Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с

• Название: Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
• Анкор: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 9.74 Mb.
• Имя файла: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Тип: Документы; #189
• страница: 48 из 88

ГЛАВА 15.
Микробные инсектициды

Из всех классов животных класс насекомых — самый многочисленный: число описанных видов приближается к 1 млн. Насекомые могут наносить огромный ущерб урожаю сельскохозяйственных культур, а некоторые из них являются переносчиками болезней человека и животных. В 1940-х тт. было синтезировано множество химических инсектицидов, позволяющих контролировать численность популяций насекомых-вредителей. Самым известным из них был дихдордифенилтрихлорэтан (ДДТ). Это хлорорганическое соединение синтезировали в 1870-х гг., но в качестве инсектицида стали применять лишь в конце 1930-х гг. ДДТ оказался высокоэффективным средством борьбы со многими насекомыми-вредителями. Как и другие хлорорганические соединения, он оказывает парализующее действие на нервную систему и мышечные ткани насекомых. К настоящему времени синтезированы и широко применяются другие хлорорганические соединения, такие как дильдрин, альдрин, хлордан, линдан, токсофен.

Еще один класс химических инсектицидов — фосфорорганические соединения, включающие малатион, паратион и диазинон. Фосфорорганические инсектициды первого поколения были разработаны как боевые отравляющие вещества. Теперь их используют для контроля численности насекомых. Их действие основано на ингибировании ацетилхолинэстеразы, которая гидролизует нейромедиатор ацетилхолин. Инсектициды этого класса нарушают функционирование мотонейронов и нейронов мозга насекомого.

В США к началу 1960-х гг. химическими инсектицидами обрабатывалось около 50 млн. га сельскохозяйственных угодий. Примерно в это время было показано, что хлорорганические (в большей степени) и фосфорорганические (в меньшей степени) инсектициды оказывают вредное воздействие на человека, животных и экосистемы. Это воздействие может проявляться немедленно или спустя длительное время. Хлорорганические соединения (в частности, ДДТ) сохраняются в окружающей среде от 15 до 20 лет и накапливаются во все возрастающих концентрациях. Биоаккумуляция химических инсектицидов в жировых тканях многих организмов уже привела к пагубным последствиям. Так, в Северной Америке были практически истреблены многие виды птиц: сапсаны, ястребы-перепелятники, белоголовые орланы, бурые пеликаны, ушастые бакланы.

Со временем основные насекомые-вредители становились все более устойчивыми ко многим химическим инсектицидам, и это привело к тому, что к 1950-м гг. для контроля их численности пришлось использовать более высокие концентрации инсектицидов. Кроме того, было показано, что химические инсектициды действуют не избирательно, т. е, наряду с насекомыми-вредителями они уничтожают и полезных насекомых, а в некоторых случаях гораздо эффективнее уничтожают естественных врагов насекомых-вредителей, чем самих вредителей. Зачастую это приводило к весьма неожиданным результатам; обработка вызывала увеличение численности насекомых-вредителей.

С учетом этого все последние 20 лет проводились интенсивные поиски альтернативных способов контроля численности насекомых-вредителей. Прежде всего исследователи обратились к

332              ГЛАВА 15
природным инсектицидам, синтезируемым различными микроорганизмами и растениями. Дело в том, что эти соединения, как правило, высокоспецифичны и подвергаются быстрой биодеградации, поэтому устойчивость к ним вырабатывается медленно. К сожалению, они не очень эффективны, а их получение обходится дорого, что ограничивает возможность их широкого применения. Есть надежда, что все эти проблемы удастся решить с помощью технологий рекомбинантных ДНК. Теперь для увеличения эффективности микробиологических инсектицидов исследователи могут проводить манипуляции с генами, которые кодируют их биосинтез, В частности, речь может идти о генах инсектицидов, вырабатываемых бактерией Bacillusthuringiensisили бакуловирусами насекомых; эти инсектициды безопасны, специфичны и весьма эффективны.

Рынок пестицидов огромен: в настоящее время на их производство во всем мире ежегодно расходуется более 20 млрд. долларов, и эта цифра быстро растет. При этом на долю биопестицидов, главным образом инсектицидов В. thuringiensis, приходится всего 1% этой суммы, но по прогнозам дальнейший прогресс в этой области будет связан именно с биопестицидами.

Токсин, синтезируемый Bacillusthuringiensis

Механизм действия и использование

Под «микробным инсектицидом» иногда понимается микроорганизм, либо синтезирующий какое-либо токсичное вещество, избирательно действующее на определенных насекомых, либо инфицирующий насекомое-мишень и приводящий к его гибели. Наиболее изученные, наиболее эффективные и наиболее часто используемые микробные инсектициды — бактерии В. thuringiensis. Они представлены множеством штаммов и подвидов (subsp.), и каждый из них синтезирует токсин, специфичный в отношении определенных насекомых (табл. 15.1). Например, В. thuringiensissubsp. kurstakiтоксичен для личинок чешуекрылых (в том числе моли и бабочек), для личинок толстоголовки, мермитид и гусениц листовертки-почкоеда елового. В. thuringiensissubsp. ismelensisуничтожает двукрылых: комаров и мошек. В. thuringiensissubsp. tenebrionis(также известный как sondiego) эффективен в отношении жесткокрылых, в том числе колорадского жука и хлопкового долгоносика. Описаны и другие штаммы В. thuringiensis, каждый из которых токсичен для определенных насекомых.

Инсектицид (белковый токсин) В. thuringiensissubsp. kurstakiи других штаммов находится в клетке в виде так называемого параспорального кристалла — структуры, которая образуется во время споруляции бактерий. Никакой особенной биологической функции эта структура не несет. На ее долю приходится от 20 до 30% сухой массы спорулирующей культуры и состоит она главным образом из белка (95%) и некоторого количества углеводородов (-5%). Кристалл — это на самом деле некий белковый агрегат, диссоциирующий на субъединицы в слабой щелочи. Субъединицы можно далее диссоциировать in vitro обработкой ß-меркаптоэтанолом, кото-

Таблица 15.1. Некоторые свойства инсектицидных токсинов, синтезируемых разными штаммами В. thuringiensis1)
Штамм В. thuringiensisили подвид	Класс	Мол. масса протоксина, кДа	Насекомое-мишень	Серотип
berliner	CryI	130-140	Чешуекрылые	1
kurstaki КТО, HD-1	CryI	130-140	Чешуекрылые	3
entomocidus 6.01	CryI	130-140	Чешуекрылые	6
αizawai 7.29	CryI	130-140	Чешуекрылые	7
aizawai IC 1	CryI	135	Чешуекрылые, двукрылые	7
kurstaki HD-I	CryII	71	Чешуекрылые, двукрылые	3
tenebrionis (san diego)	CryIII	66-73	Жесткокрылые	8
morrisoni PG 14	CryIV	125-145	Двукрылые	8
israelensis	CryIV	68	Двукрылые	14
1) Из работы Lerechus el al., p. 37— 69, in Enlwistle et  al.,  (ed.). Bacillus thuringiensis, an Environmental Biopesticide: Theory und Practice, 1993.

Микробные инсектициды             333

Рис. 15.1. Схематическое изображение параспорального кристалла В. thuringiensis, состоящего из белкового протоксина Cryl. Каждая белковая субъединица имеет мол. массу 250 кДа и содержит два полипептида мол. массой 130 кДа каждый. Молекулярные массы определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле; приведены округленные значения. Превращение протоксина (130 кДа) в активный токсин (68 кДа) происходит только в слабощелочных условиях (pH 7,5—8) в присутствии специфической протеиназы (протеиназ). Именно эти условия реализуются в кишечнике насекомого.

рый восстанавливает дисульфидные связи (рис. 15.1).

Все инсектицидные токсины, выделенные из множества штаммов В. thuringiensis, в соответствии с их токсичностью можно сгруппировать в четыре основных класса: CryI, CryII, CryIII и CryIV, Белки Cryl токсичны для чешуекрылых, CryII - для чешуекрылых и двукрылых, Crylll -для жесткокрылых, CrylV — для двукрылых. Классы можно разделить далее на подклассы (А, В, С, ...) и подгруппы (а, b, с, ...) согласно нуклеотидным последовательностям генов соответствующих токсинов. Например, класс генов cryIвключает шесть подклассов (от crylA до F), а подкласс crylA — три подгруппы [от crylA(a) до (с)]. Кроме того, в соответствии с иммунологическими особенностями выделяют примерно 30 разных серотипов В. thuringiensis ( табл. 15.1). Каждый серотип отличается от другого специфическим набором антигенных детерминант на поверхности клеток определенного штамма В. thuringiensis.

В параспоральном кристалле инсектицид обычно находится в неактивной форме; при солюбилизации кристалла белок высвобождается в форме протоксина, предшественника активного токсина. Протоксин класса токсинов Cryl имеет мол, массу примерно 130 кДа (рис. 15.1). После заглатывания насекомым параспорального кристалла протоксин активируется в кишечнике в условиях щелочного pH (7,5—8,0) и под действием специфических пищеварительных протеиназ превращается в активный токсин с мол. массой примерно 68 кДа (рис. 15.1). В таком виде он встраивается в мембрану эпителиальных клеток кишечника насекомого и образует ионный канал, через который, как полагают, происходит утечка значительной части клеточного АТР (рис. 15.2). Примерно через 15 мин после формирования такого ионного канала клеточный метаболизм блокируется, насекомое перестает питаться, происходит обезвоживание

334            ГЛАВА 15

Рис. 15.2. Встраивание токсина В, thuringiensis в мембрану эпителиальной клетки кишечника насекомого и образование ионного канала.

организма и в конечном счете наступает смерть. Поскольку превращение прстоксина в активный токсин происходит только в условиях щелочного pH и в присутствии определенных протеиназ, вероятность вредного воздействия токсинов на человека и сельскохозяйственных животных мала.

Способ действия токсинов В. thuringiensis налагает некоторые ограничения на область их применения. Чтобы убить насекомое, В. thuringiensis обязательно должен попасть в его кишечник, в противном случае никакого эффекта не будет. В. thuringiensis чаще всего распыляют, причем бактерии обычно смешивают с атрактантами насекомых, чтобы повысить вероятность того, что насекомое-вредитель проглотит токсин. Однако для насекомых, обитаюших в тканях растений или на корнях, токсин В. thuringiensis при такой обработке вряд ли будет представлять какую-либо опасность. С учетом всего этого были предприняты попытки разработать другие стратегии защиты растений от таких вредителей. Один из подходов состоит в создании трансгенных растений, несущих и экспрессирующих ген токсина В. thuringiensis и, следовательно, защищенных от насекомых-вредителей в течение всего периода вегетации.

Второе ограничение, налагаемое на применение токсина В. thuringiensis, связано с тем, что этот токсин действует на насекомое, находящееся только на определенной стадии развития. Именно в этот момент и должна проводиться обработка.

Штамм В. thuringiensis subsp. kurstaki был выделен в 1901 г., но интерес к нему как к ценному коммерческому продукту возник лишь в 1951 г., а за последние десять лет эта бактерия стала основным инструментом контроля численности гусениц листовертки-почкоеда елового в Канаде. В 1979 г. лишь над 1% лесов Канады, обрабатываемых инсектицидами с целью уничтожения этого насекомого (что соответствует примерно 2 млн. га), распыляли В. thuringiensis subsp. kurstaki; остальные площади обрабатывали химическими инсектицидами. К !986 г. масштабы использования B. thuringiensis subsp. kurstaki возросли до 74%. В других странах В. thuringiensis subsp. kurstaki используют для борьбы с коконопрядом, непарным шелкопрядом, мертимидами, совкой капустной и бражником. Основное препятствие на пути еще более широкого применения В. thuringiensis subsp. kurstaki состоит в его дороговизне: стоимость такого препарата в 1,5—3 раза выше, чем химических инсектицидов.

Для биоконтроля численности насекомых-вредителей распыляют 1,5 - 10⁹ — 2,5 10⁹ спор В. thuringiensis subsp. kurstaki на каждый квадратный метр обрабатываемого участка. Обработку проводят в тот период, когда число личинок в популяции насекомого-мишени максимально, поскольку параспоральные кристаллы чувствительны к солнечному свету и быстро разрушаются. В лабораторных условиях на свету за 24 ч разлагается более 60% остатков триптофана в белках па-распорального кристалла, а в окружающей среде в зависимости от освещенности кристаллы могут сохраняться от одних суток до одного месяца. Такая нестабильность инсектицидного протоксина подразумевает, что появление устойчивых к нему насекомых маловероятно.

Однако в том случае, когда В. thuringiensis subsp. kurstaki использовали в качестве инсектицида в условиях малой освещенности (например, в зернохранилищах), через несколько генераций появлялись устойчивые к токсину насекомые. Одна из причин такой передаваемой по наследству устойчивости заключается в изменении мембранного белка клеток кишечника, в норме выполняющего функцию рецептора токсина В. thuringiensis subsp. kurstaki. Возможно, она возникает вследствие того, что в этих условиях протоксин не разрушается и служит фактором отбора. Из всего этого следует, что появления насекомых, устойчивых к В. thuringiensis

Микробные инсектициды           335
subsp. kurstaki, проще всего избежать, если ограничить применение данного микроорганизма полевыми условиями. Впрочем, имея в виду масштабы использования В. thuringiensis, нельзя исключить, что может произойти его накопление в среде в количестве, достаточном для того, чтобы вступил в действие механизм отбора. А поскольку B. thuringiensisиспользуется все более широко в разных регионах, вероятность появления популяций устойчивых насекомых будет увеличиваться.

Идентификация генов токсинов

Для создания штаммов В. thuringiensis, более эффективно синтезирующих инсектициды и имеющих широкий круг хозяев, нужно было идентифицировать и охарактеризовать ген(ы) протоксина, и в первую очередь выяснить, где они локализованы: в плазмиде или в хромосомной ДНК. Чтобы проверить гипотезу плазмидной локализации, штамм В. thuringiensis, продуцирующий токсин, можно конъюгировать со штаммом, не обладающим инсектицидной активностью. Передача хромосомной ДНК во время конъюгации происходит крайне редко, и если «дефектный» штамм приобретает способность синтезировать инсектицид, значит, токсиновые гены локализованы в плазмиде.

Для идентификации гена, кодирующего протоксин , используют обычную методику. В. thuringiensis выращивают в культуре и лизируют клетки. Выделяют суммарную клеточную ДНК и центрифугируют ее в градиенте плотности CsCl, чтобы разделить плазмидную и хромосомную ДНК. Если гены протоксинов входят в состав генома, создают банк клонов хромосомной ДНК. Если же они содержатся в плазмиде, то плазмидную ДНК фракционируют по размерам центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Это обогащает ту плазмидную фракцию, которая послужит в дальнейшем исходным материалом для идентификации генов протоксинов (рис. 15.3).

Ген протоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki находится на одной из семи плазмид длиной 2,0; 7,4; 7,8; 8,2; 14,4; 45 и 71 т. п. н. Чтобы определить, в какой именно, проводили центрифугирование плазмидной ДНК в градиенте плотности сахарозы. Были выделены три фракции, в кото-

Рис. 15.3. Выделение и фракционирование плазмид, одна из которых несет ген протоксина.

рых концентрировались малые (2,0 т. п. н.), средние (7,4; 7,8; 8,2 и 14,4 т. п. н.) и большие (45 и 71 т. п. н.) плазмиды. Малые плазмиды из рассмотрения были исключены, поскольку они не могли кодировать белок мол. массой 130 кДа. Длина нуклеотидной последовательности, кодирующей белок такого размера, должна превышать 4,0 т. п. н. Средние и большие плазмиды подвергли частичному гидролизу рестрицирующей эндонуклеазой Sau3АI и фрагменты встроили в BamHI-сайт плазмиды pBR322. Полученными рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки E. соli, а затем провели иммунологический скрининг по следующей схеме:

336              ГЛАВА 15
1.   Колонии клеток перенесли с агара на нитроцеллюлозный фильтр.

2.   Перенесенные клетки частично лизировали органическими растворителями.

3.   Все сайты  неспецифического связывания первых и вторых антител на фильтре блокировали с помощью бычьего сывороточного альбумина (БСА).

4.   Обработанные БСА фильтры инкубировали с кроличьими антителами к искомому инсектициду.

5.   Отмывали фильтры от несвязавшихся антител и обрабатывали ¹²⁵I-меченным А-белком Staphylococcus aureus, который взаимодействует с Fc-фрагментом связанных антител.

6.   Области на фильтре, которые соответствуют колониям, активно синтезирующим инсектицид, выявляли с помощью радиоавтографии.

Используя идентифицированный ген протоксина в качестве гибридизационного зонда, установили, что соответствующая нуклеотидная последовательность содержится в плазмиде В. thuringiensis subsp. kurstaki длиной 71 т. п. н. Аналогичная схема клонирования и скрининга использовалась для идентификации генов токсинов, локализованных в плазмидах или (реже) в хромосомной ДНКдругих штаммов В. thuringiensis.

Генная инженерия генов токсинов В. thuringiensis

После идентификации токсинового гена В. thuringiensis была определена первичная структура кодируемого им белка. Сравнен ие аминокислотных последовательностей разных белковых токсинов показало, что белки некоторых штаммов имеют одинаковый домен, ответственный за токсичность. Кроме того, был субклонирован сегмент полной кодирующей последовательности, с которого синтезировался укороченный белок, в полной мере сохранивший свою токсичность. Таким образом, при последующих генноинженерных манипуляциях могут использоваться интактный ген токсина, его фрагмент или химически синтезированный олигонуклеотид.

В естественных условиях большинство протоксинов В. thuringiensis синтезируются только во время споруляции, т. е. параспоральный кристалл образуется только на определенной стадии развития микроорганизма. Если бы экспрессия гена токсина происходила во время всего жизненного цикла, можно было бы существенно увеличить количество получаемого токсина и уменьшить время его синтеза. Кроме того, это позволило бы сделать синтез токсина непрерывным процессом и тем самым значительно удешевить продукт, поскольку для непрерывной ферментации используют небольшие, а потому менее дорогие биореакторы и оборудование, чем для периодической (более подробно см. об этом в гл. 16).

Во время споруляции В. thuringiensis специфический фактор инициации транскрипции (сигма-фактор) связывается с промоторами генов, функционирующих только на этой стадии жизненного цикла бактерии, так что синтезируются матричные РНК (мРНК), специфичные для споруляции. Следовательно, чтобы добиться непрерывной экспрессии инсектицидного гена (генов) В. thuringiensis, необходимо поместить его (их) под контроль промотора, функционирующего в течение всего жизненного цикла.

Для этого фрагмент ДНК. содержащий ген токсина без его собственного промотора, встроили в плазмиду так, чтобы он находился под контролем активного конститутивного промотора гена устойчивости к тетрациклину, который ранее был вырезан из плазмиды Bacilluscereusи введен в В. thuringiensis. На всех этапах развития микроорганизма непрерывно синтезировался полноценный токсичный белок (рис. 15.4). Кроме того, когда этой конструкцией трансформировали мутантный штамм В. thuringiensis, не способный к споруляции, токсин все равно синтезировался. При этом процесс был гораздо более эффективным, чем в случае В, thuringiensis дикого типа: количество получаемого продукта было больше, а израсходованное количество субстрата и время синтеза -значительно меньше.

Дальнейшее усовершенствование этой системы могло бы состоять во введении токсинового гена, экспрессирующегося в течение всего жизненного цикла, в хромосомную ДНК штамма В. thuringiensis, не способного к споруляции. Это гарантировало бы сохранность гена при непрерывной ферментации, что не всегда достигается

Микробные инсектициды           337

Рис. 15.4. Клонирование фрагмента гена токсина В. thuringiensis subsp. kurstaki под контролем промотора гена устойчивости к тетрациклину (pTet). Из выделенного гена В. thuringiensisудаляют его собственный промотор с помощью рестриктаз RE1 и RE2. Полученный фрагмент встраивают в плазмидный вектор рядом с промотором pTet вместо гена устойчивости к тетрациклину, удаленного с помощью рестриктаз RE1 и RE2, и лигируют при участии ДНК-лигазы фага Т4.