Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с

• Название: Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
• Анкор: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 9.74 Mb.
• Имя файла: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Тип: Документы; #189
• страница: 13 из 88

ГЛАВА 6.
Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических
системах

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Для достижения эффективной экспрессии уже сконструировано много специфических векторов; для этого проводились манипуляции с целым рядом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие: 1 ) тип промотора и терминатора транскрипции; 2) прочность связывания мРНК с рибосомой; 3) число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или б хромосоме хозяйской клетки); 4) конечная локализация синтезируемого продукта; 5) эффективность трансляции в организме хозяина; 6) стабильность продукта в хозяйской клетке.

Никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонированных генов не существует. Большинство таких генов имеют уникальные молекулярные свойства, и оптимальные системы экспрессии для каждого из них приходится подбирать всякий раз заново. Эффективность экспрессии любого чужеродного гена зависит также от его родства с организмом-хозяином. Несмотря на то что многие представители как про- так и эукариотических организмов способны к экспрессии чужеродных генов, для получения важных в коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК используют в основном Escherichiacolt. Это связано прежде всего с тем, что генетические, моле-кулярно-биологические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганизма детально изучены. Кроме того, это наиболее дешевый и быстрый способ получения многих белков. Но для экспрессии некоторых клонированных генов используются и другие организмы-хозяева: В. subtilis, дрожжи, животные, растения и т. д., хотя стратегии, разработанные для Е. coli-систем, в принципе применимы и в этих случаях.

Экспрессия генов при участии сильных регулируемых промоторов

Для эффективной экспрессии любого гена совершенно необходимо наличие сильного регулируемого промотора, расположенного перед данным геном. Такой промотор имеет высокое сродство к PHК-полимеразе, поэтому прилегающие к нему последовательности эффективно (с высокой частотой) транскрибируются. Регулируемость промотора позволяет клетке (и исследователю) осуществлять строгий контроль транскрипции. Для экспрессии клонированных генов широко используется промотор хорошо изученного lac (лактозного)-оперона E, coli. Однако есть и другие промоторы, обладающие полезными для контроля экспрессии свойствами. Для их идентификации перед так называемым геном-репортером, кодирующим легко регистрируемый продукт, но лишенным

106             ГЛАВА 6
промотора, встраивают случайные фрагменты ДНК (рис. 6.1), Если в результате такой вставки ген-репортер эффективно экспрессируется, то делают вывод, что клонированный фрагмент содержит функциональный промотор. Большинство генов-репортеров кодируют либо продукты, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, либо фермент, который идентифицируется с помощью достаточно простого колориметрического теста.

Может показаться,  что наиболее подходящим способом оптимизации экспрессии клонированного гена является встраивание его в плазмиду так, чтобы он находился под контролем постоянно функционирующего сильного промотора. Однако непрерывная экспрессия чужеродного гена может оказаться гибельной для клетки-хозяина, поскольку приводит к истощению ее энергетических ресурсов и нарушению метаболизма. Кроме того, плазмиды, несущие постоянно (конститутивно) экспрессирующийся ген, нередко утрачиваются после нескольких клеточных циклов, поскольку не содержащие их клетки растут быстрее и со временем становятся

Рис. 6.1. Идентификация сильных     регулируемых промоторов.  В плазмиду встраивают ген-репортер без промотора. Хромосомную ДНК. разрезают рестрицируюшей эндонуклеазой   AbcIи   встраивают фрагменты   в   плазмиду. Если ген-репортер эффективно    экспрессируется, значит,    клонированный фрагмент содержит функциональный промотор.

Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах            107
в культуре преобладающими. Нестабильность плазмид — это основная проблема, мешающая получению продукта гена, локализованного в плазмиде, в промышленных масштабах. Для ее решения нужно научиться контролировать экспрессию таким образом, чтобы клонированный ген экспрессировался только в определенной фазе клеточного цикла и только в течение определенного времени, а для этого нужно использовать сильные регулируемые промоторы. Плазмиды, сконструированные для этих целей, называются экспрессирующими векторами.

Регулируемые промоторы

Наиболее широко используются следующие сильные регулируемые промоторы: промоторы lac- и trp-оперонов E. соli; специально сконструированный tac-промотор, включающий — 10-область lас-промотора и — 35-область trp-промотора (участки, находящиеся на расстоянии 10 и 35 п. н. до сайта инициации транскрипции); левый, или p^L, промотор бактериофага λ; промотор гена 10 бактериофага Т7. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов. Кроме того, каждый из этих промоторов узнается холо-ферментом РНК-полимеразой E. coli, в который входит основной сигма-фактор, присутствующий в клетке в значительно больших количествах, чем другие, минорные сигма-факторы. Благодаря этому транскрипция не останавливается по причине недостатка свободных сигмафакторов.

В отсутствие лактозы в среде lас-промотор E. coli находится в репрессированном состоянии, т. е. он выключен белком-репрессором, блокирующим транскрипцию lac-оперона. Индукция, или включение lac-оперона происходит при добавлении в среду лактозы или изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Оба этих соединения предотвращают связывание репрессора с lac-оператором, и транскрипция возобновляется.

Транскрипция, контролируемая lac-промотором, регулируется также с помощью белка -активатора катаболизма (САР) (рис. 6.2). При связывании САР с промотором повышается сродство последнего к РНК-полимеразе и усиливается транскрипция примыкающих к нему генов. В свою очередь сродство САР к промотору повышается при его связывании с цикличе-

Рис. 6,2. Влияние глюкозы, лактозы и сАМР на транскрипцию, регулируемую lac-промотором E. coli. Стрелка указывает направление транскрипции. (По данным работы Abeles et al., 1992, Biochemistry, p. 383, Jones and Bariett Publishers, Boston, Mass.)

108            ГЛАВА 6
ским AMP (сАМР), уровень которого повышается при снижении концентрации глюкозы в среде. Таким образом, если репрессор не связан с оператором, то в присутствии индуктора при повышении внутриклеточной концентрации сАМP может произойти усиление транскрипции генов, регулируемых laс-промотором.

На самом деле в плазмидных экспрессируюших векторах используется один из вариантов lac-промотора — lacUV5 сизмененной -10-последовательностью, более сильный, чем laс-промотор дикого типа. Транскрипция с промотора tac также подавляется lac-репрессором и возобновляется при добавлении в среду лактозы или ИПТГ.

Промотор trp выключается под действием комплекса триптофан—trp-репрессор, который связывается с trp-оператором и предотвращает транскрипцию trp-оперона. Активация (включение) trp-промотора происходит либо при удалении из среды триптофана, либо при добавлении 3-индолилакриловой кислоты.

Работа промотора р^L- регулируется репрессорным белком cl бактериофага λ. На самом деле для регуляции транскрипиии с p^L-промотора обычно используется термочувствительная му-тантная форма репрессора cI — белок сI₈₅₇. Клетки, синтезирующие этот репрессор, сначала выращивают при температуре 28—30 °С; в этих условиях репрессор блокирует транскрипцию с p^L-промотора. Когда культура достигает нужной фазы (как правило, середины log-фазы), температуру повышают до 42 °С, при которой сI₈₅₇-репрессор инактивируется и начинается транскрипция.

Для транскрипции с промотора бактериофага Т7 нужна соответствующая РНК-полимераза. Чтобы можно было использовать этот промотор, ген РНК-полимеразы фага Т7 встраивают в хромосому E. coli в составе профага λ, поместив его подконтроль lac-промотора. Затем клетки трансформируют плазмидой, содержащей генмишень под контролем Т7-промотора, и добавляют в среду ИПТГ. В этих условиях происходит индукция гена РНК-полимеразы Т7, синтезируется РНК-полимераза и происходят транскрипция и трансляция клонированного гена. Часто между временем индукции гена РНК-полимеразы Т7 и началом транскрипции гена-мишени проходит более часа. Для транскрипции с сильного Т7-промотора создана целая серия плазмид, получивших название рЕТ-векторов.

Эффективность инактивации белка-репрессора и соответственно активации транскрипции зависит от соотношения между числом молекул репрессора и числом копий промотора. Если концентрация репрессора слишком велика, то транскрипция не инициируется, и наоборот, если молекул репрессора очень мало (даже при том, что их больше, чем копий промотора), то транскрипция может идти и в отсутствие индукции. Про такие промоторы говорят, что они «текут». Чтобы осуществлять строгий контроль таких регулируемых систем, разработаны разные стратегии. Например, ген репрессора и соответствующий промотор помещают в две разные плазмиды, присутствующие в клетке в разном числе копий; это позволяет поддерживать нужное соотношение между числом молекул репрессора и числом копий промотора. Обычно ген репрессора находится в малокопийной плаз-миде, число ее копий в клетке не превышает 8, а промотор -- в мультикопийной плазмиде с 30—100 копиями на клетку. Ген репрессора может быть локализован и в хромосомной ДНК, находясь в ней в единственном числе, что позволяет поддерживать низкую концентрацию репрессора. В системах, использующих laс-промо-тор, можно получить lac-репрессор в значительно большем количестве, если заменить lacI-ген его мутантной формой laсI^q, что приводит к уменьшению «протекания» промотора, т. е. к снижению уровня транскрипции клонированного гена без индуктора.

Получение больших количеств белковых продуктов

Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов E. coli была сконструирована плазмида pPLc2833. Она содержит сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов (полилинкер), следующий непосредственно за промотором. Эффективность этого экспрессируюшего вектора в осуществлении синтеза чужеродных белков в Е. соli можно еще

Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах            109

Таблица 6. I. Зависимость числа копий трех плазмидных экспрессирующих векторов от температуры1)

больше повысить, заменив сайт инициации репликации плазмиды pPLc2833 аналогичным сайтом плазмиды рКМ402. Это приводит к увеличению числа копий модифицированной плазмиды в 5-10 раз при температуре 42 °С (табл. 6.1), Полученная таким образом плазмида рСРЗ содержит p^L-промотор и ген ß-лактамазы (ген устойчивости к ампициллину) из pPLc2833, a сайт инициации репликации - из pKN402 (рис. 6.3). Несущие ее клетки сначала выращивают при температуре 28 °С, а затем — при 42 °С. При пониженной температуре ген cI-penpeccopa, интегрированный в ДНК E. соli, экспрессируется, p^L-npoмотор не функционирует и образуется обычное число копий плазмиды (табл. 6.1). При повышении температуры cl-penpecop инактивируется, p^L-промотор переходит в активное состояние, и число копий плазмиды увеличивается. Все это и делает плазмиду рСР3 эффективным экспрессирующим вектором. Когда ген ДНК-лигазы Т4 был встроен в полилинкер рСР3, то выход его продукта составил примерно 20% от общего количества белка, синтезируемого Е. соli при 42 °С. При этом на долю собственных, наиболее активно синтезируемых белков E, coli, например фактора элонгации EF-Тu, приходится примерно 2%.

Крупномасштабные системы

При культивировании в небольших объемах (от l до 5 л) индукцию экспрессии осуществляют либо изменением температуры, либо добавлени-

Рис. 6.3. Создание плазмиды рСР3. Из плазмиды pKN402 с помощью рестрицирующей эндонуклеазы   HaeIIвырезают фрагмент с, содержащий температурочувствительный сайт инициации репликации (ori), и сшивают его с НаeII-фрагментами   1   и   3   плазмиды   pPLc2833. Фрагмент 1 содержит pL--промотор и полилинкер (ПЛ), а фрагмент 3 - селективный маркерный ген устойчивости к ампициллину (Ampr).

110             ГЛАВА 6
ем химического индуктора. Однако в опытных установках (20—100 л) и в промышленных биореакторах (>200 л) температуру нельзя изменить мгновенно, для этого требуется время от 30 до 60 мин; кроме того, на подъем температуры нужна энергия. И время, и энергия стоят дорого. Столь же дорого обходится и применение химического индуктора, например ИПТГ. Все это может сделать процесс неэкономичным. Для преодоления некоторых проблем, связанных с использованием p^L-промотора для крупномасштабного производства белковых продуктов, была разработана двухплазмидная система. Ген репрессора cI поместили под контроль trр-про-мотора и включили в малокопийную плазмиду (рис. 6.4), что обеспечило невысокий уровень синтеза репрессора. Вторая плазмида содержала клонированный ген, находящийся под контролем p^L-промотора. Как видно из рис. 6.4, А, в отсутствие триптофана включается trр-промотор и синтезируется репрессор cI, выключающий p^L-промотор. И наоборот, как видно из рис. 6.4, Б, при наличии триптофана trp-промотор выключается, репрессор не синтезируется, а p^L-промотор активно работает.

Культуры с такими двухплазмидными системами можно выращивать на недорогих средах на основе гидролизатов мелассы или казеина, содержащих незначительное количество свободного триптофана, и индуцировать экспрессию клонированного гена добавлением в среду трип-тона. Последний содержит свободный триптофан в количестве, достаточном для эффективной индукции транскрипции. Пробные испытания этой системы показали, что на долю продуктов клонированных генов ß-лактамазы и цитратсин-

Рис. 6.4. Двухплазмидная система, позволяющая контролировать работу pL-промотора фага λ путем регуляции синтеза cl-peпрессора с помощью триптофана. Ген репрессора cI вместе с триптофановым  промотором (р trp) находятся в одной плазмиде, а pL-промотор и клонированный ген — в другой. Стрелками указано направление транскрипции. А. В отсутствие триптофана в среде ген cI транскрибируется и транслируется, репрессор cI связывается с pL-промотором и блокирует транскрипцию клонированного гена. Б. В присутствии триптофана ген cI репрессируется,     его     продукт     не синтезируется, поэтому клонированный ген транскрибируется и транслируется.

Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах            111
тазы после индукции транскрипции добавлением триптона приходится соответственно 21 и 24% от общего количества синтезируемого белка. Таким образом, двухплазмидные системы позволяют получать белковые продукты с помощью реком-бинантных микроорганизмов в промышленных масштабах и относительно недорого.

Использование для экспрессии других микроорганизмов

Е. coll — не единственный микроорганизм, который используется для синтеза чужеродных белков. К сожалению, генетические и молекулярно-биологические свойства большинства других микроорганизмов изучены не так хорошо. Кроме того, нет ни одного вектора или даже промо-торно-репрессор ной системы, которая обеспечивала бы оптимальный уровень экспрессии в клетках всех или хотя бы только грамотрицательных бактерий. К счастью, многие стратегии, разработанные для Е. coli, пригодны и для множества других микроорганизмов, что позволило проверить различные промоторы на их способность обеспечивать транскрипцию в других гра-мотрицательных бактериях. Так, в одном из исследований был сконструирован набор плазмидных экспрессирующих векторов, содержащих промоторы lас, tac, Nm (гена устойчивости к неомицину) и SI (гена рибосомного белка S1 Rhisobium meliloti), и определен уровень экспрессии гена ß-лактамазы под контролем каждого из них (табл. 6.2). Обнаружилось, что: 1) указанные промоторы проявляют ту или иную активность во всех использованных бактериальных системах; 2) промотор tac наиболее активен в Е. coli и гораздо менее — в других бактериях; 3) Nm — второй по активности промотор в E. coli и самый активный в других бактериях. Промоторные участки у всех грамотрицательных бактерий имеют сходную нуклеотидную последовательность, однако это не означает, что самым эффективным промотором для того или иного организма будет тот, который наиболее эффективен в Е. coli. Тем не менее Е. соli-промоторы могут оказаться вполне приемлемыми для регуляции экспрессии клонированных генов и в других грамотрицательных бактериях.

Попытки создания «универсального» экспрессирующего вектора для грамотрицательных бактерий были весьма многочисленными. В конце концов была выбрана следующая стратегия. Фрагмент ДНК размером 70 п. н., происходящий от одного из концевых инвертированных повторов в транспозоне 5 (Tn5), встроили вместе с соответствующим промотором в полилинкер малокопийной плазмиды pRK290 с широким спектром хозяев и получили плазмиду pAV10 (рис. 6.5). Клонированный сегмент ДНК из Tn5 содержал два независимых, но перекрывающихся промотора, каждый из которых необходим для транскрипции одного из ключевых Tn5-генов. Поскольку Tn5 эффективно экспрессируется в разных бактериях, его промоторы можно использовать для транскрипции различных генов. Чтобы проверить это, в полилинкер сразу за клонированными промоторами Тn5 встроили гены хлорамфеникол-ацетил-трансферазы и ß-галактозидазы. Их эффективная экспрессия происходила в клетках Alcaligenes sp,, E. coli, Enterobactercloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas stuizeti, Pseudomonas fluorescens и Serratia marcescens. Таким образом, есть реаль-

Таблица 6.2.Активность ß-галактозидазы в грамотрицательных бактериях, несущих плазмидный вектор с геном lacZ E.coli игетерологичным промотором1)
Промотор	Активность ß-галактозидазы, ЕД
	Escherichia coli	Rhizobium meliloti	Rhizobium leguminosarum	Pseudomonas putida
Отсутствует	16	110	130	150
Nm	1400	21800	13900	16300
lac	2000	9050	6250	9800
tac	11300	2850	1150	2950
S1	40	3300	1200	3350
1) По данным Labes et al., 1990, Gene 89: 37—46.

112             ГЛАВА 6

Рис. 6.5. Клонируюший вектор pAV10 (без соблюдения масштаба). Показано положение гена устойчивости к тетрациклину (Tetr), сайта рестрикции для эндонуклеазы BglII, сайта инициации репликации (on), промотора (p) и полилинкера (ПЛ). Встраивание клонированного гена в полилинкер ставит его под контроль промотора Тn5 (р). Стрелка указывает направление транскрипции.

ная возможность использовать Тn5-промоторы для инициации транскрипции чужеродных генов в клетках различных бактерий.