Щитовидная железа. Фундаментальные аспекты. Кубарко А.И.. Фундаментальные аспекты щитовиднаяжелезафундаментальные аспекты
 Скачать 21.52 Mb.
|
|
Рис. 5.1. Внутри- и внеклеточные потоки стероидных гормонов Механизмы действия тиреоидных гормонов Рис. 5.2. Схематическое представление распределения фракций гормона при прохождении через орган-мишень. Рис. 5.3. Распределение транскапиллярных потоков тиреоидных гормонов (пмоль) в печени человека за 10 с (137,5 мл крови) при эутиреоидном состоянии. Т - период времени в сек, в течение которого 1/2 количества гормона диссоциирует из связи с транспортными белками при Си- содержание тиреоидных гормонов во внеклеточной жидкости в пмоль/137,5 мл. Поглощение Т клетками в значительной степени определяется уровнем внутриклеточного АТФ. Скорость поступления Т в клетку может Механизмы действия тиреоидных гормонов 137 даже уменьшаться при больших концентрациях Т. Ограниченность объемов Т, которые могут поглощаться клетками, имеет место также для культур фибробластов и гипофиза (ноу крыс in vivo для гипофиза это не подтверждено. Предполагается существование специального транспортного энергозависимого механизма (переносчика) тиреоидных гормонов, и специального насосного механизма, транспортирующего гормон между цитозолем и ядром, а также активного транспорта Т в ядро. Уже примерно через 3-4 часа после введения Т и через 10 мин после введения [ 14 С]-меченной оротовой кислоты тиреоидэктомированным крысам, было зарегистрировано усиление включения Св ядерную РНК Общая характеристика семейства ядерных рецепторов Ядерные рецепторы гормонов и ряда других биологически активных веществ представлены семейством негистоновых белков, связанных с хроматином ядра клетки и включают рецепторы стероидных гормонов (эстрогенов, прогестагенов, андрогенов, глюкокортикоидов, минералокортикоидов, витамина D, экдистероидов), тиреоидных гормонов, ретиноидов, а также другие рецептор-подобные молекулы (так называемые рецепторы, лиганды которых в настоящее время полностью не описаны (рис. 5.4). В отличие от рецепторов пептидных гормонов, локализованных на поверхности плазматической мембраны и требующих наличия второго посредника для реализации своих клеточных эффектов, ядерные рецепторы, как это следует из их названия, располагаются в ядре клетки и по лиганд-зависимому механизму действуют как кофакторы (коактиваторы или корепрессоры) транскрипционных факторов, регулируя экспрессию генов, промотор которых содержит чувствительный к действию регулятора элемент. Низкомолекулярные биорегуляторы, действие которых опосредовано связыванием со специфическим рецептором в клеточном ядре, таким образом управляют ключевыми для жизнедеятельности клетки молекулярными процессами — синтезом ферментов, белков- переносчиков и других белков (то есть метаболизмом, трансмембранным переносом и др, клеточным циклом (то есть процессами деления, роста и дифференцировки клетки) и многими другими тонкими процессами, которые составляют самую сущность самоподдержания и самообновления клеточной системы. В результате клетки тканей и органов организма получают способность адресно перепрограммировать транскрипционную активность своих генов, координированно отвечая на действие средовых и внутренних стимулов. Отдельные клетки (клетки-мишени) отличаются по своей чувствительности к действию специфического регулятора, что может быть связано, например, с преимущественным распределением того или иного подтипа рецепторов либо количественными различиями в суммарной аффинности (связывающей способности) рецепторов Механизмы действия тиреоидных гормонов Рис. 5.4. Схематическое представление суперсемейства ядерных рецепторов и их лигандов. На верхней схеме показаны 6 функциональных доменов в общей организации рецептора А/В, F - модулирующие участки, С - ДНК-связывающий домен, D - связывающий домен, Е - лиганд-связывающий домен. Показаны высоко консервативные последовательности, линиями отмечены вариабельные участки. Обозначения: ER - эстрогены, PR - прогестагены, GR - глюкокортикоиды, MR - минералокортикоиды, AR - андрогены, Vit D3 витамин D3, RAR - ретиноевая кислота, TR - тиреоидные гормоны. (Собственность prof. Первичная структура большинства ядерных рецепторов была установлена путем секвенирования их соответствующих кДНК (см. рис. Хотя различия в аминокислотной последовательности белковых молекул рецепторов обнаруживаются, начиная с 427 аминокислотного остатка рецептора витамина D до 984 остатка рецептора минералокортикоидных гормонов, общие черты структурной организации присущи всем ядерным рецепторам, что дало повод объединить их водно семейство. В структуре всех внутриклеточных рецепторов присутствует ДНК-связывающий домен размером аминокислотных остатков (Сна рис. 5.4), который обнаруживает высокую степень гомологии с другими членами семейства, а также лиганд-связывающий домен (Е) вариабельного размера и низкой степенью гомологии, который определяет специфичность связывания низкомолекулярного регулятора. ДНК-связывающий фрагмент содержит два так называемых цинковых пальца (zinc figgers) - петлевидные структуры, образованные остатками цистеина и глицина, соединенными координационными связями с хелат-ионом цинка. Роль цинковых Механизмы действия тиреоидных гормонов 139 пальцев» состоит в специфическом распознавании и связывании чувствительного элемента определенного гена, как правило, в главном желобке молекулы ДНК (рис. При воздействии на клетки-мишени стероидным гормоном (например, кортизолом) в условиях in vivo или in vitro образуется два различных комплекса стероид-рецептор. Незначительная фракция меченного гормона обнаруживается в супернатанте или цитозольной фракции гомогената тканей, тогда как большая часть инкорпорированного стероида связана с белком в ядерной фракции и освобождается лишь при дополнительном экстрагирующем воздействии. Показательно, что ассоциация гормон-рецепторного комплекса с компонентами ядерной фракции (те. ДНК) прочнее, чем свободного рецептора. Существенное отличие в связывании тиреоидных гормонов и ретиноевой кислоты состоит в распределении гормон-рецепторного комплекса лишь в ядерной фракции, что подробно рассматривается далее. Рис. 5.5. Схематическое представление структуры цинкового пальца и сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ДНК- связывающих доменов различных представителей суперсемейства ядерных рецепторов. Каждый цинковый палец стабилизирован хелатными связями х остатков цистеина с ионом цинка ив итоге образует тетраэдрический комплекс. Альтернативные координационные положения показаны на рис. справа, где видно укорочение пальца с отделением последнего остатка цистеина в так называемый «трейлерный» участок. Последующими исследованиями было достоверно доказано, что индуцируемая лигандом/гормоном трансформация нативного рецептора Механизмы действия тиреоидных гормонов присуща рецепторам всех классов стероидных гормонов, ноне тиреоидным гормонам. Трансформация рецептора эстрогенов сопровождается также увеличением константы седиментации, что связано с димеризацией рецептора. Хотя трансформация рецептора необязательно сопровождается его спонтанной димеризацией, установлено, что рецепторы прогестагенов, глюкокортикоидов и тиреоидных гормонов взаимодействуют с чувствительными последовательностями ДНК ядра в димеризованной форме. Оказалось также, что трансформация и димеризация рецепторов стероидных гормонов нередко может протекать с большей скоростью через стадию уменьшения K s . Этот феномен получил объяснение после описания взаимодействия нативного рецептора с белками теплового шока - разновидностью клеточных chaperon'ов (белков, которые способствуют стабилизации ной структуры мРНК и ряда белков и синтезируются в ответ на предъявление клетке чрезвычайных стимулов. Возможно, что ы занимают участок связывания рецептора с чувствительной нуклеотидной последовательностью и освобождают его при трансформации в необычных внутриклеточных условиях (например, в присутствии эндогенных анионов металлов или аминофосфоглицерола). Освобождение места связывания наступает при реакции стероида с анионным центром или в результате индукции аутопротеолитической активности в белках теплового шока. Точное значение этих взаимодействий остается пока неизвестным, хотя можно предполагать их усиливающую и/или разрешающую роль. Во всех случаях ядерный комплекс может быть дифференцирован от цитозольного по связывающей способности (константе ассоциации) с ядерной фракцией, хроматином, ДНК и полианионами, например, фосфоцеллюлозой. При изучении взаимосвязи между ядерной и цитозольной формами рецепторов стероидных гормонов было показано, что связывание эстрадиол-рецепторного комплекса ядрами клеток-мишеней является опосредованным двухстадийным процессом с первичным образованием цитозольного комплекса. Цитозольный связывающий белок является не только переносчиком активной формы гормона в ядро, но и сам при ядерной транслокации становится активным ядерным рецептором Механизмы действия тиреоидных гормонов 141 Рис. 5.6. Сравнительный структурно-функциональный анализ аминокислотных последовательностей ядерных рецепторов. (+) и (обозначает соответственно отсутствие и присутствие свойства у ресинтезированного на основе кДНК белка. HRE - гормон-чувствительный элемент ДНК. Видовая специфичность обозначена h - человек, r - крыса - мышь, с - цыпленок, d - дрозофилла. Ряд исследований показал, что рецепторы тиреоидных гормонов после их синтеза подвергаются транслокации в ядро и перманентно существует в ДНК-связанной форме (без связи с белками теплового шока) и, таким образом, не претерпевают лиганд-индуцированной трансформации. Также не обнаружено цитозольной формы рецепторов тиреоидных гормонов и ретиноевой кислоты. Клетки чувствительных к действию ретиноевой кислоты тканей содержат так называемый клеточный связывающий белок, CRABP, который может служить цитозольным переносчиком гормона. Современное прочтение теории двухстадийной активации рецепторов стероидных гормонов заключается в дискуссионности вопроса о присутствии цитозольного рецептора и необходимости его трансформации и транслокации в ядро. Большинство исследователей разделяет мнение о валидности двухстадийной активации рецептора. Спорным остается положение о цитоплазменно-ядерном равновесии распределения рецепторов сам механизм транслокации. Ядерные рецепторы тиреоидных гормонов Хотя предположение о реализации эффектов тиреоидных гормонов через связывание с ядерными рецепторами впервые было выдвинуто еще в 1967 году, первые попытки продемонстрировать наличие специфических клеточных рецепторов оказались неудачными. Лишь в году в серии экспериментов, проведенных в лаборатории, было убедительно доказано наличие высокоаффинных, Механизмы действия тиреоидных гормонов обладающих низкой емкостью (быстро насыщаемых) связывающих мест трийодтиронина (Т) в ядрах клеток печении почек. Этот результат был получен в эксперименте на интактных крысах после внутривенного введения следовых доз Т с последующей инъекцией прогрессивно возрастающих количеств немеченного трийодтиронина. После декапитации ткани животных были подвергнуты субклеточному фракционированию. Детальное изучение фракций клеток печени выявило специфическое связывание меченного лиганда только в ядерной фракции. Последующие исследования показали, что специфические места связывания принадлежат негистоновым белкам хроматина. Затем были установлены закономерности равновесия Т 3 между ядерными цитоплазматическим пулами и аналогичное ядрам клеток печени связывание Т было обнаружено в клетках мозга, почек, селезенки и гипофиза. Специфическое связывание Т ядерным рецептором было подтверждено не только исследованиями конкурентного замещения лиганда in vivo, но ив культуре клеток и изолированных ядрах печени in vitro, обнаружив при этом поразительное сходство. В настоящее время установлено, что рецепторы тиреоидных гормонов представляют собой негистоновые белки, связывающие тиреоидные гормоны с высокой аффинностью (Kd = 10 -10 -10 -11 Ми специфичностью. В общем случае, месту связывания лиганда могут быть приписаны характеристики специфического ядерного рецептора при выполнении следующих обязательных условий- высокое сродство и низкая емкость связывания лиганда- обнаружение во всех тканях, отвечающих на действие гормона- сходные физико-химические характеристики выделенных из различных источников рецепторов- биологический ответ, иницируемый связыванием лиганда, развивается в зависимости от числа занятых ядерных рецепторов- короткий промежуток времени между связыванием лиганда и изменением транскрипционной активности чувствительных промоторов- наличие корреляция между действием структурных аналогов и их связыванием с ядерными рецепторами. С этой точки зрения важно обратить внимание на зависимость биологического действия тиреоидных гормонов от позиции йодирования в фенольном кольце наличие атома йода в положении 3' дает более выраженный эффект, чем йодирование в обоих 3' и 5' позициях. Т и рТ 3 по сравнению с Т проявляют меньшую тиромиметическую активность, а их связывание с рецептором враз менее аффинно, чем Т 3 Гипотеза, объясняющая генетические механизмы действия тиреоидных гормонов основывается наследующих общих положениях) гормональный эффект определяется исключительно числом занятых ядерных мест связанных рецепторов и продолжительностью связывания Механизмы действия тиреоидных гормонов) биологический ответ зависит от уровня специфических мРНК, синтез которых индуцируется при связывания тиреоидных гормонов ядерными рецепторами) характеристики лиганд-рецепторного взаимодействия аналогичны во всех тканях, отвечающих на действие тиреоидных гормонов. Клетки большинства тканей содержат приблизительно рецепторов в своих ядрах, в меньших количествах рецепторы находятся в селезенке и яичках. Сравнительная аффинность рецепторов убывает в ряду Триак > Т > Т >> рТ 3 . Группа тиреоидных рецепторов гетерогенна по своему составу и включает изоформы с М кДа и Ks 3,5, которые образуются в результате посттрансляционной модификации либо внутриклеточной деградации молекул. Наличие рецепторов тиреоидных гормонов установлено у всех представителей позвоночных. У человека наиболее изученными являются рецепторы тканей мозга (гипофиза, печении сердца. Важно отметить также тот факт зависимости выраженности действия тиреоидных гормонов от числа занятых рецепторов и снижение числа рецепторов (и общего связывания ядерной фракцией) в клетках тканей, не отвечающих на действие тиреоидных гормонов. Структура кДНК, кодирующих рецепторы тиреоидных гормонов и их синтез были осуществлены в 1986 году. В результате этих исследований оказалось, что протоонкоген А, который является клеточным гомологом онкогена v-erbA (выделен из вируса эритробластоза птиц, кодирует синтез белка, способного связывать тиреоидные гормоны. Затем соответствующие кДНК были выделены из плаценты человека и куриного эмбриона. Анализ аминокислотных последовательностей белков установил их принадлежность к суперсемейству ядерных рецепторов стероидных гормонов. N-конец белковой молекулы содержит участок размером приблизительно 70 аминокислотных остатков, в котором содержится формирующая структуру цинковых пальцев последовательность для связи с соответствующим участком ДНК. Карбокси-терминальный конец содержит участок связывания с лигандом (рис. 5.7). Ресинтезированные на основе полученных кДНК in vitro белковые молекулы связывали тиреоидные гормоны со сходными кинетическими и термодинамическими характеристиками. Кодируемый протоонкогеном А белок структурно гомологичен рецепторам тиреоидных гормонов, хотя трансактивация им чувствительных элементов генома не доказана (рис. Рис. 5.7. Функциональные домены рецепторов тиреоидных гормонов Механизмы действия тиреоидных гормонов Рис. 5.8. Ядерные рецепторы гепатоцитов крысы. Показана сравнительная характеристика функциональных свойств и структурная гомология различных доменов. Сравнение рецепторов, выделенных из тканей цыпленка и человека, показало их гомологию, ноне идентичность, что привело к предположению о существовании множественных форм рецепторов тиреоидных гормонов и, соответственно, кодирующих их синтез генов. У человека c-erbA локализуется в двух хромосомах - ей (3р22-3р24.1) и 17-ой (7q11.2-17q21). Формы, выделенные из тканей человека, стали обозначать как β, а из тканей цыпленка - α соответственно. Вскоре гомологичный форме рецептор был выделен из ядер клеток мозга и получил название А или форма. мРНК формы оказалась широко распространенной как в ткани мозга, таки в других органах. В 1987-88 годах из тканей человека (почки и яички) выделена мРНК другой изоформы, АТ или А, которая обнаруживала различия в кодирующем конце. Первоначальные исследования показали возможность формы рецептора также связывать тиреоидные гормоны, но со значительно меньшей аффинностью в сравнении си формами. Однако, это наблюдение не нашло подтверждения в дальнейшем (рис. 5.9). Механизмы действия тиреоидных гормонов 145 Рис. 5.9. Сравнение гомологичных доменов различных форм рецепторов тиреоидных гормонов. Числами обозначен процент подобия каждой формы к приведенной сверху. А - сравнение α1-изоформ, В - сравнение β- изоформ, С - сравнение α1 и β1 форм. Вскоре в результате использования методов котрансфекции был продемонстрирован трансактивирующий эффект формы рецепторов, реализуемый через чувствительный элемент гена гормона роста крысы. Эти данные подтвердили функциональную активность с- А рецепторов. мРНК, кодирующие синтез различных форм рецепторов, были выделены из ядер гепатоцитов, нейронов мозга, миоцитов сердца и других тканей. В 1989 выделена и охарактеризована форма, которая обладает способностью связывать ДНК, тиреоидные гормоны и вызывать трансактивацию генов-мишеней. Оказалось также, что мРНК β2-формы представлена, главным образом, в ткани гипофиза, а тиреоидные гормоны негативно регулируют ее содержание. Негативная регуляция аналогична таковой для α1- и форм, но более выражена, что весьма поразительно в сравнении с исключительно положительной регуляцией тиреоидными гормонами содержания мРНК β1 изоформы в тех же клетках. Данные сравнительного анализа изоформ рецепторов тиреоидных гормонов суммированы на рис. 5.10: Механизмы действия тиреоидных гормонов |