I. общая часть (бактериология, микология, вирусология, микробная экология, санитарная микробиология)
 Скачать 5.14 Mb.
|
2. Принципы современной классификации микробов. Понятие о виде, разновидности, биовариантах, серовариантах, фаговариантах.Неклеточные формы – царство вирусов: viruses, viroids, prions (инфекционные белки) Клеточные формы: 1. Надцарство эукариоты: 1.1. Царство животные с подцарством простейшие. 1.2. Царство растения. 1.3. Царство грибы. 2. Надцарство прокариоты: 2.1. Царство бактерии: ➢ Собственно бактерии ➢ Микоплазмы – нет клеточной стенки ➢ Спирохета – есть осевая нить из микрофибрилл (как нитка, намотанная на карандаш) – сгибательные, поступательные и вращательные движения ➢ Хламидии – абсолютные паразиты на клеточном уровне (не могут синтезировать АТФ) ➢ Риккетсии – абсолютные паразиты на клеточном уровне (не могут синтезировать НАД) Б. могут потерять стенку клеточную под действием антибиотиков (Л-форма может быть у собственно бактерий и спирохет) Название микроорганизма – биноминальное наименование (родовой эпитет + видовой эпитет) Понятие о виде, разновидности, биовариантах, серовариантах, фаговариантах. Вид (species) — основной таксон в классификации бактерий — эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющих экологическое единство и близкий генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими признаками и антигенной структурой. Критерий репродуктивной изоляции у некоторых бактерий не является строгим, всегда выражен лишь до уровня семейств, возможен обмен генетическим материалом между близкородственными родами (например, Salmonella, Shigella, Escherichia) и приобретение бактериями новых свойств (например, изменение спектра чувствительности к антибиотикам). Подвиды (внутривидовые категории) — совокупность популяций определенного вида, отличающихся рядом признаков, не препятствующих объединению в вид. 1. Вариант (вар) — совокупность популяций микроорганизмов определенного вида, отличающихся по свойствам. Различают морфо-, гено-, ферменто-, серо-, био- (резистенс-, фаго-), эковары. Морфовары - варианты, отличающиеся от основного вида по морфологическим свойствам; Хемовары - по биохимическим свойствам; Серовары - по антигенной структуре; Резистовары - по чувствительности к АБ; Фаговары - по чувствительности к бактериофагам; Геновары - по строению части генома; Биовары - по нескольким биологическим свойствам. 2. Штамм (нем. stammen — происходить, ствол, основа) — чистая культура микроорганизмов, выделенная из одного определенного источника (организма, окружающей среды). Другими словами, штамм — конкретный образец (изолят) данного вида. 3. Чистая культура — совокупность микроорганизмов одного вида или варианта, полученная из одного образца и содержащаяся в определенном объеме среды (например, в пробирке). Выделение чистых культур бактерий необходимо для их идентификации. После идентификации и определения свойств чистая культура становится штаммом. Разные штаммы одного и того же вида бактерий могут отличаться друг от друга по ряду свойств (например, по чувствительности к антибиотикам, способности к образованию токсинов, ферментов). Штаммы имеют различия по месту и времени выделения. При описании нового штамма один образец культуры в жизнеспособном состоянии должен быть сдан в официально признанную коллекцию культур. 4. Клон (греч. klon — росток) — генетически однородная чистая культура микроорганизмов, полученная из одной материнской клетки. 3. Основные методы исследования морфологии бактерий. Микроскопия. Методы окраски микробов и их отдельных структур.Основные методы: - Микроскопические = бактериоскопический: приготовление мазков для микроскопирования. Оценка формы, размеров, взаиморасположение, наличие капсулы, спор, жгутиков, включений. Оценка тинкториальных свойств (восприимчивость к красителям) - Микробиологические (культуральные): посев на питательную среду для выделения чистой культуры и её идентификации - Биологические методы: определение токсинов возбудителя в материале, заражение лабораторных животных - Серологические: выявление АТ в сыворотке крови - Аллергологические: проведение аллергических проб для обнаружения состояния гиперчувствительности к возбудителю или его продуктам - Молекулярно-биологический: ПЦР МИКРОСКОПИЯ: Световая и электронная микроскопия (вместо световой волны используют пучок электронов, что увеличивает чувствительность). Иммерсионная микроскопия (наиболее часто). Люминесцентная микроскопия (оценка реакции иммунофлюоресценции). Фазовоконтрастная микроскопия используется, как правило, для обнаружения очень тонких (например, спирохеты, жгутики бактериальной клетки) или высоко прозрачных (например, микоплазмы) объектов. Устройство микроскопа с иммерсионной системой. Разрешающая способность и увеличение микросокопа. В качестве иммерсионного микроскопа служит обычный биологический микроскоп, но оснащенный специальным объективом (маркированным черной полосой). Принцип метода заключается в том, что иммерсионное масло, обладая коэффициентом преломления чрезвычайно близким к коэффициенту преломления стекла, делает потерю световых лучей на границе сред стекло предметного стекла/масло и масло/стекло объектива минимальной, что улучшает качество микроскопической картины и увеличивает разрешающую способность микроскопа. Правила: плоское зеркало; открытая диафрагма; поднятый конденсор; иммерсионный объектив; иммерсионное масло Правила микроскопии неокрашенных препаратов. С целью изучения формы и подвижности бактерий микроскопию микроорганизмов можно проводить в живом состоянии без окрашивания. Для этого готовят мазки «раздавленная» и «висячая» капля и наблюдают их с помощью темнопольной и фазово-контрастной микроскопии. Приготовление мазка «раздавленная капля». На предметное стекло по центру наносят каплю или жидкой культуры или физ.раствора, в который вносят исследуемую культуру. Нанесенную на предметное стекло каплю раздавливают с помощью покровного стекла. Затем на покровное стекло наносим каплю иммерсионного масла и микроскопируем. При фазовоконтрастной микроскопии мы будем наблюдать подвижность и форму бактерий темного цвета на светлом фоне. При темнопольной микроскопии – подвижность и форму бактерий светлого цвета на темном фоне. Метод «висячей капли»: необходимо иметь предметное стекло с лупочкой. Каплю культуры наносят на покровное стекло, сверху накладывают предметное стекло с лупочкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предметное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. Принцип темнопольной микроскопии С этой целью обычный биологический микроскоп оснащается специальным темнопольным конденсором. Принцип его действия заключается в том, что все прямые лучи минуют объектив, куда попадают лишь те из них, которые преломились на объекте микроскопирования. Поэтому микроорганизмы видны как светящиеся объекты на темном фоне. Темнопольная микроскопия наиболее часто используется для обнаружения спирохет, так как позволяет визуализировать очень тонкие объекты. Принцип фазово-контрастной микроскопии Для этого обычный биологический микроскоп оснащается специальной приставкой с особым набором линз. Принцип её действия заключается в том, что смещение фазы световой волны, происходящее при её прохождении через прозрачные для нашего глаза объекты и не воспринимаемое человеческим глазом (собственно именно поэтому такие объекты и выглядят прозрачными), преобразовывается в изменение амплитуды световой волны. А изменение этого параметра воспринимается нашим глазом – объект становится видимым. Фазово-контрастная микроскопия используется, как правило, для обнаружения очень тонких (например, спирохеты, жгутики бактериальной клетки) или высоко прозрачных (например, микоплазмы) объектов. МЕТОДЫ ОКРАСКИ МИКРОБОВ И ИХ ОТДЕЛЬНЫХ СТРУКТУР: Методы окраски: Простые: одна краска- метиленовый синий, генциан виолет- на 3 минуты. Сложные методы окраски: По Граму- способность удерживать комплекс генциан- фиолетового с йодом. Грам + синие, Грам – красные. По Цилю-Нильсону- на кислотоустойчивость. Некислотоустойчивые- синий цвет, кислотоустойчивые –красный цвет. Окраска спор по методу Ожежки. Споры- красный цвет, вегетативные формы- синий. Окраска зерен волютина по Нейсеру. Зерна волютина- темно-синий цвет. Цитоплазма- желтый. Обнаружение капсул по Бурри-Гинсу. Бактерии- красный цвет, капсулы- неокрашенные. Этапы: 1) Подготовка стекла (обезжирить) 2) Приготовление мазка (продезинфицированной бактериальной петлей маленькую каплю материала, небольшое количество воды или физ.р-ра добавляют к мазку, тонким слоем распределяют тонким слоем петлей) 3) Высушивание (на воздухе) 4) Фиксация (фиксируют пламенем горелки – бактерии погибают, но прочно прикрепляются к стеклу, что улучшает восприимчивость окраски) Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. 1 – этап, 1 краситель. Определяют форму, размер и взаиморасположение клеток. Пример: метиленовый синий, водный фуксин При сложных (дифференцирующих) методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, включения и т. д.). Пример: по Граму, по Цилю-Нильсену Окраска по Граму - выявление клеточной стенки 1) Генцианвиолет – 2 мин 2) Промыть водой 3) Р-р Люголя – 1 мин 4) Промыть водой 5) Спирт – 30 сек 6) Промыть водой 7) Водный фуксин – 2 мин Г+ бактерии – удерживают генциантвиолет в комплексе с йодом = фиолетовая окраска Г- бактерии – после спирта утрачивают краситель, обесцвечиваются и при фуксине = красный цвет Окраска по методу Циля-Нильсена – определение спор красные - споры, вегет.кл – синяя: 1) карболовый фуксин над спиртовкой до появления паров – 5 раз 2)остудить, промыть водой 3) серная кислота 1% - 30 сек 4)промыть водой 5)метиленовый синий – 5-10 минут Окраска по методу Нейссера – определение волютина в Corynebacterium diphtheria: 1) На фиксированный мазок добавить ацетат синьки Нейссера на 2-3 мин 2) + р-р Люголя на 10-30 сек 3) Промыть водой 4) + водный р-р везувина или хризоидина на 30-60 сек 5) Промыть водой, высушить, микроскопировать Зерна волютина – щелочная реакция, поэтому будут темно-синими. Цитоплазма – кислая среда – желтый цвет Окраска по Романовскому-Гимзы – определение нуклеотида: 1) Кислотный гидролиз в р-ре соляной кислоте при нагревании 2) Промыть водой 3) Окрасить краской Романосвого-Гимзы (азур, эозин, метиленовый синий) 40-60 мин 4) Промыть водой 5) Высушить Азур и метиленовый синий окрашивают участки клети с слабощелочым рН, а эозин с кислым рН: ядра будут красными Негативное контрастирование по Бурри-Гинсу – выявление капсулы: 1) Смешать черную тушь с культурой и высушивают 2) Фиксация в пламени горелки 3) Окрашиваие по Гинсу – водный фуксин на 1 мин 4) Промыть водой Капсульные бактерии не воспринимает красители, поэтому на темном фоне будет хорошо видна бесцветная капсула и цветные тела бактерий |