УММС_ОП_04_Генетика_человека_с_основами_медицинской_генетики. Фгб поу кисловодский медицинский колледж минздрава россии учебнометодические материалы для студентов
 Скачать 1.2 Mb.
|
|
Тема 8. Генеалогический и близнецовый методы изучения наследственности человека Существуют различные методы изучения наследственных болезней, главными из них являются клинико-генеалогический, близнецовый, популяционный, цитогенетический, биохимический и молекулярно- генетический. Клинико-генеалогический метод включает клиническое обследование членов семьи пациента, обратившегося за консультацией, составление ее родословной и проведение генеалогического анализа. Генеалогический анализ является самым распространенным, наиболее простым и одновременно высоко информативным методом, доступным каждому, кто интересуется своей родословной и историей своей семьи. Он не требует никаких материальных затрат и аппаратуры. Убеждены, что со временем в каждой истории болезни будет представлена родословная пациента, как обязательная часть анамнеза жизни. Родословная раскрывает медико-патологический фон семьи, по ней можно с определенной точностью судить о типе наследования патологии, о членах семьи, нуждающихся в обследовании и наблюдении врача. Во время составления родословной возникает значительно более теплый и доверительный контакт с больным и его родными, чем просто разговор о болезнях близких. Хорошо составленная родословная помогает 41 прогнозировать состояние здоровья родственников больного, их детей и будущего потомства. По хорошо составленной родословной можно получить ответы на многие вопросы. В частности, по ней можно увидеть, какие заболевания наиболее распространены в семье, и кого из ее членов нужно обследовать на генетическую предрасположенность к определенной патологии. По родословной можно определить тип наследования заболевания и выяснить, кто из членов семьи имеет высокий риск заболеть или родить подобного больного. Из этих данных вытекает выбор метода диагностики и проведения профилактических мероприятий, оказание своевременной медицинской помощи. Близнецовый метод основан на клиническом обследовании и сравнении моно- и дизиготных близнецов, воспитывающихся в одинаковых или различных условиях окружающей среды. Монозиготные близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки и имеют одинаковую наследственную конституцию. Таким образом, выявляемые между ними различия не связаны с наследственными факторами. Дизиготные близнецы развиваются из разных яйцеклеток, оплодотворенных различными сперматозоидами. Степень их генетического сходства такая же, как у обычных сибсов, но благодаря одновременному рождению и совместному воспитанию они имеют больше общих средовых факторов. Особую ценность при изучении наследственных факторов, влияющих на тип поведения, психологические или интеллектуальные особенности, представляют монозиготные близнецы, разделенные в младенческом или раннем детском возрасте и воспитывающиеся в разных условиях. С помощью близнецового метода удалось доказывать значение генетической предрасположенности ко многим широко распространенным заболеваниям. Результатом сравнения двух групп близнецов является расчет процента идентичности или конкордантности различных признаков или болезней, проявляющихся у каждого из пары близнецов. Чем больше наследственная составляющая признака или заболевания, тем выше значения конкордантности, но самое главное – больше уровень расхождения между моно- и дизиготными близнецами. Количественной оценкой доли наследственной обусловленности признака является коэффициент наследуемости (H), рассчитываемый по следующей формуле, предложенной Хольцингером: Н = (КМБ – КДБ)/(100- КДБ), где КМБ и КДБ – выраженная в процентах конкордантность признака для моно- и дизиготных близнецов соответственно. Если Н>70%, решающая роль в проявлении признака принадлежит наследственным факторам. При H<30% – средовые факторы являются основными в формировании признака. При промежуточных значениях Н предполагается примерно равное участие в контроле признака как генетических, так и средовых факторов. Например, при заболевании корью или коклюшем одного из партнеров близнецовой пары вероятность заболевания второго (конкордантность пары) 42 в группах моно и дизиготных близнецов практически одинаковая: 98% и 94% и 97% и 93%, соответственно. Преобладающая роль инфекционного фактора в данном случае очевидна. При туберкулезе вероятность заболевания второго близнеца в монозиготной паре почти в 3 раза больше, чем в дизиготной – 67% и 23 %. То есть при идентичном генотипе сходная реакция на туберкулезную инфекцию наступает чаще, чем при разных генотипах. Этот факт показывает значительную роль наследственной предрасположенности ребенка к туберкулезу, что в настоящее время очень важно иметь в виду в связи с данными об увеличении распространенности туберкулеза. Тема 9. Составление и анализ родословных схем Родословная раскрывает медико-патологический фон семьи, по ней можно с определенной точностью судить о типе наследования патологии, о членах семьи, нуждающихся в обследовании и наблюдении врача. Во время составления родословной возникает значительно более теплый и доверительный контакт с больным и его родными, чем просто разговор о болезнях близких. Хорошо составленная родословная помогает прогнозировать состояние здоровья родственников больного, их детей и будущего потомства. Основателем генеалогического метода изучения наследственности считается немецкий историк О. Лоренц, опубликовавший в 1898 году учебник генеалогии, в котором рассматриваются закономерности происхождения различных семейных заболеваний. В этом учебнике генеалогия рассматривается не как отрасль исторических знаний, а как самостоятельная наука, доставляющая обильный материал для биологии, психологии, психиатрии и др., и имеющая свои задачи по установлению закономерностей в смене поколений. В 1912 году американский евгенический институт выпустил образцы прямолинейных родословных 43 таблиц, которые применяются до настоящего времени, не претерпев практически никаких изменений. Лицо, с которого начинается исследование родословной называется пробанд, и далеко не во всех случаях это бывает больной, особенно в детской практике. Родословную лучше всего рисовать на большом листе бумаги, разлинованным по горизонтали. На одной линии должны быть размещены все родственники, относящиеся к одному поколению. Поколения обозначают римскими цифрами, а отдельных членов каждого поколения – арабскими. В этом случае каждый член семьи будет иметь свой индивидуальный номер из одной римской и одной арабской цифры. Необходимо указывать возраст всех членов родословной, так как разные заболевания проявляются в разные возрастные периоды жизни, и отмечать лично обследованных знаком «!». Более подробные объяснения к родословной называют легендой, их обычно записывают на отдельных карточках. По хорошо составленной родословной можно получить ответы на многие вопросы. В частности, по ней можно увидеть, какие заболевания наиболее распространены в семье, и кого из ее членов нужно обследовать на генетическую предрасположенность к определенной патологии. По родословной можно определить тип наследования заболевания и выяснить, кто из членов семьи имеет высокий риск заболеть или родить подобного больного. Из этих данных вытекает выбор метода диагностики и проведения профилактических мероприятий, оказание своевременной медицинской помощи. Использование клинико-генеалогического метода предполагает тщательное клиническое обследование максимального количества членов родословной с целью выявления стертых и атипичных признаков заболевания. Сбор анамнестических данных проводят по определенной схеме. Сведения о пробанде, данные о сибсах и родителях пробанда, сведенья о родственниках со стороны матери и со стороны отца записываются в медико-генетическую карту. Очень важен при этом акушерский анамнез женщин – как протекала и на каком фоне наступила беременность, подробности о спонтанных абортах, мертворождениях, наличии бесплодных браков и ранней детской смертности. Необходимо учитывать также наличие и характер профессиональных вредностей, факторов, влияющих на патологию плода (прием лекарственных препаратов, заболевания матери и т.д.). Родословная семьи может быть хорошим подспорьем для молодых ее членов в решении социально-профессиональных вопросов. «Создание и накопление «историй жизни» и «семейных хроник» есть задача не только гуманитарно-научная, но и общекультурная», - считает петербургский социолог А.Н.Алексеев. Причем, добавляет ученый: «Всякая «история жизни», для какой бы цели она ни создавалась, должна включать генеалогическую информацию – столь подробную, насколько это под силу автору данной истории. Семейные хроники строятся на четком определении 44 степеней родства, желательно построение генеалогического древа, что требует минимального обучения». Владимир Набоков в автобиографическом романе «Другие берега» пишет: «Восемнадцати лет покинув Петербург, был слишком молод в России, чтобы проявить какое-либо любопытство к моей родословной; теперь я жалею об этом – из соображений технических: при отчетливой личной памяти неотчетливость семейной отражается на равновесии слов». Тема 10. Цитогенетический, биохимический и популяционно-статистический методы изучения наследственности человека Популяционно-статистический метод. Популяционный метод направлен на изучение частот аллелей и генотипов в различных популяциях, а также факторов, влияющих на их динамику. Этот метод особенно важен при проведении эпидемиологических исследований. Генетическое изучение популяций человека невозможно без учета географических и климатических условий. Но особенно важны демографмческие характеристики популяции, такие как численность, рождаемость, смертность, возрастная и социальная структура, национальный состав, религиозная принадлежность, образ жизни, особенности питания, наличие вредных привычек и др. Наследственные заболевания в разных популяциях, этнических группах и расах встречаются с 45 разными частотами, и это обусловлено различиями в частотах и спектрах мутаций. Анализ соответствия распределения частот аллелей и генотипов в различных популяциях закону Харди-Вайнберга позволяет судить о том, является ли популяция панмиктической, то есть соблюдается ли в ней принцип случайности скрещивания вне зависимости от генотипов особей. Важными практическими задачами являются анализ спектров и частот распределения в отдельных популяциях мутантных аллелей, ассоциированных с определенными наследственными заболеваниями, и выявление среди них мажорных мутаций. Цитогенетический метод. Цитогенетический метод применяется для анализа кариотипа и его аномалий у отдельных индивидуумов. Для проведения исследования достаточно получить образец периферической крови пациента объемом 1-2 мл. Анализ кариотипа проводят в три этапа: культивирование лимфоцитов крови, окраска препарата и его микроскопический анализ. Культивирование проводят для того, чтобы стимулировать деление лимфоцитов, так как успех цитогенетического исследования зависит от количества клеток, находящихся на стадии метафазы, когда хромосомы находятся в наиболее компактной форме. Продолжительность культивирования обычно составляет 72 часа. Для увеличения количества метафазных клеток в конце культивирования в среду вводят колхицин, который приостанавливает деление на стадии метафазы, разрушает веретено деления и увеличивает конденсацию хромосом. Далее клетки помещают в гипотонический раствор, который приводит к разрыву ядерной оболочки и свободному перемещению хромосом в цитоплазме. На следующем этапе клетки фиксируют смесью этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1, их суспензию раскапывают на предметные стекла и высушивают. В зависимости от целей кариотипирования используют различные методы дифференциального окрашивания хромосом (G-, R-, C-, Q-методы). Процедура окрашивания занимает несколько минут и приводит к появлению рисунка поперечной исчерченности, специфичного для каждой хромосомы. Световое микроскопирование окрашенных препаратов является самым трудоемким этапом всего исследования, требующим высокой квалификации. Для выявления хромосомных аномалий необходимо проанализировать не менее 30 метафазных пластинок. Большой эффективностью обладают методы компьютерного анализа хромосом. Внедрение молекулярных технологий в сочетании с использованием флюоресцентных окрасок резко увеличивает разрешающую способность цитогенетического анализа. При этом отдельные сегменты хромосом могут быть окрашены в разные цвета, а кариотипы в целом выглядят как фантастические удивительно красочные картины. Разработаны также методы окрашивания хромосом в клетках, находящихся в состоянии покоя, когда 46 хромосомы максимально растянуты. С их помощью могут быть идентифицированы сегменты хромосом размером около 50 килобаз. Биохимический, иммунологический и микробиологический методы. Биохимический и иммунологический методы основаны на анализе различных классов органических и неорганических соединений, дефектных при разных наследственных заболеваниях, в первую очередь, при наследственных болезнях обмена. Биохимические нарушения, как правило, предшествуют появлению клинических симптомов заболевания и являются по сравнению с ними более константными. Предметом биохимической диагностики могут быть белки, аминокислоты, углеводы, липиды, ионы металлов и др., а также их метаболиты. При этом исследовать можно разные ткани и секреты организма (кровь, моча, слюна, пот, ликвор, амниотическая жидкость, биоптаты мышц, кожи, печени и других специализированных тканей). Биохимические методы играют первостепенную роль в диагностике наследственных нарушений обмена веществ. В некоторых случаях они позволяют выявлять гетерозиготных носителей мутаций. Очень важна роль биохимических методов анализа при проведении массовых скринингов беременных или новорожденных с целью более раннего выявления наследственных заболеваний. Ключевая роль в патогенезе любого моногенного заболевания принадлежит первичному биохимическому дефекту – тому белку, который кодируется мутантным геном. Идентификация и анализ первичного биохимического дефекта, определение первичной патологической метаболической цепи – вот главные цели биохимической генетики, решение которых является основой для разработки патогенетических методов профилактики и терапии наследственных заболеваний. Не менее важна роль биохимических методов при диагностике вторичных нарушений. Например, первичным биохимическим дефектом при мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера является недостаточность дистрофина – белка, соединяющего цитоскелет мышечной клетки с внеклеточным матриксом. В результате этого нарушения в крови больных повышается уровень одного из мышечных ферментов креатинфосфокиназы, как в начале заболевания, так и в его развернутой стадии. Более того, содержание этого фермента повышено у 30% гетерозиготных носительниц мутации. Хотя это нарушение является вторичным, но простата тестирования креатинфосфокиназы и стойкость его повышения у больных делают его удобным диагностическим маркером заболевания. Разнообразие биохимических методов огромно, и они постоянно совершенствуются. Их подразделяют на качественные, количественные и полуколичественные. Качественные реакции позволяют обнаруживать избыточное количество промежуточных метаболитов, накапливающихся при наследственных болезнях обмена в результате блока ферментативной реакции. Они просты, недороги и достаточно чувствительны. Часто в качестве субстрата для качественной реакции используется моча. 47 Полуколичественные и количественные тесты проводятся как с мочей, так и с кровью. Наиболее простые из них измерение пирувата, лактата, ионов аммония, измерение кислотно-щелочного баланса. Ведущая роль в диагностике наследственных болезней обмена принадлежит высокоточным количественным тестам, использующим методы флуориметрии, спектрофотометрии, хромотографии, электрофореза, масс-спектрометрии. Некоторые методы позволяют одновременно проводить количественную оценку нескольких тысяч метаболических маркеров. Однако эти методы требуют использования достаточно дорогого оборудования и расходных материалов. В некоторых случаях иммунологические методы анализа белков оказываются более эффективными по сравнению с биохимическими. Среди них следует упомянуть иммуногистохимический метод, позволяющий проводить анализ белков и определять их локализацию в специализированных клетках и тканях организма. Иммунологические методы применяют при обследовании больных с иммунодефицитными состояниями (агаммаглобулинемия, атаксия-телеангиэктазия-синдром Луи- Бар и др.), при подозрении на антигенную несовместимость крови матери и плода, при установлении отцовства. Микробиологические методы используются для анализа присутствия в биологическом образце определенных веществ – аминокислот, сахаров и др., необходимых для роста определенных штаммов микроорганизмов. Этот метод лежит в основе известного теста Гатри, применяемого при диагностике фенилкетонурии, гистидинемии, галактоземии и лейциноза. Молекулярно-генетический метод. Молекулярно-генетический метод основан на анализе нуклеиновых кислот, в первую очередь, молекул ДНК. Основной целью этих методов является диагностика мутаций, исследование их ассоциации с наследственными заболеваниями, а также выявление гетерозиготных и гомозиготных носителей мутации. По-существу, молекулярная диагностика является наиболее объективным методом верификации наследственных заболеваний. Важно подчеркнуть, что нахождение мутаций в гомозиготном или гетерозиготном состояниях соответственно при рецессивных или доминантных заболеваниях является бесспорным подтверждением диагноза. Однако в тех случаях, когда мутации не удается обнаружить, решающее заключение при постановке диагноза сохраняется за клиницистом, так как используемые на практике методы молекулярной диагностики чаще всего не позволяют идентифицировать все возможные мутации в исследуемом гене. Внедрению молекулярно-генетической методологии в клиническую практику способствовала разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) или специфической амплификации ДНК, произошедшая более 20 лет назад. Первооткрыватель этого метода Керри Мулис за свое изобретение был удостоен Нобелевской премии в 1993 году. Метод ПЦР позволяет тестировать состояния генов у отдельных индивидуумов. Его суть 48 заключается в избирательном копировании in vitro небольшого фрагмента гена, в котором предположительно может быть локализована мутация, с использованием в качестве матрицы геномной ДНК обследуемого. Небольшие размеры копируемого (или амплифицируемого) фрагмента гена в сочетании с их огромным числом позволяют в дальнейшем использовать очень простые методы для анализа этого участка ДНК, выявления его особенностей у обследуемого пациента. Главными из этих методов являются электрофорез амплифицированной ДНК, ее окрашивание, разрезание специфическими ферментами – рестриктазами, и определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента - секвенирование. ПЦР лежит в основе ДНК-диагностики любых наследственных заболеваний. Данный подход широко используется и для анализа генетических факторов риска, предрасполагающих к развитию широко распространенных мультифакториальных заболеваний. В случае молекулярной диагностики инфекций амплифицируется фрагмент ДНК, специфичный для определенного возбудителя, а затем с помощью электрофореза и окрашивания на ДНК тестируется наличие этого фрагмента, а значит и самого возбудителя, в том биологическом образце, который был взят для анализа. Использование ПЦР в судебной медицине основано на амплификации высоко изменчивых областей генома, позволяющих проводить идентификацию личности – метод геномной дактилоскопии. Преимуществом ДНК-диагностики по сравнению с биохимической или иммунологической диагностикой является использование унифицированного набора методов, практически не зависящего от целей проводимого исследования. Это методы выделения ДНК, ПЦР, электрофорез, рестрикция ДНК, гибридизация со специфическими ДНК-зондами и секвенирование. Таким образом, в пределах одной лаборатории можно заниматься ДНК- диагностикой широкого спектра заболеваний. |