Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
 Скачать 9.74 Mb.
|
-штамма R. meliloti при помощи конъюгации. Вектор содержал ген устойчивости к тетрациклину, который можно было использовать как селективный маркер и в случае Е. coli, и в случае R. meliloti.Образование клубеньковКонкуренция среди организмов, образующих клубенькиОдна из основных задач сельскохозяйственной биотехнологии — создание с помощью методов генной инженерии штаммов Rhizobium, которые повышали бы урожайность растений более эффективно, чем природные штаммы. Многие имеющиеся на рынке штаммы-инокуляты -превосходные азотфиксаторы — были созданы путем мутагенеза и последующего отбора, однако они в недостаточной степени стимулируют образование клубеньков на корнях растения-хозяина в условиях конкуренции с природными штаммами Rhizobium, уже присутствующими в почве. И наоборот, многие природные штаммы с успехом выдерживают конкуренцию с лабораторными штаммами, но малоэффективны в отношении фиксации азота. Таким образом, для того чтобы можно было реально использовать имеющиеся на рынке инокулирующие штаммы, необходимо либо повысить их способность образовывать клубеньки, либо устранить природные штаммы Rhizobium. Были проведены исследования, направленные на определение генетической основы «конкурентоспособности» природных штаммов, с тем чтобы затем попытаться ввести соответствующие гены в штаммы-инокуляты. Манипуляции с генами образования клубеньковДля идентификации генов образования клубеньков (nod-генов)вновь использовали генетическую комплементацию. Не способный образовывать клубеньки (Nod | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Рис. 14.6. Идентификация генов образования клубеньков R. meliloti. ДНК R. meliloti дикого типа встраивают в космиду pLAFRI с широким кругом хозяев, упаковывают в частицы фага λ и вводят в Е. coli. Банк клонов переносят из Е. coli в Nod-штамм R. meliloti при помощи конъюгации. Растения люцерны инокулируют трансформированными R. meliloti Nod: растения, образующие корневые клубеньки, инфицированы A meliloti Nod+, клетки которых, по-видимому, несут комплементирующий ген образования клубеньков в составе космидного вектора. Из корневых клубеньков выделяют трансформированные Nod+-клетки R. meliloti. |  |
318 ГЛАВА 14
форманты, которые несут и экспрессируют ген, комплементирующий дефект образования клубеньков в клетках R, meliloti.
4. Из клубеньков выделили бактерии, вызывающие образование клубеньков, а из бактерий -вектор, несущий комплементирующий ген. Содержащую этот ген большую вставку переклонировал и и провели дальнейший анализ,
5. Идентифицированный ген образования клубеньков использовали в качестве зонда для обнаружения фланкирующих его участков хромосомной ДНК R. meliloti в геномной библиотеке.
В результате этих весьма трудоемких экспериментов удалось охарактеризовать весь набор генов образования клубеньков R. meliloti. Детальные биохимические и генетические исследования показали, что образование клубеньков и его регуляция — это сложные процессы, в которых задействованы продукты большого количества генов (примерно 20; табл. 14.6). Одни
из этих генов высококонсервативны (одинаковы у всех микроорганизмов, образующих клубеньки), другие видоспецифичны. Их можно сгруппировать в три отдельных класса: консервативные, видоспецифичные и регуляторный ген nodD. Так, nodABC-гены одинаковы у всех видов Rhizobiumи структурно взаимозаменяемы; у большинства видов они образуют один оперон.
Установлено, что процесс образования клубеньков включает несколько этапов. Сначала продукт конститутивно экс премирующегося гена nodDсвязывается с молекулой флавоноида, секретируемого клетками корней растения-хозяина. Флавоноиды — это растительные фенольные соединения, структурную основу которых составляют два ароматических кольца, соединенных друг с другом трехуглеродным мостиком. Они выполняют в растениях разные функции, в частности отвечают за их пигментацию и участвуют в защите от грибов и насекомых. Связывание флавоноидов с белком NodD -
| Таблица 14.6. Некоторые белки, кодируемые генами образования клубеньков Rhizobium, и их возможные функции | |
| Белок | Характеристика 1) |
| NodA | Консервативен, локализован в плазматической мембране, вместе с NodB стимулирует клеточное деление |
| NodB | Консервативен, локализован в плазматической мембране, вместе с NodA стимулирует клеточное деление |
| NodC | Консервативен, локализован в наружной мембране, хитинсинтаза |
| NodD | Консервативен, активатор транскрипции, синтез конститутивен |
| Nod E | Локализован в плазматической мембране, ß-кетоацилсинтаза |
| NodF | Локализован в цитоплазме, ацилпереносящий белок |
| NodG | Ввдоспецифичен, дегидрогеназа |
| NodH | Вцлоспецифичен, сульфотрансфераза |
| NodIJ | Консервативен, локализован в плазматической мембране, участвует в секреции полисахарида оболочки |
| Nod К | Влияет на инициацию образования клубеньков некоторыми штаммами Bradyrhizobium |
| NodL | Локализован в плазматической мембране, ацетилтрансфераза |
| NodM | D- глюкозаминсинтаза |
| NodN | Функция неизвестна |
| NodO | Секретируется, гемолизин |
| Mod P | Комплекс с NodQ, АТР-сульфурилаза |
| NodQ | Комплекс с NodP, АТР-сульфурилаза |
| NodS | Метилтрансфераза |
| NodT | Локализован в наружной мембране, участвует в ceкреции |
| NodU | Функция неизвестна |
| NodX | Видоспецифичен |
| 1) Если биохимические или генетические данные о функции белка отсутствуют, то ему приписывают такие же функции, как у белка с гомологичной аминокислотной последовательностью. Pазные штаммы Rhizobium содержат разные наборы этих белков. Слово «консервативен" означает, что белок выполняет одинаковую функцию у всех видов Rhiizobium. | |