Экзаменационные вопросы по дисциплине Микробиология, вирусология
 Скачать 0.77 Mb.
|
Реакция фаготипирования S.aureusОпределение фаготипа проводится с помощью специальных наборов типовых фагов и является одним из методов внутривидовой дифференциации бактерий. Реакция фаготипирования применяется с целью установления источников и путей передачи инфекции при госпитальных, кишечных заболеваниях и пищевых отравлениях.Испытуемую суточную бульонную культуру S.aureus равномерно распределяют на поверхности подсушенного агара в чашке Петри. Дно чашки расчерчивают на 22 квадрата по числу фагов, затем капают фаги по одному в каждый квадрат. Посев инкубируют в термостате 18-24 часа при температуре 37°С. На 2-й день проводят учёт результатов; фаготип культуры соответствует тому фагу, который вызывает её полный лизис. Также проводится фаготипирование брюшнотифозных (44 типа) и паратифозных бактерий (15 типов), энтеропатогенных эшерихий (24 типа). Раздел 2. Основы генетики микроорганизмов. Организация генетического аппарата у бактерий и вирусов. Генотип. Фенотип. Факторы и формы изменчивости. Материальной основой наследственности бактерий является ДНК. По сравнению с геномом эукариотов геном бактерий устроен более просто - это молекула ДНК, замкнутая в кольцо, которое прикреплено к одной из мезосом. В отличие от парных хромосом эукариотов, у бактерий одна хромосома, то есть гаплоидный набор генов, поэтому у них нет явления доминантности. У вирусов генетический материал представлен лишь одним типом нуклеиновой кислоты – либо ДНК, либо РНК. Генотип - это общая сумма генов микроба. В отношении микроорганизмов "генотип" означает то же, что "геном". Фенотип - это весь комплекс свойств микроба, проявление генотипа в определенных, конкретных условиях существования. Генотип - это возможные способности клетки, а фенотип - видимое их проявление. Гены, ответственные за синтез какого-то соединения, обозначают строчными буквами латинского алфавита по названию соединения, например, при наличии гена, кодирующего синтез лейцина, - ieu+, при отсутствии - leu-. Гены, ответственные за резистентность к лекарственным средствам, бактериофагам, ядам, обозначают буквой г (лат. resistentia), а чувствительные - буквой s (лат. sensitiv - чувствительный). Например, чувствительность к стрептомицину обозначают str5, резистентность strr. Фенотип бактерий обозначается теми же знаками, но с прописной буквы: соответственно Leu+, Leu-, Str1, Str8. Виды изменчивости у бактерий. Модификационная изменчивость, ее механизмы и формы проявления. Изменчивость у бактерий может быть ненаследуемой (модификационной) и генотипической (мутации, рекомбинации). Временные, наследственно не закрепленные изменения, возникающие как адаптивные реакции бактерий на изменения окружающей среды, называются модификациями (чаще - морфологические и биохимические модификации). Черты: 1. обратимость — изменения исчезают при смене специфических условий окружающей среды, спровоцировавших их групповой характер 2. изменения в фенотипе не наследуются, наследуется норма реакции генотипа 3. статистическая закономерность вариационных рядов 4. затрагивает фенотип, при этом не затрагивая сам генотип. Стандартное проявление модификации- распределение однородной популяции на две или более двух типов- диссоциация. Пример- характер роста на питательных средах: S- (гладкие) колонии, R- (шероховатые) колонии, M- (мукоидные, слизистые) колонии, D- (карликовые) колонии. Диссоциация протекает обычно в направлении S-R. Диссоциация сопровождается изменениями биохимических, морфологических, антигенных и вирулентных свойств возбудителей. Генотипическая изменчивость. Мутации у бактерий, их разновидности. Причины и механизмы возникновения мутаций. Мутагены. При генотипической изменчивости происходит изменение наследственного материала и, обычно, эти изменения наследуются. Это основа разнообразия живых организмов. Различают два вида генотипической изменчивости: мутационная и комбинативная. Мутация — изменение первичной структуры ДНК, проявляющееся наследственно закреплённой утратой или изменением какого-либо признака или группы признаков. Фенотипическим проявлением мутации могут быть: изменение морфологии бактериальной клетки, возникновение потребностей в факторах роста (пр. АК), т. е. ауксотрофность; появление устойчивости к а/б; изменение чувствительности к t; снижение вирулентности (аттенуация). Могут быть спонтанные (возникают в популяции бактерий без видимого вмешательства извне) и индуцированные (вызванные искусственно), точечные, прямые, обратные, генные (изменения 1 гена) и хромосомные (изменения 2х или более участков хромосомы). Факторы, вызывающие мутации, известны как мутагены. Мутагены бывают физическими (УФ-лучи, у-радиация), химическими (аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, например, 2-амино-пурин, азотистая кислота и ее аналоги и др.) и биологическими (транспозоны). Мутации у бактерий. Классификация по происхождению и характеру изменений в первичной структуре ДНК. Мутации - стабильное изменение первичной структуры геномной ДНК, которое приводит к наследственно закрепленному изменению или утрате одного или нескольких признаков, не связанное с генетическим обменом или присутствием плазмид. 1. Точковые— замена или вставка пары азотистых оснований в ДНК, которая приводит к изменению одного кодона, когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов: вставки или выпадения одной пары нуклеотидов (мутации со сдвигом считывания); транзиции —замены одного пуринового основания на другое, или одного из пиримидиновых оснований на другое; трансверсии—одно из пиримидиновых оснований заменяется пуриновым или, наоборот. Виды точковых мутаций по индуцируемым последствиям: мисценс–мутации — происходит изменение всех последующих кодонов, в результате вместо одной аминокислоты кодируется другая. нонсенс–мутации— образуется бессмысленный кодон, не кодирующий ни одну из аминокислот. 2. Генные— изменения одного гена. 3. Хромосомные (геномные аберрации) — изменения нескольких генов: нехватки—выпадение части хромосомы: делеции — утрата нескольких пар нуклеотидов в середине хромосомы, дефишенсии — потеря концевого участка хромосомы; дупликации (повторения) — удвоение участка хромосомы; инверсии (перевороты) — отрыв участка хромосомы, поворот его на 1800 и прикрепление к месту отрыва; инсерции (вставки)—вставки коротких или протяженных последовательностей посторонней ДНК; транспозиции (перемещения, горизонтальный перенос генов)— перемещение группы нуклеотидов (IS–последовательностей или транспозонов) в пределах хромосомы из одного участка ДНК в другой или из репликона в репликон (из хромосомы в плазмиду и наоборот). Транспозиции могут вызывать делеции или инверсии генетического материала, а при включении в новый участок ДНК — дупликации в 6–9 пар нуклеотидов. Теоретически мутации могли бы привести к вымиранию бактериальной популяции, однако в любой живой клетке существуют биохимические механизмы, способные полностью или частично восстанавливать исходную структуру ДНК. Классификация мутаций бактерий по фенотипическим последствиям. 1. Нейтральные — безразличны для популяции, фенотипически не проявляются изменениями признаков, так как заметно не отражаются на функциональной активности синтезируемого фермента. 2. Условнолетальные (полулетальные) — приводят к изменению, но не к утрате функциональной активности фермента. В зависимости от условий окружающей среды микроорганизмы могут сохранять или утрачивать свою жизнеспособность. Так, напр., ts–мутанты (температурочувствительные) бактерий сохраняют способность к синтезу ферментов, функционирующихпри 370С, но утрачивают этот признак при 420С. В то же время у бактерий дикого типа соответствующие ферменты активны при обеих температурах. 3. Летальные — характеризуются полной утратой способности синтезировать жизненно важный для бактериальной клетки фермент. Чаще всего это хромосомные мутации (делеции) или генные мутации (в генах, несущих информацию о синтезе ДНК–полимераз). 4. Полезные — в любой микробной популяции в каждый момент времени существует множество особей с изменениями молекулярной конституции, обеспечивающих резистентность к неблагоприятным воздействиям (напр., к антибиотикам). 4. Механизмы передачи генетической информации - трансформация, трансдукция, конъюгация. Прокариотам несвойственно половое размножение. Рекомбинация у них происходит в результате внутригеномных перестроек, заключающихся в изменении локализации генов в пределах хромосомы, или при проникновении в клетку реципиента части ДНК донора. В результате рекомбинаций образуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента с включенным в него фрагментом ДНК донора. Генетические рекомбинации происходят при участии ряда ферментов в пределах отдельных генов или групп сцепленных генов. Существуют специальные гес-гены, детерминирующие рекомбинационную способность бактерий. Передача генетического материала (хромосомных генов) от одних бактерий к другим происходит путем трансформации, трансдукции и конъюгации. Передача плазмидных генов - путем трансдукции и конъюгации. Трансформация - изменение одного типа клеток при действии активного начала из другого типа клеток. Феномен открыл Гриффит у Streptococcus pneumoniae (1928); позднее Эвери, Маклеод и Мак Карти (1944) выделили трансформирующее начало пневмококков в форме молекулы ДНК. Это и явилось первым прямым доказательством того, что носителем генетической информации является ДНК. Погибшие бактерии постоянно высвобождают ДНК, которая может быть воспринята другими бактериями. Традиционно, любая чужеродная ДНК, попадающая в бактериальную клетку, расщепляется эндонуклеазами. При некоторых условиях такая ДНК интегрируется в геном бактерий и изменяет его. Встраивание плазмидной ДНК может менять вирулентность бактерий. В обмене генетической информацией трансформация играет незначительную роль. Трансдукция - перенос фрагмента ДНК от одной клетки (донора) к другой (реципиенту) с помощью бактериофага. Явление открыл Ледерберг и Циндер (1952). Выделяют 3 типа трансдукции: неспецифическая (общая)- в клетке, инфицированной бактериофагом, в ходе сборки дочерней популяции в головки некоторых фагов вместе с вирусной ДНК может проникнуть любой фрагмент бактериальной ДНК или плазмиды. В этом случае, фаг утрачивает часть своего генома, становиться дефектным и способен вызвать трансдукцию. При такой форме трансдукции в клетки-реципиенты могут быть внесены практически любые гены. специфическаяхарактеризуется способностью фага переносить определенные гены от бактерии-донора к бактерии-реципиенту. Это связано с тем, что образование трансдуцирующего бактериофага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме в клетке-донора рядом с профагом. При взаимодействии трансдуцирующих фагов клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента. Бактерии, лизогенированные дефектным фагом, невосприимчивы, как и все лизогенные клетки, к последующему заражению гомологичным вирулентным фагом. абортивная.Принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать. Во время деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК-донора может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т. е. наследоваться однолинейно и постепенно утрачиваться. Конъюгация - перенос генетического материала их клетки-донора в клетку-реципиента при их скрещивании. Позднее выяснилось, что донорами генетического материала являются клетки, несущие F-плазмиду (половой фактор). При скрещивании F+ с F- клеткой половой фактор передается независимо от хромосомы донора, если плазмида находится в автономном состоянии. При этом почти все реципиентные клетки получают F плазмиду и становятся F+ клетками. 5. Плазмиды бактерий. Их функции (регуляторная и кодирующая). Бактериоцины. Внехромосомные факторы наследственности у бактерий представлены плазмидами. Плазмиды располагаются в цитоплазме бактерий. Количество их в бактериальной клетке может быть от 1 до 200. Плазмиды представлены кольцевой двухцепочечной ДНК длиной от 2 до 600 тыс. пар нуклеотидов, несущий 10-100 генов. Благодаря кольцевой структуре ДНК плазмиды не подвергаются действию экзонуклеаз — ферментов, вызывающих деградацию ДНК. Существуют также линейные плазмиды, резистентность которых к действию экзонуклеаз обеспечивается тем, что концы их нитей защищены белками или соединяются ковалентно. Признаки, объединяющие плазмиды в одно царство с вирусами: отсутствие собственных систем мобилизации энергии и синтеза белка; саморепликация генома; абсолютный внутриклеточный паразитизм. Признаки, выделяющие плазмиды в отдельный класс: среда обитания — только бактерии (среди вирусов имеются бактериофаги, вирусы растений, вирусы животных); сосуществуют с бактериями, наделяя их дополнительными свойствами (у вирусов эти свойства могут быть только у умеренных фагов при лизогении бактерий, чаще всего вирусы вызывают лизис клеток); геном «голый», не имеет оболочки; репликация не требует синтеза структурных белков и процессов самосборки; могут встраиваться в хромосому бактерий (интегративные плазмиды) или находиться в виде отдельной замкнутой молекулы ДНК, способной к автономной репликации — автономные плазмиды (эписомы). Интегративные плазмиды содержат специфические инсерционные последовательности (IS–элементы), имеющие в своем составе ген, ответственный за сайт-специфическую рекомбинацию. В интегрированном состоянии плазмиды способны неопределенно долго существовать в составе хромосомы, реплицируясь вместе с ней, как обычные хромосомные гены. Плазмиды содержат сайт начала репликации и набор генов, необходимых для ее осуществления. Однако поскольку в процессе репликации ДНК участвует множество белков, в репликации плазмид участвуют и белки клетки-хозяина. Поскольку эти белки у разных видов бактерий отличаются друг от друга, то плазмиды могут существовать только в ограниченном числе близкородственных видов бактерий. Однако известны плазмиды, имеющие широкий круг хозяев. Они обладают отличиями в наборе белков, необходимых для их поддержания в различных бактериях. Переход плазмиды в автономное состояние и реализация записанной в ней информации часто связаны с индуцирующими воздействиями внешней среды. В некоторых случаях продукты плазмидных генов могут способствовать выживанию несущих их бактерий. Самостоятельная репликация плазмидной ДНК способствует ее сохранению и распространению в потомстве. Встраивание плазмид, так же, как и профагов, происходит только в гомологичные участки бактериальной хромосомы, в то время как IS–последовательностей и транспозонов — в любой ее участок. Плазмиды могут распространяться по вертикали (при клеточном делении) и по горизонтали (путем конъюгационного переноса). В зависимости от наличия или отсутствия механизма самопереноса (его контролируют гены tra–оперона) выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Конъюгативные (трансмиссивные) плазмиды обладают способностью передавать свою копию в другие клетки методом конъюгации. Конъюгативные плазмиды содержат в своем геноме гены, ответственные за образование конъюгационного мостика между клетками, по которому может переноситься одна из нитей плазмидной или бактериальной ДНК. Чаще всего конъюгативными являются F– или R–плазмиды. Конъюгативные плазмиды крупные (25–150 млн Д), часто выявляются у Грам- палочек, делятся синхронно с нуклеоидом, обычно в клетке 1–2 копии. Они переносятся от бактерии к бактерии внутри вида или между представителями близкородственных видов. Среди них есть плазмиды как с узким, так и с широким кругом хозяев. Они играют важную роль в эволюции бактерий, способствуя распространению генов среди бактерий разных видов и родов. Это явление получило название горизонтального переноса генов. Неконъюгативные (нетрансмиссивные) плазмиды не способны запускать конъюгацию, имеют небольшие размеры, характерны для Грам+ кокков, но встречаются также у некоторых Грам- бактерий (напр., у H. influenzae, N. gonorrhoeae). Неконъюгативные плазмиды делятся чаще нуклеоида, могут присутствовать в больших количествах (более 30 на клетку), так как только наличие такого количества обеспечивает их распределение в потомстве во время клеточного деления. Неконъюгативные плазмиды могут передаваться при конъюгации одновременно с конъюгативными (при наличии в бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативных плазмид) или при трансдукции. Функции плазмид: – регуляторная— компенсирует нарушение функции ДНК нуклеоида (напр., при интеграции плазмиды в состав поврежденного бактериального генома, неспособного к репликации, его функция восстанавливается за счет плазмидного репликона); – кодирующая — вносит в бактериальную клетку новую информацию: индуцирует деление, контролирует синтез факторов патогенности, совершенствует защиту бактерий (синтез бактериоцинов, резистентность к антибиотикам); обеспечивает выживание в необычных условиях: при действии катионов (висмута, кадмия, ртути, свинца, сурьмы), анионов (арсената, арсенита), мутагенов (акридинов, этидиум-бромида, УФО). Виды плазмид: 1. F–плазмиды — половой фактор, F–фактор, фактор фертильности (англ. fertility — плодовитость). F–плазмиды выполняют донорские функции, индуцируют деление. Они могут находится как в интегрированном состоянии (Hfr–клетки — от англ. high frequency of recombinations — высокая частота рекомбинаций), так и в автономном состоянии (F+–клетки). Интегрированные F–плазмиды переносят свою генетическую информацию и часть генетической информации хромосомы в реципиентную клетку. Перенос генетического материала детерминируется tra–опероном F–плазмиды (от англ. transfer— перенос), обеспечивающим ее конъюгативность. F–плазмиду можно элиминировать из клетки, обработав последнюю акридиновым оранжевым. В результате этого клетки теряют свойства донора. 2. R-плазмиды — R–фактор, фактор резистентности (англ. resistance — устойчивость) детерминируют множественную резистентность к антимикробным препаратам. R–плазмиды имеют более сложное строение, в их состав входит r–оперон, который может содержать более мелкие мигрирующие элементы (IS–последовательности, транспозоны и tra-опероны). Трансмиссивные R–плазмиды содержат 2 области генов: гены, контролирующие лекарственную резистентность и гены, контролирующие перенос R–плазмид при конъюгации (у Грам- бактерий). Нетрансмиссивные R–плазмиды передаются при трансформации, при трансдукции (у Г+ бактерий), при конъюгации в случае интеграции с трансмиссивными плазмидами. R-плазмиды могут передаваться бактериям других видов, так как критерий репродуктивной изоляции отсутствует. Передача R–плазмид привела к их широкому распространению среди патогенных и УП бактерий, что чрезвычайно осложнило химиотерапию вызываемых ими заболеваний. 3. Плазмидыбактериоциногенности детерминируют синтез бактериоцинов (колицинов, стафилоцинов, вибриоцинов, пестицинов) — белковых антибиотикоподобных веществ, обладающих бактерицидным действием в отношении близкородственных видов микроорганизмов. Они редко интегрируют в нуклеоид. Бактериоцины являются одним из механизмов межвидовой конкуренции и не действуют на клетки, несущие плазмиды бактериоциногенности такого же типа. Напр., Col–плазмиды участвуют в поддержании эубиоза кишечника. Механизмы бактерицидного действия бактериоцинов: нарушение функции рибосом; ферментативное разрушение ДНК (являются нуклеазами); нарушение функции ЦПМ. Известно более 25 типов колицинов (A, B, C, D, E1, E2, К и др.), отличающихся по физико-химическим и антигенным свойствам, а также по способности адсорбироваться на определенных участках поверхности бактериальных клеток. Способность продуцировать различные типы колицинов используется для типирования бактерий при проведении эпидемиологического анализа вызываемых ими заболеваний: – колициногенотипипрование — определение типа Col–плазмиды; – колицинотипипрование — определение типа колицина. 4. Плазмиды вирулентности контролируют вирулентные свойства микроорганизмов, детерминируя синтез факторов патогенности: – -CF+ плазмиды – контролируют адгезию; – - плазмиды, контролирующие синтез пенетринов; – -Hly–плазмиды — определяют синтез гемолизинов; – -Ent–плазмиды — определяют синтез энтеротоксинов; – -Tox–плазмиды — определяют токсинообразование. Развитие инфекционного процесса, вызванного возбудителями чумы, сибирской язвы, кишечного иерсиниоза, боррелиоза связано с функционированием плазмид вирулентности. 5. D–плазмиды– плазмиды биодеградации, несут информацию об утилизации органических соединений, которые бактерии используют в качестве источников углерода, азота и энергии (в т. ч. различные сахара и необычные аминокислоты, камфору, ксилол, нафталин, толуол). Обеспечивают патогенным бактериям селективные преимущества во время пребывания на объектах окружающей среды и в организме человека (уропатогенные штаммы кишечных палочек содержат плазмиду гидролизации мочевины). Близкородственные плазмиды не способны стабильно сосуществовать, что позволило объединить их по степени родства в Inc–группы (англ. incompatibility — несовместимость). Насчитывается более двух десятков групп несовместимости, объединяющих родственные плазмиды. 6. R-плазмиды, функции, строение. Пути передачи. Механизм множественной лекарственной устойчивости. R-плазмиды — R–фактор, фактор резистентности (англ. resistance — устойчивость) детерминируют множественную резистентность к антимикробным препаратам. R–плазмиды имеют более сложное строение, в их состав входит r–оперон, который может содержать более мелкие мигрирующие элементы (IS–последовательности, транспозоны и tra-опероны). Трансмиссивные R–плазмиды содержат 2 области генов: гены, контролирующие лекарственную резистентность и гены, контролирующие перенос R–плазмид при конъюгации (у Грам- бактерий). Нетрансмиссивные R–плазмиды передаются при трансформации, при трансдукции (у Г+ бактерий), при конъюгации в случае интеграции с трансмиссивными плазмидами. R-плазмиды могут передаваться бактериям других видов, так как критерий репродуктивной изоляции отсутствует. Передача R–плазмид привела к их широкому распространению среди патогенных и УП бактерий, что чрезвычайно осложнило химиотерапию вызываемых ими заболеваний. Реализация приобретенной лекарственной устойчивости возможна на каждом из следующих этапов: • модификация мишени. Фермент-мишень может быть так изменен, что его функции не нарушаются, но способность связываться с химиопрепаратом (аффинность) резко снижается или может быть включен «обходной путь» метаболизма, т. е. в клетке активируется другой фермент, который не подвержен действию данного препарата. • «недоступность» мишени за счет снижения проницаемости клеточной стенки и клеточных мембран или «эффлюко-механизма, когда клетка как бы «выталкивает» из себя антибиотик. • инактивация препарата бактериальными ферментами. Некоторые бактерии способны продуцировать особые ферменты, которые делают препараты неактивными (например, бета-лактамазы, аминогликозид-модифицирующие ферменты, хлорамфениколацетилтрансфераза). Бета-лактамазы — это ферменты, разрушающие бета-лактамное кольцо с образованием неактивных соединений. Гены, кодирующие эти ферменты, широко распространены среди бактерий и могут быть как в составе хромосомы, так и в составе плазмиды. 7. Подвижны генетические элементы: транспозоны и Is- последовательности. Основные признаки. Вставочные (инсерционные) последовательности IS-элементы— это участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка репликона в другой, а также между репликонами. Они содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения — транспозиции: ген, кодирующий фермент транспозазу, обеспечивающую процесс исключения IS-элемента из ДНК и его интеграцию в новый локус, и ген, детерминирующий синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения. Отличительной особенностью IS-элементов является наличие на концах вставочной последовательности инвертированных повторов. Эти инвертированные повторы узнает фермент транспозаза. Транспозаза осуществляет одноцепочечные разрывы цепей ДНК, расположенных по обе стороны от подвижного элемента. Оригинальная копия IS-элемента остается на прежнем месте, а ее реплицированный дупликат перемещается на новый участок. Перемещение подвижных генетических элементов принято называть репликативной или незаконной рекомбинацией. Однако в отличие от бактериальной хромосомы и плазмид подвижные генетические элементы не являются самостоятельными репликонами, так как их репликация — составной элемент репликации ДНК репликона, в составе которого они находятся. Известно несколько разновидностей IS-элементов, которые различаются по размерам и по типам и количеству инвертированных повторов. Транспозоны— это сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-элементы, но имеющие структурные гены, т. е. гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфическим биологическим свойством, например, токсичностью, или обеспечивающих устойчивость к антибиотикам. Перемещаясь по репликону или между репликонами, подвижные генетические элементы вызывают: Инактивацию генов тех участков ДНК, куда они, переместившись, встраиваются. Образование повреждений генетического материала. Слияние репликонов, т. е. встраивание плазмиды в хромосому. Распространение генов в популяции бактерий, что может приводить к изменению биологических свойств популяции, смене возбудителей инфекционных заболеваний, а также способствует эволюционным процессам среди микробов. Изменения бактериального генома, а следовательно, и свойств бактерий могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций. Особенности R- и S-диссоциации как частное проявление генотипической изменчивости. Ее практическое значение. Своеобразной формой мутационной изменчивости является R-S диссоциация бактерий. Она возникает спонтанно вследствие образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. Один тип - R-колонии (rough - неровный) - характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью; второй тип - S-колонии (smooth - гладкий) - имеет круглую форму, гладкую поверхность. Процесс диссоциации, т. е. расщепления бактериальных клеток, формирующих оба типа колоний, обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме, иногда через промежуточные стадии образования слизистых (М) или карликовых (Д) колоний. Обратный переход R- в S-форму наблюдается реже. Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний. Исключение составляют микобактерии туберкулеза, иерсинии чумы, сибиреязвенные бактерии и некоторые другие, которые в R-форме являются вирулентными. В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды. Мутации, которые приводят к S-R-диссоциации, относятся к инсертационным, поскольку они возникают после встраивания внехромосомных факторов наследственности - умеренных фагов, либо утери неконъюгативных крупных плазмид, которые кодируют образование детерминантных полисахаридных звеньев липополисахарида у Гр- бактерий (имеющих значение для инвазивности у шигелл Зонне, и пенетрации шигелл Флекснера в эпителиальные клетки кишечника). Утеря этих плазмид приводит к образованию R-мутантов. Они формируют шероховатые колонии, изменяют свои антигенные свойства и резко ослабляют патогенность. У дифтерийных бактерий S-R-диссоциация связана с их лизогенизацией бактериофагами. При этом R-формы образуют токсин. У других бактерий R-формы возникают после интеграции в их хромосому R-плазмиды, транспозонов или Is-последовательностей. R-формы пиогенных стрептококков и ряда других бактерий образуются в результате рекомбинаций. Биологическое значение S-R-диссоциации состоит в приобретении бактериями определенных селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. К ним относится более высокая устойчивость S-форм к фагоцитозу макрофагами, бактериоцидному действию сыворотки крови. R-формы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время сохраняются в воде, молоке. Практическое значение. S-R-диссоциация усложняет бактериологическую диагностику ряда инфекционных заболеваний, например, дизентерия Зонне, эшерихиоза, вызванного E. coli О124 и др. Цели и задачи генной инженерии. Этапы получения рекомбинантных молекул (векторы, рестриктазы). Метод рекомбинации заключается в следующем: а) выделение ДНК из разных клеток и организмов; б) получение гибридных (рекомбинантных) молекул ДНК; в) введение рекомбинантных молекул ДНК в живые клетки; г) создание условий для экспрессии секреции продуктов, кодируемых генами. Целевые гены, кодирующие те или иные структуры, выделяются из плазмид или хромосом с помощью ферментов – рестриктаз, способных резать ДНК по определенным связям или синтезируются химически. Полученный целевой ген с помощью лигаз сшивают с геном вектора (плазмиды, бактериофаги, вирусы, космиды – гибрид плазмиды с фагом). Рекомбинантная ДНК (плазмида, фаг, вирусная ДНК, космида) встраивается в микробы (E. сoli, дрожжи, вирусы и др.) или животную клетку, которая приобретает новое свойство – способность продуцировать нужные вещества (НВs-АГ вируса гепатита В, антигенов ВИЧ (р24, gp41, gp120 и др.), альфа-интерферона и др. Цель генной инженерии – получение клеток (в первую очередь бактериальных), способных в промышленных масштабах нарабатывать некоторые белки, свойственные человеку. Задача генной инженерии – активная и целенаправленная перестройка генов живых существ и их конструирование, т.е. управление наследственностью. 10. Полимерная цепная реакция (ПЦР). Назначение, ингредиенты реакции, принцип, достоинства. В основе ПЦР (метода амплификации ДНК in vitro) лежит способность однонитчатой ДНК (праймера) достраиваться и взаимодействовать по принципу комплементарности с ДНК искомого возбудителя при ее наличии в исследуемом материале. Компоненты реакции: исследуемый материал, содержащий молекулу ДНК микроорганизмов (испражнение, мокрота, выделенная чистая культура микроба и др.); праймеры – короткие искусственно синтезированные молекулы ДНК, идентичные соответствующим участкам определяемой ДНК микроба; фермент (ДНК- полимераза), обеспечивающий достраивание второй цепи ДНК; смесь нуклеотидов – строительный материал, из которого синтезируется достраиваемая ферментом цепь ДНК; Каждый цикл амплификации состоит из 3-х этапов: денатурация ДНК, находящуюся в образце. Для этого нагревают реакционную смесь при t 93-950 С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных; отжиг – присоединение праймеров и ДНК микроба, что происходит в соответствии с правилами комплементарности при t 50-65°C. элонгация – синтез второй цепи ДНК при участии полимеразы при t 72°C (рис.22). В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются. На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК определяемого микроба удваивается. Благодаря этому происходит многократное удвоение специфических фрагментов ДНК. Продукты синтеза первого цикла амплификации служат матрицей для второго цикла, а продукты синтеза второго цикла - матрицей для третьего цикла амплификации. Цикл амплификации проводится в термо-циклере (амплификаторе). Достоиннства ПЦР: высокая чувствительность и специфичность; быстрота (применяется для экспресс-диагностики); возможность идентификации труднокультивируемых микроорганизмов (внутриклеточных паразитов и персистирующих микроорганизмов); возможность определения микроорганизмов непосредственно в клиническом материале без предварительного выделения чистой культуры. Раздел 3. Микрофлора организма человека, объектов внешней среды. 1. Санитарно - показательные микроорганизмы, их характеристика. Понятие о микробном числе воды, воздуха, почвы. Коли-титр и коли-индекс воды. Санитарно-показательными называют микроорганизмы, по которым можно косвенно и с еще большей степенью вероятности судить о возможном присутствии патогенов во внешней среде. Их наличие свидетельствует о загрязнении объекта выделениями человека и животных, так как они постоянно обитают в тех же органах, что и возбудители заболеваний, и имеют общий путь выделения в окружающую среду. Например, возбудители кишечных инфекций имеют общий путь выделения (с фекалиями) с такими санитарно-показательными бактериями, как бактерии группы кишечной палочки —(в группу входят сходные по свойствам бактерии родов Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella), энтерококки, клостридии перфрингенс. Возбудители воздушно-капельных инфекций имеют общий путь выделения с бактериями (кокками), постоянно обитающими на слизистой оболочке верхних дыхательных путей, выделяющимися в окружающую среду (при кашле, чиханье, разговоре), поэтому в качестве санитарно-показательных бактерий для воздуха закрытых помещений предложены гемолитические стрептококки и золотистые стафилококки. Санитарно-показательные микроорганизмы должны отвечать следующим основным требованиям: должны обитать только в организме людей или животных и постоянно обнаруживаться в их выделениях; не должны размножаться или обитать в почве и воде; сроки их выживания и устойчивость к различным факторам после выделения из организма в окружающую среду должны быть равными или превышать таковые у патогенных микробов; их свойства должны быть типичными и легко выявляемыми для их дифференциации; методы их обнаружения и идентификации должны быть простыми, методически и экономически доступными; должны встречаться в окружающей среде в значительно больших количествах, чем патогенные микроорганизмы; в окружающей среде не должно быть близко сходных обитателей — микроорганизмов. Микробное число воды – общее количество микроорганизмов, содержащееся в 1 мл воды. Микробное число воздуха – общее количество микроорганизмов, содержащееся в 1 м3 воздуха. Микробное число почвы – общее количество микроорганизмов, содержащееся в 1 г почвы. Коли-индекс — количество особей кишечной палочки, обнаруживаемое в 1 л (для твердых тел в 1 кг) исследуемого объекта; определяется путем подсчета колоний кишечной палочки, выросших на плотной питательной среде при посеве определенного количества исследуемого материала, с последующим пересчетом на 1 л (кг). Коли-индекс — величина, пропорциональная фактическому содержанию кишечной палочки в исследуемом субстрате. Коли-титр — это наименьшее количество исследуемого материала в миллилитрах (для твердых тел — в граммах), в котором обнаружена одна кишечная палочка. Для определения коли-титра раздельно засевают на жидкие среды десятикратно уменьшающиеся объемы исследуемого материала (например, 100; 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001 мл). Для перевода коли-титра в коли-индекс следует 1000 разделить на число, выражающее коли-титр; для перевода коли-индекса в коли-титр 1000 разделить на число, выражающее коли-индекс. 2. Микрофлора почвы. Факторы, влияющие на количественный и видовой состав микробов почвы. Почва как фактор передачи инфекционных болезней. Санитарно-показательные микроорганизмы. Методы оценки санитарно-бактериологического состояния почвы. В почве живут азотфиксирующие бактерии, способные усваивать молекулярный азот (Azotobacter, Mycobacterium). Почва является местом обитания спорообразуюших палочек родов Bacillus и Clostridium. Патогенные спорообразующие палочки (возбудители сибирской язвы, ботулизма, столбняка, газовой гангрены) способны длительно сохраняться, а некоторые даже размножаться в почве (Clostridium botulinum). Кишечные бактерии (сем. Enterobacteriaceae) — кишечная палочка, возбудители брюшного тифа, сальмонеллезов, дизентерии — могут попадать в почву с фекалиями. Обнаружение их в значительных количествах является показателем загрязнения почвы фекалиями человека и животных. В почве находятся грибы, они участвуют в почвообразовании. Токсинообразующие грибы, попадая в продукты питания – вызывают интоксикацию. Состав микрофлоры почвы зависит от ее типа и состояния, состава растительности, температуры, влажности. Большинство почвенных микроорганизмов способны развиваться при нейтральном рН, высокой относительной влажности, температуре от 25 до 40℃. Общее микробное число определяют глубинным посевом (на плотной среде). Перфрингенс - титр почвы - минимальное количество почвы, в котором еще определяются Clostridium perfringens.При фекальном загрязнении почвы клостридии обнаруживают в титре 0,01 г. Определяют перфрингенс-титр глубинным посевом. Оценка фекального заражения проводится по индексу БГКП – коли-титр (количество БГКП в 1 г почвы). На свежее фекальное загрязнение указывают: обнаружение энтерококков, большое количество БГКП при отсутствии нитрифицирующих бактерий, относительно высокое содержание вегетативных форм клостридий. Титр БГКП и перфрингенс-титр для сильно загрязненных почв – 0,009; для чистых почв – коли-титр 1,0; перфрингенс-титр – 0,01. |