Вопросы для подготовки к экзамену по микробиологии. Экзаменационные вопросы гори в аду, микроба!!!!! Ирина
 Скачать 1.25 Mb.
|
|
ЭКЗАМЕН МИКРОБА ОТВЕТЫ НА ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЕ ВОПРОСЫ ГОРИ В АДУ, МИКРОБА!!!!! [Ирина] 1. В чем суть иммерсионной микроскопии, обоснуйте ее необходимость, подготовьте микроскоп к работе и найдите четкое изображение в препарате. Метод иммерсионной микроскопии заключается в том, чтобы между препаратом и объективом вместо воздуха была жидкость, имеющая больший коэффициент преломления. Это обеспечивает уменьшение рассеивания лучей, в следствии чего более четкое и контрастное изображение клеточных структур. Применяют несколько иммерсионных сред: масляную, глицериновую и водную, и иммерсионный объектив (*100/80) обычно помеченный черной полоской. Выполняя микроскопию необходимо на покровное стекло препарата поместить каплю иммерсионного масла, затем под контролем глаза с помощью макровинта добиться соприкосновения иммерсионного объектива с каплей, поднять конденсор и открыть его диафрагму, для определения четкости изображения используют микровинт. 2. Объясните принцип окраски по Граму и деление микроорганизмов на грампозитивные и грамнегативные. Промикроскопируйте препараты и оцените микроскопическую картину. Этот метод относится к сложным методам окраски и позволяет лишь дифференцировать похожие по форме и размерам микробов. 1) фиксированный мазок окр. кристаллическим фиолетовым 1-2мин 2) капают р-р Люголя 1-2мин 3) обрабат. мазок этиловым спиртом 96% 10-15сек 4) промыв. водой 5) окр. фуксином 1-2мин Принцип окраски заключается в строении клеточной стенки: у гр- много липопротеидов (+ липополисахариды и белки), а у гр+ пептидогликанов и тейхоевых кислот( мало липопротеидов). 3. Определите в микропрепарате морфологические и тинкториальные свойства микробов. Сделайте вывод о чистоте изучаемой культуры. Определяя морфологию микробов оценивают: размеры, форму (кокковидная, палачковидная, нитевидная, извитая), наличие ресничек и жгутиков, капсул и спор. Определяя тинкториальные свойства оценивают их окраску различными способами. Судить и чистоте изучаемой культуры можно наблюдая в поле микроскопа только один вид микробов. Если же наблюдаются микробы различного размера, форм и окраски, о чистоте культуры говорить не приходится. 4. Схематично представьте этапы выделения чистой аэробной бактериальной культуры. I этап (нативный материал) 1)Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре). 2)Посев на плотные питательные среды (получение колоний). II этап (изолированные колонии) 1)Изучение колоний (культуральные свойства бактерий). 2)Микроскопическое изучение микробов в окрашенном мазке (морфологические свойства бактерий). 3)Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой культуры. III этап (чистая культура) 1)Определение культуральных, морфологических, биохимическихи других свойств для идентификации культуры бактерий 5. Обоснуйте изучение культуральных свойств микробов (опишите характер роста различных микроорганизмов на плотной и жидкой питательных средах, укажите S и R-формы колоний). В бактериологическом методе диагностики принципиально важно знать культуральные свойства предполагаемого возбудителя для культивирования и узнавания его культур на питательной среде. Для характеристики колоний используют следующие признаки: размер (мм) форма (правильн, неправильн) контур края (ровн, бахромчат) рельеф (каплеобр, куполообр, конусообр — форма в вертикальном разрезе) поверхность (блестящ, матовая, гладкая, шероховат) цвет структура (зернистая, волокнистая, гиалиновая) консистенция (вязкая, слизистая, сухая, волокнистая) Все типы колоний раздели на 2 большие группы: S - круглые, гладкие и выпуклые, с ровными краями и блестящей поверхностью. R - неправильной формы, шероховатые, с зубчатыми краями. На жидких средах мб придонный рост бактерий (осадок), пристеночный, поверхностный, 6. Методы стерилизации: Посуды: в пламени – прокаливание на огне (бактериологические петли, металлические и стеклянные предметы); сухим жаром (горячим воздухом) – в сушильных шкафах или печах Пастера: t = 160-170 градусов в теч. 1-1,5 часа (лабораторная посуда, инструменты, минеральные масла, вазелин); кипячение – в теч. 30 мин. (шприцы, инструменты, иглы); автоклавирование (паром под давлением): Р= 0,5 атм – 112 градусов; Р=1 атм – 121градус; Р= 1,5 атм – 127 градусов; Р= 2 атм – 134 градуса в теч. 20 мин. химическая стерилизация (стерилизуют пластмассовые чашки Петри и др., что плавится при температуре больше 100 градусов. Инструментов: в пламени сухим жаром кипячение автоклавирование Обычные питательные среды (Мпа, Мпб): автоклавированием, химическая стерилизация. Среды, содержащие углеводы (Гисса): стерилизация текучим паром в аппарате Коха ( при температуре 100 градусов з дня подряд по 30 минут, чтобы убить споры) или в автоклаве с открытой крышкой. Среды, содержащие белки (Ру, Леффлера): тиндализация- дробная стерилизация( на водяной бане по 1 часу при температуре 56-60 градусов, в теч. 5-6 дней. 7. Поставьте реакцию агглютинации на стекле с агглютинирующей неадсорбированной брюшнотифозной сывороткой и оцените результат. Диагностическая значимость этой реакции Реакция агглютинации на предметном стекле используется для ускоренной постановки диагноза (идентификации аозбу- дитепя). Для этого на предметном стекле пастеровской пипеткой наносят каплю диагностической сыворотки и рядом на том же стекле помещают каплю физиологического раствора для контроля. Петлёй снимают небольшое количество исследуемого материала бактерий (можно брать бактерии из колоний на чашке, со скошенного агара) и вносят их в каплю сыворотки; размешивают до получения равномерной мути. Второй же комочек микробной массы размешивают в капле физиологического раствора. Через несколько минут при положительной реакции агглютинации в капле с сывороткой появляются хлопья, видимые на глаз на темном фоне, тогда как контрольная капля остаётся равномерно мутной. Мы работаем с брюшнотифозными сыворотками и соответствующими культурами. 8. Назовите компоненты необходимые для постановки развернутой реакции агглютинации Грубера. Проведите учет реакции и обоснуйте цель её постановки. В случае отсутствия в лаборатории адсорбированных монорецепторными сывороток ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках (р-ция Грубера) с видовыми тифозных и паратифозных сыворотками. Диагностическую сыворотку необходимо разводить до титра, указанного на этикетке ампулы. Если реакция агглютинации выпадает до титра, или по крайней мере до половины титра, тогда культура соответствует виду сыворотки. Ставят ее следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй – в третью пробирку и т. д. Получив двукратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более), вносят в них по 1–2 капли двухмиллиардной взвеси бактерий. Контролями служат изотонический раствор натрия хлорида с антигеном и исследуемая сыворотка без него. Пробирки энергично встряхивают и помещают на 2 ч в термостат при температуре 37°С, затем ведут предварительный учет, начиная с контрольных. Отсутствие агглютинации в контрольных пробирках и наличие взвешенных хлопьев в двух–трех и более пробирках опыта свидетельствуют о положительной реакции. Окончательные результаты учитывают через 18–20ч, выдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре. Интенсивность реакции выражается плюсами: «++++» – сыворотка прозрачная, с хлопьевидным осадком склеившихся бактерий на дне пробирки; «+++» «++» и «+» – убывающие просветления с уменьшением бактериального осадка. 9. Назовите необходимые компоненты для постановки реакции Видаля. Проведите учет реакции в динамике и обоснуйте её применение. Реакция Видаля Специфические антитела (агглютинины) обнаруживаются в крови больного со 2-ой недели болезни. Для постановки реакции Видаля берут шприцем кровь из локтевой вены в количестве 2-3 мл и дают ей свернуться. Образовавшийся сгусток отделяют, а сыворотку отсасывают в чистую пробирку и готовят из неё 3 ряда разведений сыворотки больного от 1:100 до 1:800 следующим образом: во все пробирки разливают по 1 мл (20 капель) физиологического раствора; затем этой же пипеткой наливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:50 в первую пробирку, перемешивают с физиологическим раствором, таким образом получают разведение 1:100, Из этой пробирки переносят 1 мл сыворотки в следующую пробирку, перемешивают с физиологическим раствором, получают разведение 1:200 также получают разведения 1:400 и 1:800 в каждом из трёх рядов. Реакция агглютинации Видаля ведётся в объеме 1 мл жидкости, поэтому из последней пробирки после смешения жидкости удаляют 1 мл. В отдельную контрольную пробирку наливают 1 мл физиологического раствора без сыворотки. Этот контроль ставится для проверки возможности спонтанной агглютинации антигена (диагностикума) а каждом ряду {контроль антигена). Во все пробирки каждого ряда, соответствующего надписям, закапывают по 2 капли диагностикума. Штатив ставят в термостат на 2 часа при 37 «С и затем на сутки оставляют при комнатной температуре. Учёт реакции производится на следующем занятии. В сыворотках больных могут быть как специфические, так и групповые антитела, которые различаются по высоте титра. Специфическая реакция агглютинации идёт обычно до более высокого титра. Реакция считается положительной, если агглютинация произошла хотя бы в первой пробирке с разведением 1:200. Обычно она наступает в больших разведениях. Если наблюдается групповая агглютинация с двумя или тремя антигенами, то возбудителем болезни считают того микроба, с которым произошла агглютинация в наиболее высоком разведении сыворотки. Недостатки реакции: 1. реакция положительна, начиная со 2-ой недели заболевания; 2. реакция положительна в 3-х случаях: у больных (инфекционная реакция), у переболевших (анамнестическая) и у вакцинированных (прививочная). Для дифференциации реакций прибегают к повторной постановке ее через 5-6 дней. У больных отличается резкое нарастание титра антител При прививочной и анамнестической реакциях титр антител не изменится. Реакцию Видаля можно поставить одновременно с Н- и О-антигенами бактерий брюшного тифа, что помогает дифференцировать инфекционную реакцию от прививочной, так как у привитых обнаруживаются только Н-антитела, О- агглютинин в высоком титре отмечается только в разгар болезни. 10. Поясните суть реакции РОПГА. Проведите учет результатов реакции поставленной с целью диагностики ботулизма. Её сущность заключается в том, что эритроциты сенсибилизируются специфическими антителами и гемагглютинация происходит при добавлении ( или наличии) в растворе антигена. Это весьма чувствительная и специфическая реакция позволяет выявлять в исследуемом материале микроколичества токсинов возбудителей ботулизма. Учет результатов: 11. Проведите учет р-ции кольцеприцепитации, сделайте вывод и поясните её принцип на примере р-ции термопреципитации Асколи. Асколи реакция (A. Ascoli) — диагностическая реакция преципитации, используемая для диагностики сибирской язвы. Заключается в обнаружении в исследуемом материале термостабильного сибиреязвенного антигена при помощи преципитирующей сибиреязвенной сыворотки. Кусочки органов, шкуры, кожу, шерсть павших животных, иногда мясо, колбасу и молочные продукты, вытяжки из земли зараженных пастбищ и скотомогильников, фураж измельчают, заливают тройным объемом 0,5% раствора 80% уксусной кислоты в физиологическом растворе NaCl и экстрагируют в течение 10—15 мин. в аппарате Коха или автоклаве при t° 110°. Экстракт нейтрализуют, фильтруют до полной прозрачности через плотный бумажный фильтр или прокаленную асбестовую вату. Присутствие сибиреязвенного антигена выявляют наслоением экстракта оттянутой пастеровской пипеткой на преципитирующую сыворотку в узких пробирках в объеме 0,5 мл. Удобно пользоваться специальными пробирками Асколи. При положительной реакции на границе между сывороткой и экстрактом немедленно или через 5 — 10 мин. появляется кольцеобразное помутнение, становящееся все более интенсивным. Полученные результаты проверяются контрольными пробами 12.Подберите препараты, необходимые для постановки РИФ. Поясните суть прямой и непрямой РИФ и её использование. Происходит взаимодействие вирусных АГ с АТ диагностической иммунной сыворотки или моноклональными АТ. С пом РИФ обнаруж специфический вирусный АГ в культуре клеток, инфицированных вирусом. Комплексы Аг с меченными АТ определяют по интенсивному желто-зеленому свечению при изучении препарата в люминесцентном микроскопе. Прямая РИФ: Иммунофлюоресцирующие АТ против АГ. Препарат окрашивают меченой антисывороткой во влажной камере, после промывают буф раствором. Непрямая РИФ: в 2 этапа.Немеченные АТ против искомого АГ, на втором этапе образовавшийся комплекс АГ-АТ обрабатыв люминесцирующей антисывороткоц, содержащей меченные АТ проьтв гамма-глобулинов того вида животного, на котолром получена немеченая антисыворотка. 13. Проведите учет р-ци связывания комплимента поставленной с целью диагностики хронической гонореи. Сделайте вывод. В чем механизм РСК? Необходимо АГ, АТ и комплимент, эритроциты барана и гемолитическая сыворотка. Если АГ и АТ соответствуют друг другу, то комплимент связывается с комплексом и гемолиза нет. Если АТ не соответствует АГ, то гемолиз. 14. Поясните суть прямого метода ИФА для диагностики вирусных инфекций, подберите реактивы для постановки этой р-ции. На примере ВИЧ Полистерол планшеты, в них адсорбируется убитые вирионы. Взять сыворотку крови, внести обнаруживаемые АТ к ВИЧ. Промывают, вносят иммуноглобулины к белкам человека меченные пероксидазой. Для проявления фермента добавляют Н2О2, ОФД. Если цвет изменился на оранжевый, то позитивный ответ. Цвет не изменился – негативный. То есть если есть АТ, то р-ция проходит. Если нет, то АГ и АТ не взаимодействуют, следовательно р-ции нет. Набор, необходимый для проведения реакции, содержит следующие компоненты: паразитарный антиген, специфические сывороточные антитела, конъюгат, планшета с зафиксированным на ней специфическим паразитарным антигеном, контрольные сыворотки. 15. Поясните суть метода радиоиммуного анализа и его применение. Радиоиммунный метод, или анализ (РИА), - высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген - антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125J, 14C, 3Н, 51Сr и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител Метод позволяет исследовать большое количество проб в минимальном объеме и в относительно короткие сроки (несколько часов), производить количественный учет результатов, он легко подвергается полной или частичной автоматизации. С помощью РИА можно исследовать любой заразный материал, который предварительно обезврежен: суспензии органов животных, кровь, объекты внешней среды, материал после обогащения на питательных средах и т. д. Применяют при диагностики чумы 16. Объясните принцип реакции нейтрализации на примере выявления ботулинистического экзотоксина. Подберите препараты, необходимые для постановки этой реакции. Для проведения РН используют сухие диагностические антитоксические сыворотки типов А, В, С, Е, которые разводят изотоническим раствором NaCl до 100-200 МЕ/мл. Кровь разливают по 1 мл в 5 пробирок; в первые 4 пробирки добавляют по 1 мл противоботулинической сыворотки типов А, В, С, Е соответственно, в последнюю – 1 мл нормальной сыворотки. Пробирки инкубируют в термостате в тчении 30 минут, а затем по 1 мл смеси из каждой пробирки вводят внутрибрюшинно пяти парам белых мышей. Наблюдают в течении 4 суток. Если в исследуемом материале имеется ботулинический токсин, выжывает только одна пара мышей вследствие нейтрализации токсина антитоксической сывороткой соответствующего типа(положительная реакция). 17. Использование диагностикумов и диагностических сывороток в микробиологической лаборатории. Подберите по 2-3 каждого из препаратов, поясните их назначение и принцип получения. Серологические реакции в микробиологической лаборатории используют в двух целях: Для сероидентификации микроорганизмов, токсинов, антигена вообще с помощью известного антитела(иммунной диагностической сыворотки). Для серодиагностики – определения природы антитела в сыворотке крови больного при бактериальных и вирусных заболеваниях с помощью известного антигена(диагностикума). Иммунные диагностические сыворотки – препараты, содержащие известные АТ для определения родовой, видовой и типовой принадлежности антигена. Преципитирующие сыворотки получают иммунизацией кроликов ан¬тигенами бактерий, их экстрактами и токсинами.Специфические преципитирующие сыворотки применяются при ди-агностике инфекционных заболеваний (сибирская язва, чума, туляре¬мия, дифтерия, и др.), в судебно-медицинской экспертизе для определе¬ния видовой принадлежности белка. Гемолитические сыворотки получают путем иммунизации кроликов взвесью эритроцитов барана. Гемолитические сыворотки ис¬пользуют для титрования комплемента и при постановке реакции свя¬зывания комплемента в индикаторной системе. Диагностикумы – препараты, содержащие известный АГ в виде взвеси живых или убитых бактерий, продуктов их расщепления, токсины, вирусы. Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации. Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации. |