Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с

• Название: Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
• Анкор: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 9.74 Mb.
• Имя файла: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Тип: Документы; #189
• страница: 51 из 88

Повышение эффективности ферментации

Независимо от типа биореактора в ходе ферментации необходимо строго контролировать такие параметры, как концентрация растворенного кислорода, pH, температура и интенсивность перемешивания. Слишком сильное изменение любого из них может существенно снизить скорость роста клеток и стабильность белкового продукта.

Для оптимального роста Е. coliи многих других микроорганизмов, используемых в качестве инструмента экспрессии рекомбинантных белков, обычно нужна хорошо аэрируемая культуральная среда. Максимальная скорость утилизации кислорода при ферментации Q_max зависит от массы клеток X, максимальной удельной скорости роста _mах и скорости роста, зависящей от количества потребленного кислорода . Эта зависимость выражается следующей формулой:

Q_max ⁼ Xµ_max/Y_O2.

Поскольку кислород плохо растворим в воде (0,0084 г/л при 25 °С), он должен подаваться в среду непрерывно. Обычно для аэрации через ферментер продували стерилизованный воздух. Однако при этом в среде образуются пузырьки, и если они слишком велики, то скорость переноса кислорода к клеткам недостаточна для поддержания их роста. Таким образом, в ходе ферментации необходимо с помощью специального датчика контролировать содержание растворенного кислорода в среде, следить за его равно-

Промышленный синтез белков при участии рекомбинантных микроорганизмов           355

Экспрессия гена гемоглобина стимулирует синтез белка в Е. соliв условиях недостатка кислорода

С. Khosla, J.E. Curtis, J. DeModena, U.Rinas, J.E. Bailey Bio/Technology 8:849-853. 1990

Поскольку кислород плохо растворим в воде, рост аэробных бактерий часто лимитируется количеством растворенного   в   культуральной среде  кислорода.  Эта  проблема особенно актуальна при большой плотности культуры или при крупномасштабной ферментации. Чтобы решить ее, биотехнологи попытались    увеличить    количество кислорода, поступающего в жидкую кулыуральную среду. Предложенные подходы состояли в следующем: 1) подача в кулыуральную среду чистого кислорода вместо воздуха; 2) подача воздуха (или кислорода) под давлением; 3) добавление к культуральной среде хими-

ческих соединений, таких как перфторуглероды, повышающие растворимость кислорода; 4) модификация конструкции ферментера таким образом, чтобы обеспечивались оптимальная аэрация и перемешивание культуральной среды. Все эти подходы решают «кислородную проблему" лишь частично. Для каждого из них существует свой порог, по достижении которого выход продукта уже нельзя повысить дальнейшим добавлением кислорода. В качестве альтернативы Бейли и др. предложили модифицировать микроорганизм, использующийся для культивирования,

таким образом, чтобы он мог более эффективно использовать тот кислород, который присутствует в культуральной среде. Они перенесли ген, кодирующий гемоглоби-ноподобное соединение, из грамотрицательной бактерии Vitreoscilla sp. в несколько рекомбинантных бактерий.  Бактериальный гемоглобин связывал кислород среды и поддерживал высокую концентрацию его в клетках, что стимулировало рост и экспрессию чужеродного    белка.    Этот    подход проиллюстрировал возможность весьма неожиданного биологического решения трудной технической задачи.

мерным распределением по всему объему и тщательным перемешиванием культуры, обеспечивающим эффективное диспергирование пузырьков.

Большинство микроорганизмов растут лучше всего при pH от 5,5 до 8,5. Следует иметь в виду, однако, что клеточные метаболиты, поступая в культуральную среду, могут изменять ее pH. Таким образом, необходимо тщательно контролировать pH в ходе ферментации и при необходимости добавлять в ферментер кислоту или щелочь. При этом последние должны быть хорошо перемешаны со средой и равномерно распределены по всему объему.

Еще один параметр, от которого зависит успех ферментации, — температура. Если она ниже оптимальной, то рост микроорганизмов замедляется и интенсивность метаболизма снижается. Если же, напротив, температура слишком высока, то может произойти преждевременная индукция синтеза белка, если он находится под контролем температурочувствительного репрессора, или индукция белков теплового шока, что активизирует клеточные протеиназы и снизит выход белкового продукта.

Тщательное перемешивание культуры необходимо, во-первых, для равномерной доставки питательных веществ к клеткам и, во-вторых, для предотвращения накопления токсичных побочных продуктов метаболизма в каком-нибудь небольшом отсеке биореактора. Эффективное перемешивание относительно легко обеспечить при культивировании в небольших объемах, при крупномасштабном же культивировании поддержание гомогенности культуральной среды становится одной из главных проблем.

Перемешивание культуральной среды влияет и на другие параметры: скорость переноса кислорода из пузырьков газа в жидкую среду, а затем из среды в клетки; эффективность теплопередачи; точность измерения концентрации метаболитов в культуральной жидкости; эффективность диспергирования добавляемых реагентов (кислот, оснований, питательных веществ и т. д.). Исходя из всего этого, можно было бы предположить, что чем интенсивнее культура перемешивается, тем лучше она растет. Однако при чрезмерном перемешивании среды в ней могут возникнуть гидромеханические эффекты, губительные для бактериальных клеток и клеток

356              ГЛАВА 16
млекопитающих, или произойти повышение температуры, которое также скажется на их жизнеспособности. Таким образом, как всегда, нужно соблюдать баланс между необходимостью тщательно перемешивать среду и стремлением сохранить целостность клеток.

Есть еще один аспект, касающийся крупномасштабной ферментации, который не имеет отношения к технической стороне процесса, а касается того, используются ли при этом реком-бинантные микроорганизмы. В большинстве стран крупномасштабное культивирование ре-комбинантных микроорганизмов сопряжено с необходимостью соблюдения определенных правил и инструкций. Хотя большинство рекомби-нантных микроорганизмов не представляют никакой опасности, важно не допустить их случайного попадания в среду. Для этого используются надежные системы, предотвращающие утечку живых рекомбинантных организмов или ограничивающие их распространение, если утечка все же произошла. Кроме того, перед окончательным удалением из установки все рекомби-нантные микроорганизмы должны быть инактивированы в соответствии с определенными инструкциями. Использованную культураль-ную среду тоже необходимо проверять на наличие в ней жизнеспособных микроорганизмов, чтобы исключить их попадание в окружающую среду.

Культуры с высокой плотностью

Вообще говоря, при получении чужеродных белков с помощью рекомбинантных E. coti руководствуются тем, что при максимальной конечной плотности культуры получается и максимальное количество продукта. В ферментерах периодического действия с добавлением субстрата концентрация рекомбинантных клеток E. coliдостигает 50 грамм сухого вещества на 1 л среды (а в некоторых случаях >100 г/л), (Вес сухого вещества клеток Е. coliсоставляет примерно 20—25% веса влажного вещества.)

Один из способов повышения плотности культуры состоит в оптимизации культуральной среды. Следует иметь в виду, что некоторые питательные вещества, в том числе источники углерода и азота, при слишком больших концентрациях замедляют рост клеток. Глюкоза подавляет рост при концентрации >50 г/л, аммиак — при концентрации >3 г/л, железо -->1,15 г/л, магний -- >8,7 г/л, фосфор — >10 г/л, цинк — >0,038 г/л. Таким образом, простое увеличение содержания питательных веществ в культуральной среде при периодической ферментации не даст желаемого результата. Кроме того, поскольку состав сложных сред типа пептона или дрожжевого экстракта может немного различаться от раза к разу, ферментация в них не всегда бывает воспроизводимой.

Ацетат, который может подавлять рост клеток, продуцируется Е. coliпри росте в условиях недостатка кислорода, но избытка глюкозы. Проблему его образования можно решить, если использовать в качестве источника углерода глицерин вместо глюкозы, понизить температуру или использовать рекомбинантный штамм E. coli, способный превращать ацетат в менее токсичные вещества (см. гл. 6).

В культурах с высокой плотностью может также возникнуть недостаток кислорода. Чтобы избежать этого, увеличивают количество поступающего воздуха (разбрызгивание) либо скорость перемешивания или делают и то, и другое. Кроме того, можно подавать в культуру чистый кислород, а не воздух, в котором содержится только 20% кислорода, или выращивать клетки под давлением, чтобы увеличить растворимость кислорода, В качестве альтернативы предлагалось экспрессировать в хозяйских клетках E. coti ген гемоглобина Vitreoscilla, что значительно увеличило бы поглощение кислорода растущими клетками.

Высокой плотности чаше всего удается достичь при росте в периодическом режиме с добавлением субстрата. Режим подачи питательных веществ может быть разным: непрерывным, ступенчатым или экспоненциальным. При непрерывном режиме в среду в течение всей ферментации вносят одинаковые количества питательных веществ. Однако в этих условиях удельная скорость роста непрерывно снижается. При ступенчатом режиме питательные вещества добавляют по мере увеличения концентрации клеток во все большем количестве, так что снижение удельной скорости роста в значительной мере компенсируется. При экспоненциальном режиме питательные вещества добавляют в количестве, обеспечивающем постоянную скорость роста клеток. Периодическую подачу питательных веществ можно автоматизи-

Промышленный синтез белков при участии рекомбинантных микроорганизмов            357
ровать, основываясь на результатах измерения концентрации лимитирующего субстрата (например, глюкозы) в среде в ходе ферментации.