Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с

• Название: Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
• Анкор: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 9.74 Mb.
• Имя файла: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Тип: Документы; #189
• страница: 57 из 88

Часто в ответ на проникновение патогенов растения начинают синтезировать группу специфических PR-белков (от англ, pathogenesis-related proteins). В эту группу входят р-1,3-глюканаза, хитиназа, тауматинподобные белки (тауматин — небольшой, очень сладкий белок) и ингибиторы протеиназ; все они так или иначе воздействуют на патогены. Имея это в виду, ученые попытались вывести растения, устойчивые к болезнетворным грибам, способные конститутивно экспрессировать гены одного или нескольких PR-белков, Так, были получены трансгенные растения, синтезирующие в большом количестве хитиназу, фермент, гидролизующий β-1,4-связи в молекуле N-ацетил-D-глюкозамина, основного компонента клеточной стенки грибов (рис. 18.11).

Среди таких растений были рис, табак и канола. Соответствующие гены, введенные в растительный геном, были поставлены под контроль 358-промотора вируса мозаики цветной капусты. Кроме того, были созданы трансгенные растения табака, которые конститутивно синтезировали не только хитиназу, но и ß-глюканазу. Такие растения были получены скрещиванием одного трансгенного растения, экспрессирующего ген хитиназы, с другим, экспрессирующим ген ß-глюканазы. Трансгенные растения, синтезирующие хитиназу, были более устойчивы к болезнетворным грибам, чем контрольные, даже при том, что последние синтезировали собственные PR-белки в ответ на инфицирование грибами. Кроме того, при этом способность полезного гриба Glomusmosseaeзакрепляться на корнях растений никак не нарушалась. Возможно, это связано с различиями в составе клеточных стенок данных грибов. Существенно, что трансгенные растения, конститутивно синтезирующие хитиназу, не были подвержены грибковым заболеваниям в полевых условиях. По-видимому, описанный подход окажется весьма эффективным способом защиты растений от патогенных грибов.

По оценкам, ущерб, наносимый урожаю картофеля в результате поражения этой культуры патогенной почвенной бактерией Erwinia carotovora, составляет примерно 100 млн. долл. в год. Положение усугубляется тем, что у растений не выявлено никаких способов защиты от данной инфекции, которые можно было бы использовать для выведения устойчивых коммерческих сортов. Чтобы решить эту проблему, группа исследователей вывела трансгенные растения картофеля, активно экспрессирующие ген лизоцима бактериофага Т4, При этом лизоцим секретировался в апопласт (межклеточное пространство), компартмент, в который проникает и где распространяется E. carotovora. Чтобы обеспечить специфичность секреции, к гену лизоцима фага Т4 была «пришита» последовательность, кодирующая сигнальный пептид α-амилазы ячменя, и ген помещен под транскрипционный контроль 35S-промотоpa вируса мозаики цветной капусты, сигнала терминации транскрипции и сайта полиаденилирования. Хотя ген лизоцима находился под контролем столь сильного промотора, синтезировалось лишь очень небольшое количество лизоцима. Однако трансгенные растения, геном которых содержал такую конструкцию, оказались устойчивыми к большим количествам E. carotovora и в лабораторных условиях, и в оранжерее. В естественных условиях эти болезнетворные бактерии присутствуют в гораздо меньших количествах, чем те, которые ис-

Генная инженерия растений: применение           403

Светоиндуцируемая экспрессия химерного гена, введенного в Nicotianatabacumс помощью Ti-плазмидного вектора
L. Herrera-Estrelia, G. Van den Broeck, R. Maenhaut, M. Van Montagu, J. Schell, M. Timko, A. Cashmore Na/ure3W: 115-120, 1984

С разработкой Ti-плазмидной системы трансформации растений у исследователей появилась возможность введения в них чужеродных генов с целью синтеза различных ценных белковых продуктов. Вначале большинство генов, вводимых в растительные клетки, находились под транскрипционным контролем сильного   конститутивного  35S-промотора вируса мозаики цветной капусты или немного менее сильного конститутивного промотора гена нопалинсинтазы, содержащегося в некоторых Т-ДНК. Однако для получения растений с новыми полезными признаками часто бывает необходимо, чтобы специфические белки синтезировались только в определенной тка-

ни, например в листьях или корнях, или только на определенной стадии развития растения, например во время развития проростка, образования плода или в условиях высокотемпературного  стресса. Первый шаг к выведению таких растений был сделан Херрера-Истреллой с сотрудниками, которые сконструировали химерный ген, содержащий следующие элементы: 5 '-фланкирующий участок гена малой субъединицы рибулозо-бифосфат-карбоксилазы гороха; колирующий участок бактериального гена хлорамфеникол-ацетил-трансферазы; 3'-фланкирующий участок гена нопалинсинтазы, содержащий сигналы терминации транскрипции и полиаденилиро-

вания мРНК. Обычно ген малой субъединицы рибулозобисфосфат-карбоксилазы     экспрессируется только в зеленых или фотосинтезирующих тканях; как и ожидалось, там же экспрессировался ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы. Это была одна из первых работ, показавших, что, несмотря на всю свою сложность, растительные промоторы  способны  обеспечивать синтез гетерологичных белков в строго определенных тканях. Впоследствии  разнообразные  растительные промоторы широко использовались для регуляции экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях в нужных тканях и на определенных стадиях развития.

пользовались в лабораторных испытаниях, так что есть надежда, что упомянутая генетическая конструкция сможет обеспечить надежную защиту растений. Кроме того, поскольку лизоцим лизирует различные грамположительные и грамотрицательные бактерии, этот подход можно будет использовать для защиты растений от самых разных болезнетворных бактерий.