Экзаменационные вопросы по дисциплине Микробиология, вирусология
 Скачать 0.77 Mb.
|
|
Дыхательный аппарат бактерий состоит из мезосом — инвагинаций ЦПМ, где локализованы ферменты-оксидоредуктазы, с помощью которых происходит биологическое окисление. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют три типа образования энергии у бактерий: аэробное дыхание, анаэробное дыхание и ферментацию (брожение) Аэробный (от греч. аer — воздух и bios — жизнь) тип— окислительное фосфорилирование— совокупность процессов ферментативного распада органических веществ (реже — неорганических), происходящих с участием свободного кислорода. Процесс дыхания у аэробов протекает по типу окислительной реакции путем отщепления от субстратов водорода (или электронов). Чаще наблюдается гликолиз — процесс ферментативного расщепления углеводов. Пировиноградная кислота, образовавшаяся в результате гликолиза, окисляется в цикле трикарбоновых кислот, который снабжает аэробов предшественниками для реакций биосинтеза. Аэробное дыхание энергетически более эффективно. Образуется также много промежуточных и конечных продуктов метаболизма, которые используются для синтеза белков, углеводов, витаминов. Филогенетически аэробное дыхание возникло позже. Облигатным (строгим) аэробам для дыхания необходим молекулярный (атмосферный) кислород. Они не могут жить и размножаться в отсутствие молекулярного кислорода, используют только аэробный путь окисления (некоторые виды псевдомонад, холерный вибрион, туберкулезная палочка). Для аэробов, растущих на агаре или в тонких слоях жидкости в присутствии воздуха, кислорода вполне достаточно. В жидких средах при большом объеме жидкости аэробные бактерии могут расти только на поверхности, так как в более глубоких слоях по мере удаления от поверхности условия приближаются к анаэробным. Для нормального роста аэробных микроорганизмов в глубоких слоях жидкой культуры требуется аэрация. Микроаэрофилы(факультативные аэробы)нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода (от 0,01 до 0,03 бар). При полном доступе кислорода (в воздухе парциальное давление О2 составляет 0,2 бар) рост микроорганизмов прекращается или резко замедляется. Микроэрофилами является большинство аэробных бактерий. Капнофилы нуждаются в наличии в среде двуокиси углерода (до 10 %), так как приспособлены к более высокому, чем в воздухе, содержанию СО2. Для этого кпитательным средам добавляют бикарбонат натрия и инкубируют культуры в закрытых сосудах в атмосфере, содержащей СО3-2; можно также продувать обычный или обогащенный СО2воздух. Капнофилами являются многие патогенные бактерии. 2. Анаэробный (от греч. an — отрицание, аer — воздух и жизнь) тип—совокупность экзотермических процессов ферментативного распада органических веществ, происходящих без участия кислорода. Анаэробы получают энергию в форме АТФ путем ускоренного, но не полного окисления (субстратного фосфорилирования) углеводов, белков, липидов. Различия между облигатными аэробами и анаэробами касаются ферментативного обеспечения конечных этапов окисления. У анаэробов дегидрогеназы не связаны с мембранами и находятся в ЦП только в растворимой форме. Для переноса водорода анаэробы используют флавиновые ферменты, самоокисляющиеся кислородом воздуха. Реакция флавиновых ферментов с кислородом направлена на детоксикацию молекулярного кислорода. Поэтому содержание флавиновых дегидрогеназ в клетках анаэробов значительно выше, чем у аэробов. Анаэробный путь филогенетически более ранний, чем аэробный, но он экономически невыгоден, так как выделяется небольшое количество энергии и образуется мало метаболитов. Так как энергии выделяется мало, микроорганизмам надо использовать большое количество субстратов (сахаров, аминокислот, пуринов и пиримидинов). Многие анаэробы являются строго протеолитическими организмами, неспособными сбраживать углеводы. Протеолитическая активность у некоторых анаэробов (C. histolyticum) настолько высока, при инфекциях, вызванных этими микроорганизмами, наблюдается расплавление мышц. Другие анаэробы обладают слабовыраженной сахаролитической активностью. Анаэробы осуществляют обмен веществ и размножаются в условиях отсутствия кислорода в среде обитания. Различают облигатных, аэротолерантных и факультативных анаэробов. Облигатные (строгие) анаэробы (палочка маслянокислого брожения, возбудители столбняка, ботулизма) используют только анаэробный путь биологического окисления и размножаются только в анаэробных условиях. Они лишены ферментов супероксиддисмутазы и каталазы, защищающих микробную клетку от токсических продуктов окисления. Поэтому вегетативные формы облигатных анаэробов погибают от ядовитых концентраций перекиси водорода даже при кратковременном контакте с воздухом. Спорам облигатных анаэробов свойствен крайне выраженный анабиоз, поэтому они могут сохраняться в присутствии кислорода. Аэротолерантные микроорганизмы (молочнокислые бактерии, C. histolyticum) обладают супероксиддисмутазной активностью, но лишены каталазы и пероксидазы; они могут расти в присутствии атмосферного кислорода, но не способны его использовать; энергию получают исключительно с помощью брожения. Факультативныеанаэробы (большинство патогенных бактерий, например, Enterobacteriaceae (кишечная палочка, сальмонеллы), многие дрожжи) обладают супероксиддисмутазной и каталазной активностью. Факультативные анаэробы образуют АТФ при окислительном и субстратном фосфорилировании. Они могут изменять свой путь биологического окисления в зависимости от наличия или отсутствия кислорода. В кислородных условиях в качестве конечного акцептора водорода они используют атмосферный кислород. В бескислородных условиях в качестве конечного акцептора водорода они используют нитраты или сульфаты. 30. Рост и размножение бактерий. Фазы размножение бактерий. Рост микроорганизмов — генетически контролируемое увеличение объема и массы микробной клетки, связанное с синтезом новых веществ. Рост в применении к популяции — увеличение биомассы популяции. Стадии (фазы) роста бактериальной культуры на питательной среде. Каждая фаза роста культуры в питательной среде характеризуется определенным размером клеток, скоростью размножения и потребления субстрата, синтезом метаболитов. A —фаза задержки роста (начальная стационарная), или лаг-фаза (от англ. lag — отставание), в среднем длится 1–2 ч. Начало лаг-фазы связано с адаптацией клеток к среде обитания. Важную роль играет «предыстория» выращивания посевной культуры. Если использован инокулят из культуры с резко отличающимися условиями выращивания, то клеткам требуется время на синтез новых рибосом, РНК и адаптивных ферментов. В этом периоде увеличивается размер клеток, в 8–12 раз повышается содержание РНК. Деления клеток при этом почти не происходит. Полноценная среда, физиологически активная посевная культура, которая подготовлена к синхронному делению, способствуют короткой лаг-фазе (или ее отсутствию) переходу ко II фазе. Синхронизации можно достичь с помощью пониженной температуры, ограничения питательных веществ, фильтрации, обеспечивающей пропускание клеток определенного размера.
Синхронизация длится 2–4 генерации, а далее наступает асинхронный рост. B— короткий период положительного ускорения между фазами A и B, когда начинается деление бактерии. C— фаза логарифмического (экспоненциального) роста начинается, когда скорость роста клеток всей популяции достигает постоянной величины, средняя продолжительность ее 5–6 ч. Скорость деления клеток максимальная, но клетки имеют наименьший размер. Популяция бактериальной культуры состоит из делящихся клеток и достаточно стандартна по своим свойствам (содержание белка, нуклеиновых кислот, наиболее выраженные видовые признаки), поэтому эта фаза удобна для определения многих параметров популяции (плотность бактерий, скорости роста и потребления субстрата, содержание биополимеров клетки). В этот период отмечено снижение резистентности к агрессивным веществам. Несмотря на постоянную скорость роста популяции бактерий в логарифмической фазе, отдельные клетки все же находятся в разных стадиях деления. Иногда важно синхронизировать рост всех клеток популяции, то есть получить синхронную культуру. Простыми методами синхронизации являются изменение температурных условий или культивирование в условиях недостатка питательных веществ. Вначале культуру помещают в неоптимальные условия, затем сменяют их оптимальными. При этом у всех клеток популяции синхронизируется цикл деления, но синхронное деление клеток происходит обычно не более 3–4 циклов. D— фаза замедления скорости роста (отрицательного ускорения) длится около 2 ч. Количество питательных веществ существенно уменьшается (отмечается воздействие на бактерии лимитирующих факторов), в культуральной жидкости накапливаются метаболиты, в том числе токсичные для бактерий (отмечается ингибирующее воздействие) и скорость деления клеток снижается. E— стационарная фаза, или фаза максимальной концентрации(М–концентрация). Клетки перестают делиться. Однако, количество живых клеток постоянно, так как количество жизнеспособных бактерий соизмеримо с количеством отмирающих. В этот период клетки переходят на эндогенные субстраты (окисляют запасные вещества, белки, углеводы, липиды). Длительность стационарной фазы различается у разных микроорганизмов. Напр., у E. coli она наступает через 18–24 ч, у Azotobacter — через 72 ч с момента внесения инокулята в питательную среду. F — фаза отмирания, характеризуется массовой гибелью бактерий. В бактериальной популяции отмечается образование инволюционных форм, аутолиз под действием собственных ферментов. У бактерий меняются морфологические и биохимические свойства. Гибель может наступить через несколько дней, недель, месяцев. В эту фазу различают периоды ускоренной гибели (количество живых клеток начинает снижаться с увеличивающейся скоростью), логарифмической гибели (количество живых клеток убывает с максимальной скоростью), уменьшения скорости гибели (количество живых клеток убывает с уменьшающейся скоростью) и стационарную фазу минимума (количество живых клеток минимально). Данная динамика характерна для периодических (статических) культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов. Таким образом, неограниченный рост в закрытой от доступа дополнительных питательных веществ периодической культуре невозможен. Если в питательной среде создают условия для поддержания микроорганизмной популяции в экспоненциальной фазе — это хемостатные (непрерывные) культуры. 31. Механические способы создания анаэробных условий Механические методы удаления кислорода 1. Посев анаэробной культуры уколом в высокий столбик сахарного агара или среды Вильсон-Блера. Это наиболее простой способ. 2.Способ Виньяля-Вейона. В расплавленный и остуженный до 50°С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают. В среде вырастают ясно видимые снаружи колонии бактерий, которые можно извлечь, распилив трубку. 3. Метод Перетца. В пробирку с растопленным и остужённым до 45° сахарным агаром вносится и размешивается исследуемая культура. Смесь выливается в стерильную чашку Петри, охлаждается. На поверхность накладывается стерильное стекло. Чашку в закрытом виде помещают в термостат на 18-20 часов. Под стеклом вырастают колонии, которые извлекают, отодвинув стекло. 32. Физические методы удаления кислорода 1.Аанаэростат, из которого воздух выкачивается насосом. Можно использовать вместо анаэростата эксикатор. 2. Аппарат Киппа, где воздух заменен индифферентным газом -водородом. 3. Среде Китта-Тароцци: ( МПБ, 0,5 % глюкозы и кусочками свежих органов животных, например, печени или с мясным фаршем). Кусочки органов, а также глюкоза обладают рецидивирующими свойствами. Перед посевом её кипятят и заливают сверху стерильным вазелиновым маслом. 33. Химические методы удаления кислорода 1. Прибор Омелянского, где для поглощения кислорода используется пирогаллол. 2. Среда Вильсон – Блера (железо - сульфитный агар). Черные колонии образует C.perfringens за счет образования сульфата железа (FeS) (рис.19). Биологический метод удаления кислорода по Фортнеру В чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины, на одну половину засевают облигатный аэроб – «чудесную» палочку (S.marcescens), на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растопленным парафином. Через 24-48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, когда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы 34. Питательные среды для культивирования бактерий. Требования. Классификация. Основные требования, предъявляемые к питательным средам: Питательные среды должны содержать все необходимые для питания микроба питательные вещества, т.е. обладать питательностью. Иметь достаточную влажность Иметь оптимальную рН (7,2-7,6) кислотность среды. Обладать изотоничностью (концентрация NaCl 0,87%), для галофильных бактерий концентрация соли 1% и выше. Иметь оптимальный электронный потенциал, свидетельствующий о содержании в среде растворенного кислорода. Он должен быть высоким для аэробов и низким для анаэробов. Быть прозрачными, чтобы был виден рост бактерий, особенно в жидких средах. Быть стерильными (чтобы не было других бактерий). Для приготовления питательных сред используют продукты животного происхождения (мясо, рыба, кровь, яйца, молоко) и продукты растительного происхождения (картофель). Также используют синтетические питательные среды, составленные из химических соединений. Источником азота для бактерий служат простые аммонийные соединения, аминокислоты или пептоны; источником углерода – сахар, многоатомные спирты, органические кислоты. Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCl, КН2РО4, К2НРО4. В зависимости от консистенции питательные среды могут быть: жидкими, полужидкими и плотными. Плотность среды достигается добавлением агара. Агар - полисахарид, получаемый из водорослей. Он плавится при температуре 100℃, остывает при температуре 45-50℃. Для полужидких сред агар добавляют в концентрации 0,5%, для плотных – 1,5-2%. Жидкие среды не содержат агар-агара. По составу питательные среды могут быть простыми и сложными. К простым средам относятся пептонная вода, мясопептонный бульон, мясопептонный агар, агар Хоттингера. Сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (сахарный, сывороточный, желчный бульоны, кровяной, сывороточный, желточно-солевой агары, среда Кита-Тароцци, Вильсона-Блера). В зависимости от назначения среды подразделяются: Общего назначения – для культивирования большинства бактерий (мясопептонный агар, кровяной агар). Специального назначения: а) элективные среды – это среды, на которых растет какой-то определенный микроорганизм. Например, щелочной агар, имеющий рН 9, служит для выделения холерного вибриона. б) среды обогащения – это такие среды, которые стимулируют рост какого-то определенного микроорганизма, ингибируя рост других. Например, магниевая и селенитовая среды стимулируют рост бактерий рода сальмонелла, ингибируя рост кишечной палочки. в) дифференциально-диагностические среды служат для изучения ферментативной активности бактерий (среды Гисса). г) комбинированные питательные среды сочетают в себе элективную среду, подавляющую рост сопутствующей флоры и дифференциально-диагностическую (среда Плоскирева для выделения шигелл, висмут-сульфитный агар – для сальмонелл). Обе эти среды ингибируют рост кишечной палочки. 35. Основные питательные среды. Состав. Назначение. Универсальные (основные) среды. Эти среды используют для культивирования большинства относительно неприхотливых микроорганизмов или применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроорганизмов. К этой группе относятся: МПБ – мясо-пептонный бульон, МПА - мясо-пептонный агар, МПЖ – мясо-пептонный желатин и т.п. МПА = пептон ферментированный + экстракт мясной + NaCl +агар растут энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококк МПБ = пептон ферментированный, экстракт мясной, NaCl Голодная среда - 1% щелочная пептонная вода + NaCl МПЖ = пептон ферментированный + экстракт мясной + желатин + NaCl 36. Элективные питательные среды. Состав, назначение. Примеры. Элективные (избирательные) среды. Эти среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материала, содержащего несколько видов микробов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной. Избирательность среды достигается путем создания условий, оптимальных для культивирования определенных микробов (рН, Еh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией. Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, высокие концентрации NаСl, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. К этой группе относятся: Сывороточный мясопептонный агар – сывортка крови + МПА – сыворотка как источник белка. Является элективной для менингококков, стрептококков, пневмококков, гонококков, C.diphtiriae Висмут-сульфит агар — содержит МПА соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний черного цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают. Желточно-солевой агар (ЖСА) — МПА - питательная основа; 10%NaCl - элективный фактор; лецитин куриного желтка – дифференциальный фактор. Среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика». Желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10% желчь, одновременно тормозящая рост сопутствующих микроорганизмов. Щелочной агар или щелочная пептонная вода элективны для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов. 3-5 сут. Среда Левенштейна-Йенсена – яично-картофельно-глицериновая среда. Глицерин подавляет рост других микроорганизмов. Элективна для M.tuberculosis Среда Борде Жангу – МПА + картофельный настой. Рекомендуют для выделения культур Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis.(коклюш). 37. Дифференциально-диагностические среды. Состав, назначение. Примеры. Используют для окончательной идентификации выделенной чистой культуры методом определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические среды разделяют следующим образом: Среды для выявления протеолитической способности микробов, содержащие в своем составе молоко, желатин, кровь и т.д. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения различных сахаролитических ферментов. Примеры дифференциально-диагностических сред: |
