Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
 Скачать 9.74 Mb.
|
Векторные системы на основе Τi-плазмидСамый простой способ использования природной способности Ti-плазмид к генетической трансформации растений предполагает встраивание интересующей исследователя нуклеотидной последовательности в Т-ДНК, а затем использование Ti-плазмид и A. tumefaciens для доставки и встраивания клонированного гена (генов) в геном компетентной растительной клетки. Однако, несмотря на то что Ti-плазмиды являются эффективными природными векторами, имеется ряд серьезных ограничений на их использование в качестве векторов для клонирования. • Фитогормоны, синтезируемые трансформированными клетками в культуре, подавляют регенерацию из этих клеток зрелого растения, поэтому при конструировании векторов на основе Ti-плазмиды гены ауксина и цито-кинина должны быть удалены. • Ген опина несуществен для трансгенных растений, но при его наличии может снижаться конечный выход биомассы, поскольку часть ресурсов расходуется на синтез опина. Следовательно, при создании векторов ген опина также должен быть удален. • Ti-плазмиды имеют очень большой размер (от 200 до 800 т. п. н.), а для экспериментов с рекомбинантными ДНК нужны векторы меньшего размера, поэтому участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены. • Ti-плазмиды не реплицируются в Escherichia coli, что исключает работу с рекомбинантными Ti-плазмидами в этих бактериях. Следовательно, при конструировании векторов на основе Ti-плазмид необходимо ввести в них сайт инициации репликации, обеспечивающий их поддержание в E. coli. Несмотря на все эти сложности было сконструировано несколько векторов для растительных клеток. Все векторы на основе Ti-плазмид организованы сходным образом и имеют следующие элементы. • Селективный маркерный ген, например ген неомицинфосфотрансферазы, который обеспечивает устойчивость трансформированных растительных клеток к канамицину. Поскольку этот ген (как и многие другие маркерные гены, используемые при трансформации растений) по своей природе прокариотический, необходимо поставить его под контроль растительных (эукариотических) сигналов регуляции транскрипции, в том числе промотора и сигнала терминации-полиаденилирования. Это обеспечит эффективную экспрессию гена в трансформированных растительных клетках. • Сайт инициации репликации, который позволяет плазмиде реплицироваться в E. coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации A. tumefaciens. • Правая фланкирующая последовательность Т-ДНК. Этот элемент абсолютно необходим для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений. Большинство же векторов содержат как правую, так и левую фланкирующие последовательности. • Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК. Поскольку клонирующие векторы не содержат генов vir, они сами не способны обеспечивать транспорт и интеграцию Т-ДНК в клетки растения-хозяина. Чтобы решить эту проблему, было разработано два подхода. В первом случае используют бинарную векторную систему (рис. 17.6, А). Бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации репликации и для E. coli, и для A. tumefaciens, но не несет генов vir, т. е. это практически челночный вектор E, coli — A. tumefaciens. Все стадии клонирования прово- 378 ГЛАВА 17
Генная инженерия растений: методология 379 дят в Е. соli, а затем вектор вводят в A. tumefaciens. Штамм-реципиент A. tumefaciensнесет модифицированную неонкогенную («разоруженную») Ti-плазмиду; она содержит полный набор vir-генов, но из нее удалена часть (или вся) Т-ДНК (так что Т-ДНК не может быть транспортирована). В этой системе на неонкогенной Ti-плазмиде синтезируются продукты vir-генов, которые мобилизуют участок Т-ДНК бинарного клонирующего вектора. Продуцируя белки, кодируемые vir-генами, неонкогенная Ti-плазмида выступает в роли помощника, способствуя встраиванию Т-ДНК из бинарного клонирующего вектора в хромосомную ДНК растения. Во втором случае используют коинтегративную векторную систему. Векторная ДНК рекомбинирует в A. tumefaciensс «разоруженной» Ti-плазмидой, Т-ДНК которой не несет опухолеродных генов, таким образом, что весь клонирующий вектор встраивается в неонкогенную Ti-плазмиду (рис. 17.6, Б). Коинтегративный вектор и неонкогенная Ti-плазмида-помощник содержат гомологичные последовательности, которые образуют сайт для гомологичной рекомбинации in vivo. Обычно эти последовательности расположены в Т-ДНК. После рекомбинации клонирующий вектор становится частью неонкогенной Ti-плазмиды, которая содержит vir-гены, необходимые для переноса Т-ДНК в растительную хозяйскую клетку. Единственный способ поддержания клонирующего вектора в A. tumefaciens — это использование такой коинтегративной структуры. В данной конфигурации генетически сконструированный участок Т-ДНК может быть перенесен в растительные клетки. Физические методы переноса генов в растительные клеткиСистемы переноса генов с помощью A. tumefaciensэффективно работают только в случае некоторых видов растений. В частности, однодольные растения, включая основные зерновые культуры (рис, пшеницу и кукурузу), практически не трансформируются A. tumefaciens. Тем не менее, модифицировав методики и тщательно контролируя условия, удалось трансформировать кукурузу и рис агробактериями A. tumefaciens, несущими векторы -- производные Ti-плазмид. Так, например, незрелые зародыши кукурузы помещали на несколько минут в суспензию клеток A. tumefaciens, а затем инкубировали несколько дней в отсутствие селективного давления. После этого зародыши переносили в среду с антибиотиками, в которой могли расти только трансформированные растительные клетки. Эти клетки выдерживали в темноте в течение нескольких недель, затем переносили массу трансформированных растительных клеток на другую питательную среду и инкубировали на свету, чтобы произошла регенерация целого трансгенного растения. В табл. 17.1 перечислен ряд методов трансформации однодольных растений. Некоторые из этих методов требуют удаления клеточной стенки с образованием протопластов. Последние поддерживают в культуре как независимо растущие клетки или в специальной питательной среде, где они образуют клеточные стенки; из таких клеток может быть регенерировано целое растение. Кроме того, разработаны методы трансформации, позволяющие вводить клони- Рис. 17.6. Две векторные системы на основе Ti-плазмид, А. Бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации репликации (ori) и для Е. coli, и для A. tumefaciens(либо сайт инициации репликации для широкого круга хозяев), селективный маркерный ген, который может быть использован либо в E. coli, либо в A. tumefaciens, а также интересующий исследователя ген и растительный селективный маркерный ген, встроенные в Т-ДНК. Б. Коинтегративный клонирующий вектор (вверху} содержит сайт инициации репликации только для Е. collи не может автономно существовать в A, tumefaciens. Он также несет селективный маркерный ген, который используется либо в E. coli, либо в А. tumefaciens, правую фланкирующую последовательность Т-ДНК (П). растительный селективный маркерный ген, ген, который нужно ввести в геном, и фрагмент Τΐ-плазмиды, гомологичный участку ДНК неонкогенной («разоруженной») Τί-плазмиды. Неонкогенная Ti-плазмида (в середине) содержит левую фланкирующую последовательность Т-ДНК (Л), кластер vir-генов и сайт инициации репликации A, tumefaciens (ori). Гомологичная рекомбинация коинтегративного клонирующего вектора с неонкогенной Ti-плазмидой дает рекомбинантную плазмиду (внизу), которая несет клонированный ген и растительный репортерный ген, фланкированные правой и левой концевыми последовательностями Т-ДНК. 380 ГЛАВА 17
рованный ген в небольшое число клеток растительной ткани, из которой можно регенерировать целое растение, обходясь без регенерации из протопластов. В настоящее время для доставки ДНК в клетки растений предпочитают использовать либо векторы на основе Ti-плазмид, либо бомбардировку микрочастицами (табл. 17,1). Таким способом было генетически трансформировано более 50 различных видов растений (табл. 17.2). Бомбардировка микрочастицамиБомбардировка микрочастицами, или биолис-тика, — наиболее многообещающий метод введения ДНК в растительные клетки. Золотые или вольфрамовые сферические частицы диаметром 0,4—1,2 мкм покрывают ДНК, осажденной СаС12, спермидином или полиэтиленгликолем, и «выстреливают» ими в клетки из специального «ружья», приводимого в действие газами, образующимися при сгорании пороха, сжатым воздухом или гелием. Частицы разгоняются до скорости 300—600 м/с и пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. При этом их плотность такова, что клетки практически не повреждаются. Попав в клетку, ДНК, покрывающая частицы, каким-то неизвестным способом интегрируется в растительную ДНК. Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения самых разных видов, в том числе однодольные и хвойные, в которые не удается ввести ДНК с помощью Agrobacterium. Бамбардировку микрочастицами можно использовать также для введения чужеродной ДНК в суспензию растительных клеток, культуры клеток, меристематические ткани, незрелые зародыши, протокормы, колеоптили и пыльцу широкого круга растений (табл. 17.3). Кроме того, Генная инженерия растений: методология 381
с помощью этого метода были транспортированы гены в хлоропласты и митохондрии. На поверхность микрочастиц можно осадить плазмидную ДНК, растворенную в буфере. Это позволяет повысить частоту трансформации путем увеличения количества плазмидной ДНК; однако следует иметь в виду, что слишком большие ее количества могут оказаться губительными для клетки, В трансформированных таким способом клетках, идентифицируемых по экспрессии маркерного гена, введенная ДНК зачастую экспрессируется лишь кратковременно. Пока чужеродная ДНК не встроится в геном растения, она с большой вероятностью утрачивается при делении трансформированных клеток. Как интеграция, так и экспрессия чужеродных генов может зависеть от конфигурации вектора, используемого для их введения. Например, частота трансформации повышается, если используется линейная, а не кольцевая ДНК, Кроме того, при бомбардировке микрочастицами высокомолекулярные плазмиды (МО т, п. н.) могут фрагментироваться, поэтому уровень экспрессии чужеродных генов окажется ниже, чем в случае плазмид меньшего размера. Применение репортерных генов при трансформации клеток растенийДля идентификации трансформированных клеток необходимо уметь обнаруживать чужеродную ДНК, интегрировавшую в геномную ДНК растения. Более того, при исследовании сигналов регуляции транскрипции и их функций в специфических растительных тканях (листьях, корнях или цветках) зачастую важно уметь количественно оценивать уровень экспрессии гена, кодирующего легко идентифицируемый продукт. Все это требует применения репортер-ных генов, которые позволяют либо проводить отбор трансформированных клеток, либо оценивать активность кодируемого ими фермента. Было протестировано несколько разных генов, которые можно использовать как доминантные селективные маркеры, и генов, чей белковый продукт можно обнаружить с помощью специфических методов (табл. 17.4). Поскольку многие из репортерных генов имеют бактериальное происхождение, они были снабжены регуляторными последовательностями, обеспечивающими их экспрессию в растительных клетках. Проводя отбор по доминантному маркеру, можно получить культуру, содержащую только трансформированные клетки. Так, в присутствии канамицина выживают только клетки растений, синтезирующих активную неомицинфосфотрансферазу. Выбор того или иного репортерного гена диктуется характером конкретного эксперимента. Если экспрессия гена мешает нормальному росту растения, то его нельзя использовать как репортерный. Кроме того, по мнению экспертов-биотехнологов, присутствие некоторых генов и их продуктов может приводить к 382 ГЛАВА 17
загрязнению коммерческого продукта. В связи с этим лучше не вводить гены устойчивости к антибиотикам в сельскохозяйственные растения. Некоторые продукты репортерных генов (например, ß-D-глюкуронидазу, а также люциферазу, синтезируемую бактериями и светляками) можно обнаружить в интактных растительных тканях, В системах трансформации чаще всего используется ген ß-D-глюкуронидазы E. coli (GUS-ген), Он кодирует стабильный фермент, обычно отсутствующий в растениях, который катализирует расщепление ß-D-глюкуронидов. Его активность в трансформированных растительных тканях можно обнаружить по появлению синей окраски в результате гидролиза неокрашенного субстрата, 5-бром-4-хлор-3-индолил-ß-D-глюкуроновой кислоты. Альтернативный, более чувствительный метод количественной оценки активности GUS-генов в растительных экстрактах основан на определении интенсивности флуоресценции продукта гидролиза 4-метилумбеллиферил-ß-D-глюкуронида. Эксперименты по экспрессии чужеродных генов в растенияхПосле того как методика трансформации растений была полностью отработана, исследователи стали пытаться вводить различные растительные и бактериальные гены в клетки самых разных растений. Трансформированные растения проверяли на способность к синтезу чужеродного белка, проводили физиологические исследования, чтобы определить, как присутствие этого белка сказывается на всем растении. Во многих ранних экспериментах использовали промоторы, контролирующие конститутивную экспрессию в ряде растительных клеток. Не так давно были выделены и охарактеризованы растительные промоторы, контролирующие экспрессию чужеродных белков в специфических клетках на определенных стадиях роста и развития растения. Например, вместо сильного конститутивного 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты, функционирующего во всех растительных тканях в течение всей жизни растения, ис- Генная инженерия растений: методология 383
пользовали промотор гена малой субъединицы фотосинтетического фермента рибулозобисфосфат-карбоксилазы, работающего только в фотосинтезирующих тканях, например в листьях. Аналогично для контроля экспрессии некоторых чужеродных генов использовали растительные промоторы, функционирующие только в специфических тканях или только при неблагоприятных условиях. Подавляющее большинство генов растений локализованы в ядерной ДНК, однако хлоропласты и митохондрии тоже содержат гены, кодирующие ряд важных и уникальных функций. При этом не все белки, присутствующие в этих органеллах, закодированы в их ДНК, Некоторые из них кодируются ядерной ДНК, синтезируются в цитоплазме, а затем с помощью специального механизма импортируются в соответствующую органеллу. Есть два способа введения специфического чужеродного белка в митохондрии или хлоропласты. Один способ — это слияние гена, кодирующего чужеродный белок, и последовательности сигнального пептида, направляющего белки в ор-ганеллы. Такая конструкция может быть встроена в хромосомную ДНК, и рекомбинантный белок будет импортироваться в соответствующую органеллу. Второй способ предполагает встраивание гена, кодирующего чужеродный белок, непосредственно в хлоропластную или митохондриальную ДНК. Выделение различных промоторов и их использованиеДля выделения растительных промоторов из некоторых видов растений использовали специализированные так называемые «промотор-направленные» векторы и систему трансформации на основе Ti-плазмид Agrobacterium. Суть подхода состоит в следующем. Репортерный ген без промотора встраивают сразу за правой фланкирующей последовательностью вектора на основе Ti-плазмиды, и после переноса Т-ДНК в хромосому растения он оказывается в окружении растительной ДНК. Если Т-ДНК встроится в промоторный участок функционального гена, то произойдет транскрипция репортерного гена. Для идентификации растительных промоторов в качестве репортерного гена можно использовать ген 384 ГЛАВА 17 неомицинфосфотрансферазы (npt). При этом экспрессию данного гена можно проконтролировать отбором канамицинустойчивых трансформантов. Однако таким способом трудно идентифицировать промоторы, функционирующие лишь на определенной стадии развития растения или индуцируемые специфическим фактором окружающей среды. Чтобы быть уверенным в отборе именно трансформированных клеток, в Т-ДНК следом за репортерным геном без промотора встраивают ген устойчивости к гигромицину, находящийся под контролем конститутивного промотора. Сначала отбирают гигромицинустойчивые клетки, а затем проверяют ферментативную активность трансформантов в условиях, обеспечивающих экспрессию репортерного гена. В результате обнаруживается, что от 5 до 30% трансформированных растительных клеток несут репортерный ген, находящийся под контролем активного промотора. 35S-промотоp вируса мозаики цветной капусты часто используют в растительных системах как сильный промотор, хотя уровень экспрессии контролируемого им гена, кодирующего чужеродный белок, часто оказывается ниже, чем хотелось бы. Чтобы решить эту проблему и найти наиболее эффективный промотор, необходимо протестировать в растениях различные конструкции «промотор—ген». Кроме промотора, экспрессию чужеродных генов могут усиливать некоторые другие элементы, в частности эн-хансерные последовательности, расположенные на расстоянии от одной до нескольких сотен нуклеотидов до промотора, интроны, стабилизирующие мРНК, и сигналы терминации транскрипции. Были протестированы ДНК-конструкции, содержащие все или некоторые из следующих элементов: 35S-промотор; сигнал терминации транскрипции гена нопалинсинтазы; от одного до семи тандемных повторов энхансерных элементов; так называемая Ω-последовательность, которая предположительно усиливает экспрессию гена на уровне трансляции. Наиболее эффективная конструкция содержала семь энхансерных элементов, при этом уровень экспрессии чужеродного гена в трансгенных растениях табака и риса был намного выше, чем в случае одного 35S-промотора (табл. 17.5). Протестированные промоторные конструкции контролировали экспрессию в трансгенных растениях широкого круга чужеродных генов. Такое разнообразие, вероятно, объясняется тем, что Т-ДНК встраивалась в разные сайты в геноме растения. Используя этот подход, можно создавать сильные тканеспецифичные промоторы, регулируемые в процессе развития, Введение чужеродных генов в хлоропластную ДНКУ большинства высших растений в каждой клетке листа присутствует примерно 100 хлоропла-стов и каждый хлоропласт содержит примерно 100 копий хлоропластной ДНК. Для стабильной генетической трансформации хлоропластов с целью изменения их функциональных характеристик необходимо вводить чужеродные гены в хлоропластную, а не в хромосомную ДНК. длина которой примерно в l04—105 раз больше. Кроме того, необходимо, чтобы чужеродные гены присутствовали во всех из примерно 104 молекул хлоропластнои ДНК, содержащихся в одной клетке.
Генная инженерия растений: методология 385
Вначале чужеродные гены вводили в ДНК хлоролластов в составе плазмидного вектора, несущего неселективную чужеродную ДНК и селективный маркер, например ген устойчивости к антибиотику, фланкированные специфическими последовательностями хлоропластной ДНК (рис. 17.7). Такая стратегия была весьма эффективной, однако нередко селективный маркер мешал экспрессии фланкирующих хлоропластных генов. Чтобы решить эту проблему, разработали стратегию, в которой селективный маркер и чужеродный ген не были физически связаны друг с другом. Для этого растения табака трансформировали смесью одинаковых количеств двух разных плазмид: одна содержала селективный маркер (ген устойчивости к спектиномицину), фланкированный ДНК из одного участка хлоропластной ДНК, а вторая — чужеродный ген (ген устойчивости к канамицину), фланкированный последовательностями из другого участка хлоропластной ДНК (рис. 17.8). Оба гена имели прокариотические сигналы транскрипции, что обеспечивало их транскрипцию в хлоро-пластах, но не в ядре. Последовательности хлоропластной ДНК в плазмиде были организованы таким образом, что рекомбинация или встраивание в геном хлоропластов не приводила к нарушению работы какого-либо хлоропластного гена. Плазмиды вводили методом бомбардировки микрочастицами, а затем отбирали трансформированные растения табака на среде со спектиномицином. Хлоропласты из отобранных трансформантов проверяли на наличие продукта, детерминируемого геном устойчивости к канамицину (неселективным чужеродным геном). Удивительно, что примерно 30% спектиномицинустойчивых трансформантов экспрессировали также ген устойчивости к канамицину. что указывает на применимость котрансформации для введения чужеродных генов в хлоропластную ДНК.
386 ГЛАВА 17
Получение трансгенных растений, не содержащих маркерных геновОбычно при введении чужеродного гена в растение одновременно вводится и селективный маркерный ген. Хотя до сих пор не было никаких указаний на то, что какой-либо из этих генов оказывает неблагоприятное воздействие на человека, животных или окружающую среду, последствия, к которым в принципе может привести включение в растения селективных маркерных генов, вызвали беспокойство общественности. Например, продукты некоторых маркерных генов могут оказаться аллергенами или токсичными веществами, а гены устойчивости к антибиотикам могут попасть в патогенные почвенные микроорганизмы. Кроме того, присутствие селективных маркеров технически затрудняет трансформацию трансгенных растений дополнительными генами, поскольку один селективный маркер не может использоваться дважды. Чтобы успокоить общественность, были разработаны методы получения трансгенных растений без каких-либо маркерных генов. Один из экспериментальных подходов к получению безмаркерных трансгенных растений включает котрансформацию растений двумя разными ДНК, одна из которых несет маркерный ген, а другая — интересующий исследователя чужеродный ген. В этом случае от 30 до 80% растений содержат оба гена, которые, однако, интегрированы в разные сайты хромосомной ДНК. После отбора трансформантов маркерный ген можно удалить из трансгенного растения с помощью обычного скрещивания. В рамках другого подхода селективный маркерный ген встраивают между растительными мобильными элементами (Ds-элементами) и такую конструкцию вводят в Т-ДНК вместе с геном транспозазы, которая вырезает участок ДНК между Ds-элементами и перемещает его в другой хромосомный сайт (рис. 17.9). В процессе встраивания Т-ДНК в ДНК растения-хозяина в 90% случаев селективный маркер, находящийся между двумя Ds-элементами, оказывается в другом сайте хромосомной ДНК, при этом с вероятностью 50% этот сайт находится далеко от исходного. Таким образом, селективный маркерный ген может использоваться для идентификации трансформированных растений, а затем удаляться при скрещивании. ЗАКЛЮЧЕНИЕС помощью генной инженерии можно вводить чужеродные гены в растительные клетки в культуре с последующей регенерацией целых фертильных растений из отобранных трансформированных клеток. Естественным путем трансформация растений осуществляется с помощью почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens. При поражении растения в нем начинает синтезироваться специфическое вещество. В ответ на этот химический сигнал A. tumefaciens прикрепляется к мембране растительной клетки, после чего происходит перенос части (Т-ДНК) бактериальной плазмиды (Ti-плазмиды) в ядро растительной клетки. Т-ДНК встраивается в растительный геном и экспрессируется. Т-ДНК содержит гены, кодирующие ферменты синтеза фитогормонов, которые вызывают увеличение размеров растительных клеток и их пролиферацию. Кроме того, растительные клетки начинают синтезировать опин, кодируемый Т-ДНК, который может использоваться только A. tumefaciens. Таким образом, в процессе эволюции сформировался механизм превращения растительной клетки в «фабрику» по производству вещества — источника углерода и азота (опина) исключительно для нужд A, tumefaciens. Генная инженерия растений: методология 387 Чтобы использовать природную способность A. tumefaciens проникать в растительные клетки для доставки в них клонированных генов, были созданы модифицированные Ti-плазмиды. Из Т-ДНК удаляли гены фитогормонов и гены метаболизма опина и встраивали такую измененную Т-ДНК в плазмиду, способную стабильно существовать в Е. соli. Встроенный в Т-ДНК ген-мишень попадал вместе с ней в ядро растительной клетки-реципиента. В случае бинарной системы челночный вектор с клонированным в Т-ДНК геном вводят в штамм A. tumefaciens, несущий модифицированную плазмиду с генами, необходимыми для переноса Т-ДНК в клетку растения (vir-генами). Кроме того, разработана коинтегративная система, которая предполагает введение челночного вектора в A. tumefaciens, где он рекомбинирует с неонкогенной Ti-плазми-дой, несущей vir-гены, с образованием одной плазмиды, в которой есть и функционирующие vir-гены, и Т-ДНК с клонированным геном. Участок Т-ДНК A. tumefaciensиспользовали для введения генов в различные растения. К сожалению, эта система применима не для всех видов растений. Эффективным методом доставки ДНК в различные растительные клетки является также бомбардировка микрочастицами (биолистика). Для обеспечения экспрессии чужеродных генов, введенных в растительные клетки, использовали растительные промоторы. Различные промоторы, функционирующие только в определенных растительных тканях или на определенной стадии развития растения, идентифицировали по экспрессии репортерного гена без промотора после его интеграции в хромосомную ДНК растения. Были разработаны методы встраивания чужеродных генов непосредственно в хлоропластную или митохондриальную ДНК так, чтобы кодируемый белок синтезировался прямо в этих органеллах. И наконец, для того чтобы успокоить общественность, были разработаны методы удаления маркерных генов из трансгенных растений. ЛИТЕРАТУРАAn G., V. Kim. 1993. Techniques for isolating and characterizing plant transcription promoters, enhancers, and terminators, p. 155—166. in B. R. Glick, J. E, Thompson (ed.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Fla. Carrer H., P. Maliga. 1995. Targeted insertion of foreign genes into the tobacco ptaslid genome without physical linkage to the selectable marker gene. Bio/Technology 13: 791-794. Christou P. 1992. Genetic transformation of crop plants using microprojectile bombardment. Plant /2:275-281. Dale E. C., D. Ow. 1991. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome. Proc. Natl. Acad. Sei. USa 88: 10558-10562. Goldsbrough A. P., C. N. LastreUa, J. 1. Voder. 1993. Transposition mediated re-positioning and subsequent elimination of marker genes from transgenic tomato. Bio/Technology 11:1286-1292. Grtiber M. Y., W. L. Crosby. 1993. Vectors for plant transformation, p. 89-119, In B. R. Glick, J. E. Thompson (ed.). Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press, Boca Raton, Fla. Halfter U., P. С. Morris, L· Willmitzer. 1992. Gene targeting in Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 231: 186-193. Istiida Y., EL Saito, S. Otita, Y. Hiei, T. Kimari, T. Kumashiro. 1996. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nat. Biotechnol. 14: 745-750. Jefferson R. A., T. A. Kavanagh, M. W. Bcvan. 1987. GUS fusions: ß-glucuronidasc as a sensitive ami versatile gene fusion marker in higher plants. EMBOJ, 6:3901-3907. Klein T. M., E. D. Wolf, R. Wu, J. C. Santord. 1987. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature (London) 327: 70-73. Kriiger-Lebus S., I. Potrykus. 1987. A simple and efficient method for direct gene transfer to Petunia hybridia without electroporation. Plant Mol. Biol. Rep. 5: 289-294. Miki B. L-, P. F. Fobcrt, P. J. Charest, V. N. Iyer. 1993. Procedures for introducing foreign DNA into plants, p. 67-88. In B. R. Glick, J. E. Thompson (ed.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press, Boca Raton, Fla. 388 ГЛАВА 17 Mitsuhara I,, M, Ugaki, H. Hirochika, M. Ohshima, T. Murakami, Y. Gotoh, Y. Katayosc, S. Nakamura, R. Honkura, S. Nfehimiya, K. Lcno, A. Mochizuki, H. Tanimoto, H. Tsugawa, Y. Otsuki, Y. Ohashi. 1996. Efficient promoter cassettes for enhanced expression of foreign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plants. Plant Cell Physio!. 37:49-59. Ow D. W., K. V. Wood, M. DeLuca, J. R. de Wet, D. R. Helinski, S. H. Howell. 1986. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. Science 234: 856-859. Paszkowski J., M. Baur, A. Bogucki, I, Potrykus, 1988. Gene targeting in plants. EMBO J. 7: 4021-4026. Pausl K. P. 1995. Plant biotechnology for crop improvement. B'totechnol. Adv. 13: 673—693. Potrykus 1. 1990. Gene transfer to cereals: an assessment. Bio/Technology 8: 535-542. Potrykus 1. 1991. Gene transfer to plants: assessment of published approaches and results. Anna. Rev. riant Physiol. 41: 205-225. Southgate E. M., M. R. Davey, J. B. Power, R. Marchant 1995. Factors affecting the genetic engineering of plants by microprojectile bombardment. Riotectinoi. Adv. 13: 631—651. Vain P., J. de Buyser, V. Bui Trang, R. Haicour, Y. Henry. 1995. Foreign delivery into monocotyledonous species, fiiotechnol. Adv. 13:653—671. Waiden R., J. Shell. 1990. Techniques in plant molecular biology—progress and problems. Ear. J. Biochem. 192: 563-576. Waiden R., R. Wingender. 1995. Gene-transfer and plant-rege ne ration techniques. Trends Kotechnol. 13:324-331. Voder J. 1., A. P. Goldsbrough. 1994. Transformation system for generating marker-free transgenic plants. Bio/Technology 12: 263-267. Zambryski P. 1988. Basic processes underlying Agrobacterium-meàtateà DNA transfer to plant cells. Antw. Rev. Genet, 22: 1-30. Zambryski P., J. Tempe, J. Schell. 1989. Transfer and function of T-DNA genes from Agrobacterium Ti and Ri plasmids in plants. Cell 56: 193-201. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ1. Почему Ti-плазмида из Agrobacteriumtumefaciensподходит для создания вектора — переносчика чужеродного гена в хромосомную ДНК растения? 2. Чем различаются бинарная и коинтегративная векторные системы? 3. Что такое репортерные гены и как они используются при трансформации растительных клеток? 4. В чем заключается метод бомбардировки клеток микрочастицами, использующийся для трансформации растений? 5. Подробно опишите, как вы будете выделять растительный промотор, специфичный для тканей корней. 6. Как интегрировать чужеродный ген в ДНК хлоропластов? 7. Как получить трансгенное растение, не содержащее маркерного гена? 8. Как повысить активность растительного промотора? | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
