Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с

• Название: Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
• Анкор: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 9.74 Mb.
• Имя файла: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Тип: Документы; #189
• страница: 16 из 88

120             ГЛАВА 6

tac- Промотор: функциональный гибрид, полученный из trp- и lac- промоторов H. A. DeBoer, L J. Comstock, M. Yasser Proc. Nail. Acad. Sa. USA 80: 21-25, 1983

Приступая   к   конструированию laс-промотора, Де Боер и его коллеги ставили своей целью создание на основе двух разных сильных  регулируемых   промоторов еще более сильного промотора, способного обеспечивать высокий уровень экспрессии чужеродных белков. Когда они начинали свои исследования, нуклеотидные последовательности большинства прока риотических промоторов, в первую очередь Е. coli, были уже установлены, однако конкретные свойства,  обусловливающие  их эффективность, оставались неизвестными.  Было показано, что почти все мутации, влияющие на силу промотора, локализуются в —10- или в -35-областях (находя-шихся на расстоянии 10 или соответственно 35 п. н. до точки инициации транскрипции). Бо-

лее того, силу промотора увеличивали только те мутации, в результате которых нуклеотидные последовательности указанных областей приближались к   консенсусным:  5'-ТАТААТ-3' для -10 и 5'-ТТСАСА-3' для -35 соответственно. Эти последовательности были получены в результате сравнения нуклестидных последовательностей всех известных промоторов  и  идентификации наиболее часто встречающихся нуклеотидов. Де Боеру было известно, что у промотора lacUV5, более сильного варианта lac-промотора, — 10-область имеет кон-сенсусную нуклеотидную последовательность,   а   — 35-область — нет, а у trр-промотора, в норме контролирующего    транскрипцию генов, которые отвечают за биосинтез триптофана, ситуация

как раз обратная. Он и его коллеги решили сконструировать химерный промотор, у которого —10-область происходила бы от lac- промотора, а —35 — от промотора trр. Этот новый, так называемый taс-промотор был проверен на способность контролировать синтез фермента галактокиназы E. coli по сравнению с lac- и trp-промоторами в таких же условиях. Как и ожидалось, lac-промотор оказался гораздо более сильным — примерно в 5 раз по сравнению с промотором trpи в 10 — по сравнению с lac. Кроме того, laс-промотор, как и lac, реагировал на lас-репрессор и активировался под действием ИПТГ.  Таким  образом,  новый промотор был не только более сильным, но и регулируемым.

последовательность из шести-восьми нуклеотидов (например, UAAGGAGG), спаривающаяся с комплементарной последовательностью (в данном случае AUUCCUCC) РНК-компонента (рРНК) малой субъединицы рибосомы. Обычно чем прочнее связывание между мРНК и рРНК, тем выше эффективность инициации трансляции. Именно поэтому большинство экспресси-рующих Е. сoli-векторов конструируют таким образом, чтобы мРНК клонированного гена обязательно содержала сильный сайт связывания рибосомы. Это необходимое условие трансляции гетерологичных про- и эукариотических генов в E. coli. Однако должны соблюдаться и некоторые другие условия. Во-первых, нуклеотидная последовательность, связывающаяся с рРНК, должна находиться на определенном расстоянии от старт-кодона клонированного гена (в РНК старт-кодоном является AUG; в ДНК ему соответствует кодон ATG). Во-вторых, участок ДНК, содержащий сайт связывания рибосомы и несколько первых кодонов клонированного гена, не должен иметь такую нуклеотидную последовательность, при которой после транскрипции может произойти вну-трицепочечное спаривание (рис. 6.13), нарушающее связывание мРНК с рибосомой. Именно локальная вторичная структура мРНК, обеспечивающая экранирование или, напротив, экспонирование сайта связывания рибосомы, и определяет прочность связывания мРНК с комплементарной рРНК. Таким образом, при клонировании любого гена важно убедиться в том, что сайт связывания рибосомы расположен на нужном расстоянии от этого гена и что вторичная структура мРНК не помешает его присоединению к рибосоме.

Уже создано большое количество векторных систем, которые включают как транскрипционный, так и трансляционный сигналы, обеспечивающие экспрессию клонированных эукариотических генов в E. coli. Одной из таких систем

Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах            121

Рис. 6.14. Экспрессирующий вектор на основе плазмиды рКК233-2 (без соблюдения масштаба). Он содержит ген устойчивости к ампициллину (Ampr), являющийся  селективным  маркером,  lас-промотор (р(ас), lacZ-участок связывания рибосомы (rbs), три сайта для рестрицирующих эндонуклеаз (NcoI, PsAIи HindIII) и два сайта терминаиии транскрипции (Т1 и Т2). Стрелка — направление транскрипции.

является экспрессирующий вектор рКК233-2,

содержащий следующие элементы (рис. 6.14):

•   селективный маркер устойчивости к ампициллину

•   tec-промотор

•   lacZ-участок связывания рибосомы

•   старт-кодон ATG, расположенный на расстоянии восьми нуклеотидов от сайта связывания рибосомы

•   сайты терминации транскрипции Т1 и Т2 фага λ.

Клонируемый ген встраивают в NcoI-, PstI-или HindIII-сайт, расположенный между сайтом связывания рибосомы и сайтами терминации транскрипции. Если его рамка считывания не попадает «в ногу» с кодоном AUG, то необходимо произвести минимальную коррекцию. В этом случае после индукции и транскрипции происходит достаточно эффективная трансляция клонированного гена. Однако следует иметь в виду, что поскольку нуклеотидная последовательность, кодирующая N-концевой участок белка-мишени, у разных клонированных генов неодинакова, нельзя создать универсальный вектор, исключающий одноцепочечное спаривание мРНК при любых обстоятельствах. Поэтому ни одна из областей инициации трансляции, как бы она ни была оптимизирована, не может га-

рантировать эффективность трансляции всех клонированных генов. Таким образом, описанные выше экспрессирующие векторы - это только основа для создания оптимальной системы трансляции.

Эффективной трансляции может препятствовать и «несовместимость» клеток, обусловленная тем, что в клонируемом гене имеются кодоны, редко встречающиеся в геноме организма-хозяина. В таких случаях в хозяйской клетке может не доставать транспортных РНК (тРНК), узнающих редко используемые кодоны, что снижает выход продукта клонированного гена. Как решить эту проблему — не совсем понятно. Если продукт клонированного гена очень ценен, можно попытаться химически синтезировать такой вариант клонируемого гена, который состоит из кодонов, обычно используемых хозяйским организмом (оптимизация кодонов).