {Вас. sub-tilis) и пекарские дрожжи (S. cerevisiae). Обычно явл-ся сверхпродуцентами. Для получения сверхпродуцентов проводят генетико-селекционную работу, генно-инженерные подходы( внедрение генов челов. В бактерию: гены интерферонов,инсулина и т.д). ПШ д.быть запатентованы. 2)Базовые- используется в ограниченном числе, классифицируются как GRAS ("generally recognized as safe" обычно считаются безопасными)- бактерии Bacillussubtilis, Bacillusamylolique-faciens, др. виды бацилл и лактобацилл, виды Streptomyces, грибы Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus, дрожжи Saccharomyces и др. GRAS-микроорганизмы непатогенные, нетоксичные и в основном не образуют антибиотики, поэтому при разработке нового биотехнологического процесса следует ориентироваться на данные микроорганизмы,. 3) Модельные - служат модельными объектами при изучении фундаментальных жизненных процессов - бациллы (продуценты протеолитических ферментов).Есть каталоги модельных микр. Главным критерием при выборе биотехнологического объекта является способность синтезировать целевой продукт. микроорганизмы должны (требования): • обладать высокой скоростью роста; • утилизировать необходимые для их жизнедеятельности дешевые субстраты; • быть резистентными к посторонней микрофлоре, т. е. обладать высокой конкурентоспособностью. (требования):способность к росту на дешевых субстратах, выс.экономич.коэф-т, миним-е образов-е побочных прод-в(токсич-х метаболитов, аллергенов) Все вышеперечисленное обеспечивает значительное снижение затрат на производство целевого продукта. Ниже приводятся примеры, имеющие своей целью проиллюстрировать ранее сказанное. 1. Одноклеточные организмы характеризуются более высокими скоростями роста и синтетических процессов, 2. Особое внимание как объекты биотехнологических разработок представляют фотосинтезирующие микроорганизмы, использующие в своей жизнедеятельности энергию солнечного света. 3. термофильные микроорганизмы, растущие при 60-80 °С. Это их свойство является практически непреодолимым препятствием для развития посторонней микрофлоры Преимущества микроорганизмов перед другими объектами в решении современных биотехнологических задач. Небольшие размеры Вездесущны Разнообразные типы метаболизма Фототрофы Занимают небольшой объём(в 1 мл до 1 млрд. особей) Высокая скорость деления, быстрый рост Способны жить в различных условиях. Фотосинтезирующие организмы перспективны как продуценты аммиака,водорода,белка. Термофильные микроорганизмы,растущие при 60-80 град.,это является надёжной защитой при загрязнении. Ферменты,синтезируемые термофилами ,характеризуются повышенной устойчивостью к нагреванию,но при этом они малоактивны при обычных температурах. 7. Принципы подбора биотехнологических объектов: модельные и базовые микроорганизмы, штаммы микроорганизмов, использующиеся в биотехнологии. Штамм-продуцент должен характеризоваться следующими свойствами: способностью расти в чистой культуре и генетической стабильностью; отсутствием патогенности и токсичности; высокой скоростью роста при массовом культивировании и способностью синтезировать продукт в большом количестве и за короткий промежуток времени (до 3 суток); устойчивостью к контаминации (например, за счет изменения физико-химических условий среды, способности к росту при повышенных температурах или к синтезу антибиотиков); способности расти на простых и дешевых питательных средах. Главным звеном биотехнологического процесса, определяющим всю его сущность, является биологический объект, способный осуществлять определенную модификацию исходного сырья и образовывать тот или иной необходимый продукт. В качестве таких объектов биотехнологии могут выступать клетки микроорганизмов, животных и растений, трансгенные животные и растения, а также многокомпонентные ферментные системы клеток и отдельные ферменты. Основой большинства современных биотехнологических производств до сих пор все еще является микробный синтез, т. е. синтез разнообразных биологически активных веществ с помощью микроорганизмов. К сожалению, объекты растительного и животного происхождения в силу ряда причин еще не нашли столь широкого применения. Мир микроорганизмов крайне разнообразен. В настоящее время относительно хорошо охарактеризовано (или известно) более 100 тысяч различных их видов. Это в первую очередь прокариоты (бактерии, актиномицеты, риккетсии, цианобактерии) и часть эукариот (дрожжи, нитчатые грибы, некоторые простейшие и водоросли). При столь большом разнообразии микроорганизмов весьма важной, а зачастую и сложной, проблемой является правильный выбор именно того организма, который способен обеспечить получение требуемого продукта, т. е. служить промышленным целям. Разделение микроорганизмов на промышленные и непромышленные для лиц, далеких от микробиологии, молекулярной биологии и молекулярной генетики, кажется достаточно определенным: те микроорганизмы, которые используются в промышленном производстве – промышленные, а те, которые не используются, – непромышленные.Однако для тех, кто близко соприкасается с вышеперечисленными отраслями биологических знаний, граница проходит между немногочисленной, но глубоко изученной группой микроорганизмов, служащих модельными объектами при исследованиях фундаментальных жизненных процессов, и всеми остальными микроорганизмами, которые, как правило, генетиками, молекулярными биологами и генными инженерами не изучались совсем или изучались в очень ограниченной степени. К числу первых относятся кишечная палочка (E. coli), сенная палочка (Bac. subtilis) и пекарские дрожжи (S. cerevisiae). Во многих биотехнологических процессах используется ограниченное число микроорганизмов, которые классифицируются как GRAS («generally recognized as safe» обычно считаются безопасными). К таким микроорганизмам относят бактерии Bacillussubtilis, Bacillusamyloliquefaciens, другие виды бацилл и лактобацилл, виды Streptomyces. Сюда также относят виды грибов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus и дрожжей Saccharomyces и др. GRAS-микроорганизмы непатогенные, нетоксичные и в основном не образуют антибиотики, поэтому при разработке нового биотехнологического процесса следует ориентироваться на данные микроорганизмы, как базовые объекты биотехнологии.Микробиологическая промышленность сегодня использует тысячи штаммов из сотен видов микроорганизмов, которые первично были выделены из природных источников на основании их полезных свойств, а затем (в большинстве своем) улучшены с помощью различных методов. В связи с расширением производства и ассортимента выпускаемой продукции в микробиологическую промышленность вовлекаются все новые и новые представители мира микробов. Следует отдавать себе отчет, что в обозримом будущем ни один из них не будет изучен в той же степени, как E.coli и Bac.subtilis. И причина этого очень простая – колоссальная трудоемкость и высокая стоимость подобного рода исследований. Следовательно, возникает проблема разработки стратегии и тактики исследований, которые обусловили бы с разумной затратой труда извлечь из потенциала новых микроорганизмов все наиболее ценное при создании промышленно важных штаммов-продуцентов, пригодных к использованию в биотехнологических процессах. Классический подход заключается в выделении нужного микроорганизма из природных условий. Из естественных мест обитания предполагаемого продуцента отбирают образцы материала (берут пробы материала) и производят посев в элективную среду, обеспечивающую преимущественное развитие интересующего микроорганизма, т. е. получают так называемые накопительные культуры. Следующим этапом является выделение чистой культуры с дальнейшим дифференциально-диагностическим изучением изолированного микроорганизма и, в случае необходимости, ориентировочным определением его продукционной способности. Существует и другой путь подбора микроорганизмов-продуцентов – это выбор нужного вида из имеющихся коллекций хорошо изученных и досконально охарактеризованных микроорганизмов. При этом, естественно, устраняется необходимость выполнения ряда трудоемких операций. Главным критерием при выборе биотехнологического объекта (в нашем случае микроорганизма-продуцента) является способность синтезировать целевой продукт. Однако помимо этого, в технологии самого процесса могут закладываться дополнительные требования, которые порой бывают очень и очень важными, чтобы не сказать решающими. В общих словах микроорганизмы должны: • обладать высокой скоростью роста; • утилизировать необходимые для их жизнедеятельности дешевые субстраты; • быть резистентными к посторонней микрофлоре, т. е. обладать высокой конкурентоспособностью. Все вышеперечисленное обеспечивает значительное снижение затрат на производство целевого продукта. Конечно, в каждом конкретном случае ведущим является какой-то один из этих критериев, поскольку в природе устроено так, что во всем получить выигрыш не удается никогда. И это правило необходимо постоянно иметь в виду. Ниже приводятся примеры, имеющие своей целью проиллюстрировать ранее сказанное. 1. Одноклеточные организмы, как правило, характеризуются более высокими скоростями роста и синтетических процессов, чем высшие организмы. Тем не менее это присуще не всем микроорганизмам. Существуют такие из них (например, олиготрофные), которые растут крайне медленно, однако онипредставляют известный интерес, поскольку способны продуцировать различные очень ценные вещества. 2. Особое внимание как объекты биотехнологических разработок представляют фотосинтезирующие микроорганизмы, использующие в своей жизнедеятельности энергию солнечного света. Часть из них (цианобактерии и фотосинтезирующие эукариоты) в качестве источника углерода утилизируют СО2, а некоторые представители цианобактерий, ко всему сказанному, обладают способностью усваивать атмосферный азот (т. е. являются крайне неприхотливыми к питательным веществам). Фотосинтезирующие микроорганизмы перспективны как продуценты аммиака, водорода, белка и ряда органических соединений. Однако пpoгpecca в их использовании вследствие ограниченности фундаментальных знаний об их генетической организации и молекулярно-биологических механизмах жизнедеятельности, по всей видимости, следует ожидать не в скором будущем. 3. Определенное внимание уделяется таким объектам биотехнологии, как термофильные микроорганизмы, растущие при 60–80° С. Это их свойство является практически непреодолимым препятствием для развития посторонней микрофлоры при относительно не стерильном культивировании, т. е. является надежной защитой от загрязнений. Среди термофилов обнаружены продуценты спиртов, аминокислот, ферментов, молекулярного водорода. Кроме того, скорость их роста и метаболическая активность в 1,5–2 раза выше, чем у мезофилов.Ферменты, синтезируемые термофилами, характеризуются повышенной устойчивостью к нагреванию, некоторым окислителям, детергентам, органическим растворителям и другим неблагоприятным факторам. В то же время они мало активны при обычных температурах. Так, протеазы одного из представителей термофильных микроорганизмов при 200 С в 100 раз менее активны, чем при 750 С. Последнее является очень важным свойством для некоторых промышленных производств. Например, широкое применение в генетической инженерии нашел фермент Taq-полимераза из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Выделение и селекция микроорганизмов, продуцентов биологически активных веществ. Селекция продуцентов - сознательное конструирование геномов на каждом этапе отбора нужного продуцента. А генеральным путем селекции является сознательное конструирование геномов на каждом этапе отбора нужного продуцента. Селекции спонтанно возникающих измененных вариантов, характеризующихся нужными полезными признаками. При таких методах обычно используется ступенчатая селекция: на каждом этапе отбора из популяции микроорганизмов отбираются наиболее активные варианты (спонтанные мутанты), из которых на следующем этапе отбирают новые, более эффективные штаммы и т. д. Недостатки: низкая частота возникновения мутантов (т.е. ограниченность данного метода) Селекции наиболее эффективных продуцентов при индуцированном мутагенезе. В качестве мутагенных воздействий применяются УФ, рентгеновское и гамма-излучения, определенные химические вещества и др. Недостатки: трудоемкость и отсутствие сведений о характере изменений, поскольку экспериментатор ведет отбор по конечному результату. Например, устойчивость организма к ионам тяжелых металлов может быть связана с подавлением системы поглощения данных катионов бактериальной клеткой, активацией процесса удаления катионов из клетки или перестройкой системы (систем), которая подвергается ингибирующему действию катиона в клетке. Естественно, знание механизмов повышения устойчивости позволит вести направленное воздействие с целью получения конечного результата за более короткое время, а также селектировать варианты, лучше подходящие к конкретным условиям производства. Используют так же генетические методы и методы молекулярной биологии. Таким образом, тенденцией сегодняшнего дня является сознательное конструирование штаммов микроорганизмов с заданными свойствами на основе фундаментальных знаний о генетической организации и молекулярно-биологических механизмах осуществления основных функций организма. Пассаж ‒ это пересев культуры микроорганизма на новую по составу среду. Обычно термин употребляется с числовым значением (1-й пассаж, 2-й пассаж и т.д.), что указывает на способность организма адаптироваться к данной среде. При полной адаптации число пересевов не ограничено. При отсутствии адаптации рост возможен при первом пассаже, например за счет компонентов среды инокулята, но при последующих пассажах рост культуры будет сильно замедляться или совсем прекратится. Принципиальные подходы к улучшению штаммов промышленных микроорганизмов (селекция – виды отбора, мутагенез, направленное конструирование). Существуют следующие виды отбора: Отбор по фенотипу ‒ самый простой способ, когда колонии или мицелиальные ковры отбирают по внешним признакам (цвет, текстура, вертикальный профиль, скорость радиального роста). Под фенотипом здесь понимают только внешнее строение, цвет, особенности споруляции и роста, но не наличие определенных метаболитов. Направленный отбор ‒ форма отбора, в результате которого происходит смещение среднепопуляционного значения признака в сторону, определяемую селекционером. Дифференциальный отбор ‒ отбор по количественному признаку, направленный на увеличение разницы между средней для вида микроорганизма величиной и средней для отобранных штаммов. Периодический отбор ‒ отбор из популяции микроорганизмов периодически появляющихся быстрорастущих мутантов, в результате чего исходная популяция замещается популяцией с новым генотипом, обладающей более быстрым ростом. Линейный отбор ‒ направленный отбор в ряду поколений по нескольким направлениям, приводящий к созданию линий, в которых отбор продолжается с учетом межлинейных сравнений. Преимущество получают микроорганизмы с определенным уклонением от среднего значения по сравнению с популяцией исходного типа. Корреляционный отбор ‒ изменение признаков, не подвергающихся прямому отбору, в результате их корреляции с отбираемым признаком. Тандемный отбор ‒ улучшение популяции путем отбора поочередно по одному, а потом по другому признаку; оба признака экономически значимы. Производится в ряду поколений. При отрицательной корреляции между признаками эффективность отбора снижается Скринингом называют выборочное выделение штаммов, синтезирующих определенный метаболит, несколько родственных метаболитов, или обладающих определенной биологической активностью, из крупной выборки из одного или нескольких природных источников. Выборка может включать как представителей одного вида, так и многочисленные виды бактерий или грибов, составляющих целые сообщества. Скринингом в узком смысле называют выделение мутанта или рекомбинанта, обладающего нужным фенотипом или генотипом, из многочисленной популяции микроогранизмов, например, после обработки мутагеном. Сам по себе искусственный отбор не является источником изменчивости, поэтому прибегают к процедуре мутагенеза. Индуцированный (искусственный, экспериментальный) мутагенез применяют для повышения генетического разнообразия в популяции вида. Биологическая основа мутагенеза ‒ это внесение ошибок в матричный процесс репликации ДНК, в результате которого ДНК-фразы изменяются по отношению к родительским последовательностям, и в случае нелетальных мутаций могут привести к изменению фенотипа микроорганизмов. Промышленные энзимы, продуцируемые микроорганизмами. Все обменные процессы в бактериальной клетке идут с участием ферментов (энзимов). Ферменты выполняют функцию биокатализаторов. Они представляют собой простые или сложные белки. Принято различать экзоферменты и эндоферменты. Экзоферменты выделяются микробной клеткой во внешнюю среду. Часть экзоферментов связана с питанием бактерий, так как они расщепляют питательные вещества до такой формы, которая способна усваиваться микробной клеткой. Эндоферменты участвуют в разложении питательных веществ внутри клетки и в превращении их в составные части клетки. Одни ферменты синтезируются бактериальной клеткой постоянно (конститутивные ферменты), другие ферменты синтезируются только при контакте с определенным субстратом (индуцибельные ферменты). В частности, конститутивными ферментами являются ферменты гликолиза – ферменты окисления глюкозы (гексокиназа, глюкозоизомераза, альдолаза и др.). Индуцибельными ферментами являются бета-галактозидаза (катализирует расщепление лактозы на глюкозу и галактозу) и бета-лактамаза (расщепляет бета-лактамные антибиотики). Все ферменты подразделяются на шесть классов: - оксидоредуктазы; - трансферазы; - гидролазы; - лиазы; - изомеразы; - лигазы (синтетазы). ксидоредуктазы – это ферменты, которые катализируют окислительно-осстановительные реакции и встречаются во всех живых клетках. Их основная функция – обеспечение организма энергией в доступной для использования форме. Трансферазы – ферменты, которые катализируют перенос отдельных радикалов (РО3, Н2, СН3), частей молекул или целых атомных группировок от одних соединений к другим. Гидролазы – ферменты, которые катализируют реакции расщепления и синтеза белков, жиров и углеводов с участием воды. Увеличение энзиматической активности возможно при: Воздействии на молекулу уже синтезированного белка-энзима Увеличении уровня синтеза молекул энзима Генетическая инженерия — целенаправленное создание новых форм биологически активных ДНК и генетически новые формы клеток с помощью искусственных приёмов переноса фрагментов ДНК, целых генов или их частей. Методы генетической инженерии позволяют заменить регуляторные области катаболических оперонов на более эфективные промотеры, повышающие прдукции клетками биоактивных веществ и обеспечивающие новые возможности контроля активности генов. Всего выделяют 4 группы метода генной инженерии: - методы получения рекомбинантных ДНК и РНК; - методы выделения генов из организмов; - методы создания искусственных генетических программ - методы введения трансгенов в микроорганизмы; Различия микроорганизмов по типу питания и источнику энергии. Разнообразные вещества, в которых нуждаются микроорганизмы и которые потребляются для синтеза основных органических веществ клетки, роста, размножения и для получения энергии называются питательными веществами, а среда, содержащая питательные вещества, называется питательной средой. Потребности микроорганизмов в питательных веществах разнообразны, но независимо от потребностей в питательной среде должны содержаться все необходимые элементы, которые имеются в клетках микроорганизмов, причем соотношение органогенных элементов должно примерно соответствовать этому соотношению в клетке. Источниками водорода и кислорода являются вода, молекулярный водород и кислород, а также химические вещества, содержащие эти элементы. Источниками макроэлементов являются минеральные соли (калий фосфорнокислый, магний сернокислый, железо хлорное и др.). Источниками углерода и азота могут быть как органические, так и неорганические соединения. В соответствии с принятой классификацией микроорганизмов по типу питания их разделяют на группы в зависимости источника углерода, источника энергии и источника электронов (природы окисляемого субстрата) (рис.6.2.). В зависимости от источника углерода микроорганизмы делятся на: автотрофы (сами себя питающие), которые используют углерод из неорганических соединений (углекислого газа и карбонатов); гетеротрофы (питаются за счет других) – используют углерод из органических соединений. В зависимости от источника энергии различают: фототрофы – микроорганизмы, которые в качестве источника энергии используют энергию солнечного света; хемотрофы – энергетическим материалом для этих микроорганизмов являются разнообразные органические и неорганические вещества. В зависимости от источника электронов (природы окисляемого субстрата) микроорганизмы делятся на: литотрофы – окисляют неорганические вещества и за счет этого получают энергию; органотрофы – получают энергию путем окисления органических веществ. Среди микроорганизмов чаще всего встречаются микроорганизмы, имеющие следующие типы питания: Фотолитоавтротрофия – тип питания, характерный для микробов, использующих энергию света и энергию окисления неорганических соединений для синтеза веществ клетки из диоксида углерода. Фотоорганогетеротрофия – такой тип питания микроорганизмов, когда для получения энергии, необходимой для синтеза веществ клетки из диоксида углерода, помимо световой энергии, используется энергия окисления органических соединений.  Хемолитоавтотрофия – тип питания, при котором микроорганизмы получают энергию за счет окисления неорганических соединений, а источником углерода являются неорганические соединения. Хемоорганогетеротрофия – тип питания микроорганизмов, получающих энергию и углерод из органических соединений. Микроорганизмы, встречающиеся в пищевых продуктах, имеют именно такой тип питания. Среди хемоорганогетеротрофов различают сапрофиты – такие микроорганизмы, которые питаются за счет органических веществ из различных субстратов растительного и животного происхождения (из отмерших клеток и тканей) и паразиты – используют органические вещества из живых клеток. Кроме углерода, важнейшим элементом питательной среды является азот. Автотрофы обычно используют азот из минеральных соединений, а гетеротрофы, кроме неорганических соединений азота, используют аммонийные соли органических кислот, аминокислоты, пептоны и другие соединения. Некоторые гетеротрофы усваивают атмосферный азот (азотфиксаторы). Существуют микроорганизмы, которые сами не способны синтезировать то или иное органическое вещество (например, аминокислоты, витамины). Такие микроорганизмы называют ауксотрофными по данному веществу. Вещества, которые добавляют для ускорения роста и обменных процессов называют ростовыми веществами. Брожение ? 12. Клетки животных и растений как объекты биотехнологии. Конспект, реферат 13. Использование клеточных культур в биотехнологических процессах. Особое направление применения клеточных культур и клеточных технологий - тканевая инженерия, связанная с разработкой биоискусственных органов и тканей. В настоящее время на базе накопленных фундаментальных знаний освоены, включая промышленные масштабы, технологии ведения клеточных культур различного происхождения (растительных клеток, клеток насекомых и млекопитающих). Растительные клетки и культура растительных тканей позволяют регенерировать целое растение из протопластов и клеток. Особенностью клеточных культур растений является их способность к тотипотенции, т.е. в определенной среде и определенных условиях можно регенерировать целое растение из одной клетки. Эта техника обеспечивает за сравнительно короткий срок получение в контролируемых условиях многочисленных популяций клеток и дает возможность идентифицировать линии растений с повышенной биологической продуктивностью. Клеточная инженерия растений базируется на использовании культуры изолированных клеток, тканей, протопластов. Существует несколько направлений использования этих технологий в растениеводстве Первое связано со способностью изолированных растительных клеток продуцировать в культуре ценные биологически активные соединения, в том числе женьшеня или идиолитов, эфирных масел, алкалоидов, глюкозидов и др. Второе направление - это использование культуры изолированных тканей для клонального размножения растений и оздоровления посадочного материала. Т ретье направление - это применение изолированных клеток в селекции растений. Культивируемые на искусственных средах растительные клетки характеризуются большой неоднородностью; при этом возможен отбор клеток, устойчивых к тем или иным неблагоприятным факторам - засухе, низкой температуре, фитопатогенам и пр. Культуры растительных клеток используют для биотрансформации химических соединений и для эффективного синтеза биологически активных соединений de novo. В культуре клеток сохраняется способность продуцировать биологически активные соединения, свойственные исходному целому растению, что позволяет организовать условия, обеспечивающие синтез ценных продуктов, ранее не обнаруженных в исходных интактных растениях. Например, в культурах растительных клеток стало возможным получать такие ценные соединения, как перицин, перикалин, хинокиол, ферригинол, акуаммалин и др. Реализованы крупномасштабные культивационные системы растительных клеток для получения различных ценных веществ - ментола, женьшеня, убихинона-10, бетанина, камптотецина (антиканцероген), полипептидов - ингибиторов фитовирусов, агар-агара и др. Например, эффективный и дорогостоящий цитостатический препарат паклитаксель, традиционно получаемый из коры Тиса среднеземноморского (8 т исходного сырья обеспечивают получение 1 кг препарата), в настоящее время с большей эффективностью получают в культуре клеток. Еще более эффективными оказались процессы с использованием иммобилизованных растительных клеток. Такие биологические системы более устойчивы к механическим повреждениям, при этом фаза роста клеток совпадает с фазой образования продукта; клетки легко переносятся в новую среду или иные культивационные условия. После установления способности апикальной меристемы (небольшой участок недифференцированных клеток на кончике стебля) к росту с образованием целого растения, эта техника стала применяться для клонирования линий растений. Культура растительных тканей, аналогично культуре клеток, позволяет достаточно быстро получать здоровые растительные клоны и на этой основе - перспективный посадочный материал практически в неограниченных масштабах. Культуры клеток насекомых дают возможность получать биологические агенты новых типов для борьбы с насекомыми-вредителями без негативного влияния на жизнеспособность полезных видов насекомых, а также не накапливающихся в окружающей среде. Достоинства биологических методов борьбы с вредителями известны уже давно, это бактериальные, грибные и вирусные препараты, получение которых требует специализированной техники и условий. Особенно это характерно для препаратов вирусной группы, производство которых основано на массовом размножении насекомого-хозяина на искусственных средах. Вследствие достаточной трудоемкости производства эти препараты до недавнего времени не находили массового применения. Использование Культуры клеток животных широко используют в качестве тест-объектов для оценки безопасности и эффективности новых лекарственных препаратов. Кроме этого, клетки млекопитающих пригодны для синтеза лекарственных веществ, особенно некоторых животных белков, слишком сложных для того, чтобы синтезировать их с помощью генетически модифицированных микроорганизмов, а также моноклональных антител и вакцин. Например, компанией Sanofi Pasteur (США) по заказу Министерства здравоохранения и социальных услуг США разрабатываются методы культивирования клеток млекопитающих с целью эффективного синтеза вакцин против гриппа. Особое направление применения клеточных культу, в особенности стволовых клеток, и технологий - терапия и реконструктивная хирургия поврежденных органов и тканей. Перечень болезней, лечение которых становится возможным благодаря использованию клеточной терапии и трансплантологии, быстро пополняется. Наиболее продвинутым в настоящее время является применение клеточных технологий в кардиологии для лечения инфаркта миокарда, восстановления кровотока в ишемизированных органах и тканях, повышения насосной функции сердца, а также лечения дислипидемий и атеросклероза. В неврологии трансплантационные клеточные технологии начали применять для лечения болезни Паркинсона и болезни Хагинтона. Имеются примеры положительного использования стволовых клеток костного мозга для заживления ожоговых и глубоких кожных ран, лечения системных и местных костных дефектов. В связи с выявленной противоопухолевой активностью низкодифференцированных кроветворных клеток и их способностью прямо супрессировать опухолевый рост проводятся исследования, направленные на клиническое применение стволовых клеток в онкологии. Поиск новых технологий для восстановления утраченной функции органа или системы привели к появлению на стыке биотехнологии и медицины тканевой инженерии (регенеративной медицины и органогенеза). Будущее медицины напрямую связывают с развитием клеточных технологий, которые позволяют, не меняя поврежденный орган, «обновлять» его клеточный состав. 14.Трансгенные животные и растения как новые объекты биотехнологии. Новейшая биотехнология - это наука о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов для интенсификации производства или получения новых видов продуктов различного назначения. Основная цель современной биотехнологии – получений трансгенных организмов методами клеточной и генетической инженерии. Отличие генетической инженерии от традиционной селекции состоит в том, что при селекции перенос генов осуществляется только между близкородственными растениями, генная же инженерия позволяет перенести в растение гены из любого организма. Можно выделить следующие основные характеристики генетически модифицированного организма: - это любой биологический организм способный к воспроизводству или передаче генетического материала; - содержит искусственную генетическую программу; - получен, с применением методов генной инженерии; В работе используется понятие «генетически модифицированные продукты (организмы)», под которыми понимаются продукты питания содержащие результаты генно-инженерной деятельности. конспект 15. Основные принципы получения трансгенных организмов. Процедура получения ГМО включает в себя несколько основных этапов: • Выделение и идентификация отдельных генов (соответствующих фрагментов ДНК или РНК), которые собираются перенести другим организмам. Для этого из организмов, обладающих такими генами, с помощью специальных химических методов выделяют нуклеиновые кислоты. Их разрезают на отдельные фрагменты, используя наборы ферментов-рестриктаз. Наибольшее значение имеют рестриктазы, способные разрезать нуклеиновые кислоты с образованием, так называемых липких (комплементарных) концов. Образующиеся фрагменты имеют короткие однонитчатые концы, состоящие из нескольких нуклеотидов. Если объединить в одной пробирке фрагменты ДНК любого происхождения (н-р, фрагменты плазмид бактерий и фрагменты животной или растительной ДНК), полученные с помощью одной и той же рестриктазы, дающей липкие концы, и добавить фермент – лигазу, то эти фрагменты соединятся между собой. В результате получится химерная (рекомбинантная) ДНК, которая может содержать фрагменты ДНК, выделенные из различных организмов или синтезированную искусственно. Описанная технология позволяет создавать на основе плазмид (или других типов векторов) сложные генетические конструкции, предназначенные для переноса в клетки других организмов. • Клонирование (размножение) переносимого гена. Чтобы размножить созданные в пробирке немногочисленные химерные молекулы ДНК, векторы со встроенными в них фрагментами необходимо перенести в реципиентные клетки. Плазмидные векторы обычно вводятся в реципиентные клетки методом генетической трансформации. Особенно широкое распространение для клонирования векторных ДНК получила трансформация клеток кишечной палочки (E. сoli), основанная на совместной инкубации «компетентных» клеток бактерий (клетки способные к трансформации) и ДНК. В результате трансформации ДНК «поглощается» бактериальными клетками и автономно размножается в их цитоплазме (внутренняя среда клетки). На селективной среде ведут отбор трансформированных бактериальных клеток, несущих какой-либо селективный маркер, который уже был на векторе или должен был появиться в процессе образования рекомбинантной молекулы. Если, например, вектор содержал ген устойчивости к антибиотику ампицилину, то в селективную среду, добавляют этот антибиотик, и все выжившие клетки будут содержать данный вектор. Для того, чтобы выяснить, несут ли трансформированные клетки рекомбинантную ДНК, из клеток выделяют векторную плазмиду и подвергают её электрофорезу. Метод электрофореза основан, на принципе перемещения веществ в электрическом поле от одного полюса к другому со скоростью, зависящей от их размеров. С помощью этой простой техники можно в агарозном геле разделить, идентифицировать и очистить фрагменты векторной ДНК различной молекулярной массы. • Перенос гена (или трансгенной конструкции) внутрь клетки и встраивание его в ДНК реципиентного организма. Основной способ переноса генов (генных конструкций) из клеток организма–донора в клетки организма–реципиента - это процесс трансформации. Трансформация включает в себя несколько основных этапов и требует соблюдения ряда условий: наличия трансформирующей ДНК; «компетентных» клеток; интеграции донорской (трансформирующей) ДНК в ДНК реципиента и экспрессии (работы) перенесённых генов. Существуют различные методы трансформации: путем гибридизации соматических клеток; инкубации реципиентных клеток с чужеродным генетическим материалом; микроинъекцией генетического материала в ядра клеток животных и др. Их применение, прежде всего, зависит от биологических особенностей организма – реципиента. Например, для трансформации клеток растений используют два основных метода 1) Метод биологической баллистики. В этом случае, на мельчайшие частицы вольфрама или золота напыляется ДНК, содержащая «целевой» ген. Затем эти частички с ДНК помещают в так называемую генную «пушку». В результате «выстрела» они с огромной скоростью «бомбардируют» клетки растений, проникая в их цитоплазму и ядра. Некоторые из этих клеток встраивают «целевой» ген в свою ДНК. Из каждой такой клетки может быть регенерировано новое трансгенное растение. 2)Трансформация растения с помощью, так называемой, Ti – плазмиды, несущей «целевой» ген, который доставляется в клетки с помощью почвенной бактерии (Agrobacterium tumifaciens). Ti–плазмида - это кольцевая молекула ДНК содержащаяся в клетках Agrobacterium tumifaciens, вызывающей образование опухолей у растений при их заражении этой бактерией. При заражении бактериями растений, небольшой фрагмент Ti–плазмиды встраивается в геном растительных клеток, вызывает нарушение гормонального баланса и переход к неконтролируемому делению и росту, что и приводит к образованию опухоли. «Целевой» ген, способный изменять то или иное свойство растения, встраивается генно-инженерными методами в Ti–плазмиду, которая, затем переносится в агробактерию. В процессе совместного культивирования агробактерии и культуры клеток растения – хозяина Ti–плазмида попадает в клетки растений, а «целевой» ген с дополнительными фрагментами ДНК встраивается в растительный геном. Каждая такая клетка может быть, затем регенерирована в целое трансгенное растение, которое будет содержать генетическую информацию из двух или нескольких различных организмов. Это метод применяется для трансформации двудольных растений. Однако этот метод "работает" не на всех растениях: агробактерия, например, не заражает такие важные пищевые растения, как рис, пшеница, кукуруза. Поэтому разработаны и другие способы. Например, можно ферментами растворить толстую клеточную оболочку растительной клетки, мешающую прямому проникновению чужой ДНК, и поместить такие очищенные клетки в раствор, содержащий ДНК и какое-либо химическое вещество, способствующее ее проникновению в клетку (чаще всего применяется полиэтиленгликоль). Иногда в мембране клеток проделывают микроотверстия короткими импульсами высокого напряжения, а через отверстия в клетку могут пройти отрезки ДНК. Иногда применяют даже впрыскивание ДНК в клетку микрошприцем под контролем микроскопах [5]. • Выявление трансгенных клеток (организмов). Процесс переноса и включения в генетический материал клеток растений чужеродной ДНК происходит с достаточно небольшой частотой, в лучшем случае трансформированной оказывается 1 клетка на 1000. Поэтому необходимо каким-то образом отделить такие клетки от остальных создать для их деления и развития наиболее благоприятные условия. В этом случае вместе с «целевым» геном (н-р, устойчивости к гербицидам, вирусам и насекомым – вредителям) вводят и второй, так называемый селективный ген. Чаще всего для этого используют гены устойчивости к антибиотикам. Если после введения чужеродной ДНК поместить клетки на питательную среду с антибиотиком, то на ней способны будут расти только трансформированные клетки Методы идентификации трансгенов ПЦР – это метод, который позволяет проверить генетический материал, выделенный из исследуемого образца, на наличие в его составе участка чужеродной или измененной ДНК и используется для получения множества копий непротяженных участков ДНК, специфичных для каждого конкретного белка, а также исследуемого генетически обусловленного признака. В основе метода ПЦР лежит способность хорошо известных в молекулярной биологии ферментов, ДНК-полимераз, осуществлять направленный синтез второй, т.е. комплементарной (спаренной) цепи ДНК, по имеющейся матрице одноцепочечной ДНК, наращивая небольшую олигонуклеотидную затравку (праймер), комплементарную участку этой матрицы, до размеров в несколько тысяч или даже десятков тысяч звеньев. Повышая температуру, можно добиться остановки реакции и последующей денатурации полученной ДНК, т.е. разделения цепей полученной в ходе реакции двуцепочечной ДНК. Если в реакционной смеси присутствует избыток праймера, то, значительно снизив температуру, чтобы праймер мог вновь связаться с тем же самым комплементарным участком ДНК, и добавив новую порцию фермента, можно вновь установить температуру, необходимую для реакции полимеризации, и, таким образом, проведя реакцию еще раз, увеличить количество ранее полученного продукта. Многократное, или как говорят, циклическое повторение этой процедуры позволяет наработать значительное количество копий участка ДНК, начинающегося с данного праймера. Один цикл ПЦР осуществляется за 1–2 мин, так что в течение нескольких часов можно получить 100 млрд. копий • Методы обнаружения ГМО, основанные на исследовании трансгенных белков. Процесс создания ГМ растений основан на введении в клетки организма-реципиента чужеродных генных конструкций, обеспечивающих синтез новых белков. Появляющиеся в растении в результате генетической модификации белки могут служить маркерами генетической модификации. К этой группе методов относят различные иммунологические методики, основанные на использовании антител (особые белки, вырабатываемые иммунной системой организма в ответ на проникновение чужеродных организмов или их фрагментов), специфичных к маркерным белкам, используемым при создании ГМО • Хроматографические методы. Используются в том случае, когда генетическая модификация приводит к появлению и/или увеличению содержания специфических жирных кислот или триглицеридов. Использование подобного метода диагностики показана для растительного масла, полученного из ГМ-рапса. • Методы спектроскопии. В ряде случаев генетические модификации могут приводить к изменению структуры растительных волокон при отсутствии видимых изменений в белковом или жирно кислотном составе. Подобный тип изменений наблюдается, например, у трансгенной сои линии 40-3-2 (Roundup Ready Soy). • Технология ДНК-чипов. ДНК- чипы – это наборы из большого числа олигонуклеотидов на миниатюрных твердых подложках, предназначенные для анализа последовательности ДНК. Метод основан на том, что с помощью фотолитографии на небольшой поверхности размещают огромное число олигонуклеотидов (одноцепочечные фрагменты ДНК). Их число, а следовательно, и количество различных нуклеотидных последовательностей может превышать 1 млн. на 1 см2, их длина варьирует от 9-10 до 1000нуклеотидов. После проведения ПЦР, полученные продукты реакции могут быть автоматически проанализированы методом гибридизации с меченными олигонуклеотидами на ДНК-чипах, что значительно ускоряет процесс идентификации трансгенной ДНК. 16.Требования, предъявляемые к питательным субстратам, использующимся в биотехнологических процессах. Питательные среды должны обеспечивать рост, развитие продуцента и эффективный синтез целевого продукта. Для производства ПС необходима сырьевая база. |