Шұжық өнімдері үшін шикізат көзі. Перизат диссертация. Жаманкулова перизат мажитовна
 Скачать 1.82 Mb.
|
|
Таблица 3 – Подбор компонентов крови для заменных трансфузий, при несовместимости матери и новорожденного по антигенам эритроцитов системы Резус
При несовместимости мать-плод по антигенам эритроцитов других систем, индивидуальный подбор крови доноров проводится среди образцов, не имеющих антигенов, к которому найдены антитела, явившиеся причиной заболевания, с учетом АВО совместимости. Эритроциты доноров для заменных трансфузий должны быть совместимы с сывороткой новорожденных. Для заменных трансфузий используют эритроцитсодержащие среды малых сроков хранения. При использовании для заменных трансфузий цельной консервированной крови, целесообразно предварительно удалять из нее лейкоциты лейкофильтрацией, а также применять радиационное облучение. Возможно использование для проведения иммуногематологических исследований (скрининг и идентификация антител к антигенам эритроцитов) сыворотки новорожденного. При подозрении на ГБ одновременно исследуют элюат, полученный с эритроцитов новорожденного. Исследование антител проводят антиглобулиновым тестом. Специальный подбор крови проводится в лаборатории с использованием антиглобулинового теста. При выявлении клинически значимых антител для трансфузии выбираются эритроциты без соответствующего антигена. В случае выявления клинически малозначимых антител – для трансфузии подбираются эритроциты, подобранных в тесте на совместимость. Медицинские организации, заготавливающие кровь, обязаны иметь резерв эритроцитов с гомозиготными фенотипами для подбора крови иммунизированным реципиентам. 4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 4.1Сравнительная оценка результатов выявления антиэритроцитарных антител. Полиморфизм серологических реакций Прежде чем приступить к оценке особбенностей реагирования разных образцов антител и методов их выявления представлялось целеобразным установить частоту распределения антител в зависимости от их специфичности ( табл 8). Таблица 8. Распределение антиэритроцитарных антител по специфичности
По частоте встречаемости в проядке убывания антитела располагались в следующей последовательности aнти-D aнти-K aнти-E aнти-c aнти-C aнти-C w, что совпадает со шкалой приоритета трансфузионно опасных антигенов эритроцитов, расчитанной ранее. Новым важным свойством, характеризующим серологические параметры антиэритроцитарных антител, явилась их способность агглютинировать эритроциты на плоскости при комнатной температуре в комбинации со смесью конглютининов. Далеко не все сыворотки проявляли эти свойства (табл 9) Таблица 9. Протокол исследования сывороток на плоскости в комбинации с фиколлверографином
Только 15,6% образцов агглютинировали нативные эритроциты на плоскости в присутствии конглютинина. Из всех исследованных сывороток агглютинация на плоскости чаще регистрировалась с образцами, содержащими антитела к антигенам системы Rhesus. В частности, сывороток с aнти-D-антителами, реагирующими на плоскости было 3 (5,8%) из 51. Образцы с анти-с-антителами также встречались в 5,8% случаев. Подобные серологические свойства антител наблюдали также с 2 (3,9%) образцами анти-К-антител. Количество сывороток анти-D (анти- DС), реагирующих на плосоксти, равнялось 3 из 35, что составило 8,5%. Из сывороток анти-с на плоскости в комбинации с фиколл-верографином реагировала половина образцов 3 (50%) из 6. Такое же распределение наблюдали при исследовании сывороток анти-К. 2 образца (50%) агглютинировали эритроциты, 2 – не агглютинировали. Сыворотки анти-Е, взятые в комбинации с фиколл-верографином, с эритроцитами на плоскости при комнатной температуре не реагировали. Среди исследуемых образцов были 4 категории активности сывороток (табл 10). Первая категория включала сыворотки с низким титром антител (Ц-1 16), вторая – со средним титром (1 32 – 1 256). В третьей категории объединены сыворотки с титром 1 512 и выше. Особую (четвертую) категорию составили сыворотки, антитела в которых выявлялись не всеми методами. Таблица 10. Протокол исследования титра сывороток разными методами
Реакция конглютинации с 33% полиглюкином оказалась наименее чувствительной Число сывороток, в которых антитела не были выявлены этим методом, составило 34 из 356 В то же время антитела в большинстве из этих сывороток выявлялись другими сравниваемыми методами. Число сывороток, показавших титр Ц - 1 16 при использовании реакции с 33% полиглюкином, равнялось 152, что составило 42,7% всех исследованных образцов. При использовании других методов число сывороток с указанным диапазоном титра было меньшим 127 сывороток при использовании реакции с 10% желатином, 115 и 116 образцов при использовании непрямой пробы Кумбса и 2-этапной пробы, 67, 56, 80 образцов при использовании соответственно ферментного метода, метода Кумбс-фермент и гелевой технологии. Число сывороток с высоким титром, 1 32-1 256 и 1 512 и выше, при использовании реакции с 33% полиглюкином, соответственно, уменьшалось по сравнению с другими методами. Наибольшее число сывороток с высоким титром регистрировалось при использовании гелевой технологии, пробы Кумбса и метода Кумбсфермент. Желатиновый метод уступал по чувствительности этим методам и располагался на шестом месте перед реакцией с 33% полиглюкином. По чувствительности практически одинаковыми оказались ферментный метод - 50,2% сывороток с титром антител 1 32 - 1 256 (125 сыворотки из 249), гелевая технология - 49,8% сывороток с титром антител 1 32 - 1 256 (164 сыворотки из 329) и метод Кумбс-фермент- 51,6% сывороток с титром антител 1 32 - 1 256 (128 сывороток из 248. Наибольший интерес представляла четвертая категория сывороток, к которой были отнесены образцы с антителами, не выявлявшимися какимлибо из методов. Проведенные исследования показали, что наибольший процент невыявленных антиэритроцитарных антител имел место при использовании метода с 33% полиглюкином (9,6%). Далее следует метод с 10% желатином этим методом не выявлены антитела в 14 сыворотках (3,9%). В непрямой пробе Кумбса, 2-этапной модернизированной пробе и ферментном методе антитела не выявлялись в 8 (2,2%), 7 (2%) и 4 (1,6%) сыворотках соответственно. В противоположность этому в более чувствительных методах Кумбс-фермент и гелевом - не были выявлены антитела всего в 2 (0,7%) и 1 (0,4%) сыворотке Таблица 11. Протокол титрования антител, которые были выявлены не всеми методами
1 - метод с 33% полиглюкином 2 - реакция с 10% желатином 3 - непрямая пробы Кумбса 4 - 2-этапная модернизированная проба 5 - ферментный метод 6 - метод Кумбс-фермент 7 - гелевый метод 0 - антитела не выявлены Ц - антитела выявлены в цельной сыворотке (не титруются) 2, 4, 8 и т д - титр 1 2, 1 4, 1 8 и т д Сравниваемые методы проявляли неодинаковую чувствительность по отношению к разным образцам сывороток, отличающихся как специфичностью содержащихся в них антител, так и их активностью (табл 5). В частности, антитела, имеющие относительно низкий титр (12-14) при титровании методом с 10% желатином (всего 17 образцов), не всегда удавалось выявить методом с 33% полиглюкином (строки 1 - 3, 7 - 11, 20, 22 - 24, 30 33, 36). Из них 8 сывороток с анти-О-антителами (47%), 4 - с анти-К (23,5%), 3-е анти-Е-антителами (17,6%) и по 1 сыворотке (5,8%) с анти-Си анти-Си'-антителами. Несмотря на то, что антитела проявляли незначительную активность и присутствовали в низком титре, они хорошо идентифицировались другими методами Исключением служили 2 сыворотки (анти-С, анти-Е,) с таким же титром антител, но детектируемые этим методом (строки 21, 25). Количество образцов сывороток, содержащих анти-Кангитела, не детектируемых методом с 33% полиглюкином, составляло 6 (18%) (строки 31 - 36). Напротив, другими методами антитела в этих сыворотках выявлялись. Из них в 5 сыворотках (строки 31 - 33 , 35, 36) антитела присутствовали в низком титре (1 2 - 1 8), а в одном образце (строка 34) титр антител был достаточно высоким (1 64) Отдельные исследованные сыворотки представляли собой исключение. Антитела, содержавшиеся в них, не выявлялись высокочувствительными методами. В частности с помощью методов, отличающихся, по общему мнению специалистов-иммуносерологов, наибольшей чувствительностью, эти антитела выявлялись с трудом, в то время как с помощью метода Кумбсфермент они выявлялись четко и титровались. Так, в одной из сывороток (строка 12) анти-О-антитела не были выявлены с помощью гелевого метода, однако, методом Кумбс-фермент эти антитела были обнаружены. В образцах анти-D и анти-С (строки 12 - 14, 16 - 19) антитела детектировались и титровались (титр 12-14) при использовании ферментного метода и метода Кумбс-фермент. В то же время в непрямой пробе Кумбса и 2-этапной пробе с использованием антиглобулина эти антитела выявить не удалось (строка 12, 14, 16-18) Сыворотки со слабыми анти-с- и анти-С"-антителами (строки 28, 29) имели титр 12-14 при использовании ферментного метода и метода Кумбс-фермент. Эти антитела не выявлялись непрямой пробой Кумбса и 2этапной пробой. Некоторые из антиэритроцитарных антител (в основном анти-К) не детектировались в ферментном методе (строки 31, 33, 35, 36), что, по-видимому, связано с модификацией К-антигена под действием протеолитических ферментов (Nevauhnna et al, 1978, Scott et al, 1994, H В Минеева, 2000, А А Рагимов и соавт, 2000), либо зависит от иных физикохимических свойств как антигенов, так и самих антител В то же время ферментный метод и метод Кумбс-фермент хорошо выявляют слабо реагирующие антитела системы Rhesus, что делает их особенно ценными для скрининга именно этих антител. Частота антиэритроцитарных антител, относящихся к субклассу IgGl, в популяции русских составила 51,2%, комбинация антител IgGl+IgG3 зарегистрирована у 39,2% сенсибилизированных (табл 6). Антитела IgG3 без примеси IgGl, IgG2 и IgG4 встречались значительно реже - в 3,9% случаев. Частота антител IgG2 и IgG4 без примеси антител IgGl и IgG3 также оказалась невысокой и составила 5,7% Таблица 6. Частота антиэритроцитарных антител IgGl и IgG3 у аллосенсибилизированных лиц русской национальности
Изучение частоты распределения субклассов антител в зависимости от их специфической направленности, позволило выявить некоторые особенности анти-О-антител, отличающие их от антител другой специфичности (табл 7). Таблица 7. Частота антиэритроцитарных антител IgG в зависимости от их специфичности
1 - различия достоверны по сравнению с анти-С-антителами (р<0,05) 2 - различия достоверны по сравнению с анти-Е-антителами (р<0,05) 3 - различия достоверны по сравнению с анти-К-антителами (р<0,01) 4 - различия достоверны по сравнению с анти-с-антителами (р<0,01) Анти-Б-антитела с одинаковой частотой были представлены как IgGl (48,0%) так и комбинацией IgGl+IgG3 (48,1%). Таким образом, 96% сывороток анти-D содержали антитела, относящиеся к IgG 1-субклассу. Большинство анти-К-антител (86,5%) также было представлено IgGl-субклассом, что ставит их в один ряд с анти-О-антителами. Уместно подчеркнуть, что анти-К-антитела располагаются после анти-Б-антител и по степени клинической значимости. Частота анти-С-антител, относящихся к IgGl, достоверно превышала частоту анти-С-антител других субклассов и составляла 55,3%. Для анти-с-антител характерна более высокая частота комбинации IgGl+IgG3 (56,2%). Обращает на себя внимание относительно высокая частота антител анти-Е, относящихся к субклассам IgG2 и IgG4 - 18,1%. По литературным данным (С И Донсков, 2005), анти-Е-антитела встречаются чаще, чем антис, однако по клинической значимости существенно уступают последним. В шкале приоритета трансфузионно опасных антител анти-Е-антитела занимают место после антител анти-с. Возможно, меньшее клиническое значение анти-Е-антител обусловлено тем, что они чаще, чем другие антитела, представлены иммуноглобулинами субклассов G2 и G4. В связи с небольшой выборкой анти-С™- и анти-е-антител достоверных данных о частоте распределения субклассов IgG в этой категории специфичностей получить не представилось возможным Тем не менее, можно отметить, что даже в столь малой выборке (табл 7) анти-С"-антитела чаще, чем анти-е-антитела, представлены иммуноглобулинами G1. Указанное обстоятельство совпадает с известными данными о том, что анти-С™-антитела в значительно большей степени трансфузионно опасны, чем анти-е. С целью установления IgG-субкласса антител, которые не выявляются каким-либо из методов было исследовано 22 образца. Представлялось интересным выяснить, нет ли какой-либо зависимости между способностью антител проявлять себя в том или ином методе и принадлежностью их преимущественно к какому-нибудь одному из IgG-субклассов (табл 8). Таблица 8. Распределение IgG-субклассов в образцах антител, не выявляемых каким-либо из методов
Из 22 трудно детектируемых образцов антител 14 (63,6%) относились к IgGl. На долю антител IgG3 пришлось только 2 образца (9,1%) из указанного количества. Комбинированные антитела, IgGl+IgG3, также встречались в 9,1% случаев. Интересно отметить, что 4 образца (более 18%) из невыявленных антител относились к IgG2, IgG4, что свидетельствует в пользу того, что часть не детектируемых антител не принадлежит к клинически значимым. Вместе с тем при рутинном скрининге антител имеется высокий риск пропустить трансфузионно значимые антитела, особенно, если используются менее чувствительные методы исследования. Основанием для такого заключения служит то обстоятельство, что большая часть из невыявленных антител (82%) относится к IgG 1 и IgG3. Как было установлено (табл 9), из 202 образцов антител IgG 1 и IgG3 в 9% случаев (18 сывороток), антитела не были выявлены. Для группы, не содержащей IgGl и IgG3, процент сывороток с невыявленными антителами был в 3,6 раза выше (36,3%). Из 11 сывороток, в которых антитела были представлены субклассами IgG2 и IgG4, в 4 образцах антитела не выявлялись. Таблица 9. Частота распределения IgG-субклассов в образцах антител, выявляемых и не выявляемых отдельными методами
Таким образом, невыявляемые антитела относительно чаще представлены иммуноглобулинами субклассов G2 и G4, трансфузионное значение которых не столь высоко, как антител IgGl и IgG3. Таблица 10. Частота распределения субклассов IgG в образцах антител, не выявляемых каким-либо из методов
Методом с 33% полиглюкином не были выявлены 17 образцов антител (85%), принадлежащих к субклассам IgGl и IgG3 (табл 10). Примерно такое же распределение наблюдали при использовании непрямой пробы. Кумбса из 7 сывороток в 6 случаях (85,7%) невыявленные антитела относились к иммуноглобулинам G1 и G3. Из образцов антител, невыявленных желатиновым методом, 7 (около 78%) относились к IgGl и IgG3. Двухэтапной модернизированной пробой не детектировано 5 образцов (83,3%) IgGl и IgG3 из 6 сывороток. Для ферментного метода было характерно следующее соотношение из 4 сывороток в 3 (75%) имелись антитела IgGl и IgG3, в одной антитела этих субклассов отсутствовали. Методом Кумбс-фермент не выявлены два образца антител, относящихся к IgGl В гелевом методе не выявлен один образец антител, принадлежащих к IgG2 и/или IgG4. Антитела, как известно, активируют комплемент по классическому пути, который начинается с взаимодействия Clq, компонента комплемента с комплексом антиген – антитело. Фиксация антител на эритроцитах сама по себе не повреждает клетки. Однако последующее связывание комплемента с комплексом антиген - антитело может приводить к их разрушению. Femstein et al в 1986 году показали, что первое место по способности взаимодействовать с Clq-компонентом комплемента занимают иммуноглобулины IgG3-субкласса, далее активность убывает в последовательности IgG3 > IgG I > IgG2 > IgG4. Иммуноглобулины IgG2 слабо активируют систему комплемента. Антитела IgG4-cy6icnacca практически не связываются с Clq-компонентом и, по данным Vlug et al (1989), не способны активировать комплемент по классическому пути. Lynen et al (1994), Garner et al (1995), Asmussen et al (1996) нашли, что IgGl и IgG3 в большей степени активируют комплемент и оказывают сильное разрушающее действие на клетки, что в свою очередь обусловливает клиническое значение этих антител. Повреждающее действие IgG2 меньше, а антитела IgG4-cy6miacca слабо разрушают или вообще не разрушают клетки, в связи с чем, клиническое значение этих антител невелико. Опосредованный антителами гемолиз in vitro зависит от активности комплемента, а также от принадлежности антител к той или иной групповой системе. Наиболее выраженными гемолитическими свойствами после групповых антител АВО обладают резус-антитела. Среди последних более выраженная гемолитическая активность характерна для анти-О-антител. Антитела системы Келл не обладают, либо в незначительной степени обладают таковой. По данным Molhson et al, (1997) около 20% образцов анти-К-антител активируют СЗ-компонент комплемента, однако гемолиза in vitro не вызывают. Как было установлено (табл 11) из 204 сывороток 19 (9,3%) обладали гемолизирующей активностью. Из всех исследованных сывороток гемолиз чаще регистрировался в образцах, содержащих антитела к антигенам системы. Резус (табл 11) В частности, сывороток с анти-О-антителами, проявляющих комплементсвязывающую активность, было 10. Гемолиз наблюдали также с 3 образцами анти-К, 2 - анти-Е, по 1 - анти-DCEK, анти-DC, анти-DE и анти-с. Вряд ли можно думать, что гемолиз, вызванный анти-DCEK- и антиDC-антителами был связан с анти-С-специфичностью. По-видимому, он был обусловлен антителами анти-D, анти-Е и анти-К, которым сопутствовали анти-С-антитела. Основанием для такого заключения послужили полученные нами данные о том, что ни одна из 5 моноспецифических сывороток анти-С, 5 анти-С" и 2 анти-Се не проявляла гемолизирующей активности. Таблица 11. Частота антител, обладающих и не обладающих гемолизирующими свойствами, в зависимости от их активности (титра)
Частота гемолизирующих антител в выборках, сформированных по специфичности, характеризовалась следующими значениями. Из 82 сывороток, содержащих анти-О-антитела, 10 (12,2%) обладали, а 72 (87,8%) не обладали гемолизирующими свойствами, среди 13 сывороток анти-К 3 (23%) проявляли гемолизирующую активность, из 18 сывороток, содержащих анти-Е-антитела, зафиксированы две, обладающие гемолизирующей активностью (11,1%), из 16 сывороток, содержащих анти-с-антитела, гемолизирующую активность наблюдали только в 1 случае (6,2%). По специфичности гемолизирующие антитела распределялись следующим образом анти-D 68%, анти-К - 2 Г/о, анти-Е - 21%, анти-с - 5%. Наибольшая абсолютная частота образцов, проявляющих комплементсвязывающие и гемолизирующие свойства, приходилась на выборку анти-D, затем анти-К-антител, что еще раз характеризует анти-D- и анти-Кантитела как наиболее трансфузионно опасные. Третье и четвертое место, исходя из полученных нами данных, занимают анти-Е- и анти-с-антитела. Наибольшая относительная частота образцов, проявляющих комплементсвязывающие и гемолизирующие свойства, приходилась на анти-К-, затем па анти-О-антитела Далее следовали анти-Е- и анти-с-антитела. Следующая серия экспериментов включала исследование гемолизирующих свойств антител в зависимости от их титра (табл 11) С этой целью сыворотки разделили на две группы с высоким и низким титром. Из 204 исследованных сывороток 69 (33,8%) содержали антитела, проявляющие невысокую специфическую активность (титр 12-1 32), в 135 (66,2%) присутствовали высокоактивные антитела (титр 1 64 - 1 2048). В первой группе сывороток, с относительно низким титром антител, 13% (9 из 69) обладали гемолизирующими свойствами, 87% сывороток (60 из 69) не проявляли гемолизирующую активность. Среди сывороток с относительно высоким титром антител (1 64 - 1 2048) частота образцов, проявляющих гемолизирующие свойства, была почти в 2 раза ниже - 7,4% (10 из 135 сывороток). Антитела, не проявляющие таких свойств, в этой группе составляли 92,6% (125 из 135 сывороток). Из 135 сывороток с высоким титром антител 121 (89,6%) содержала антитела системы Резус, 8 (6%) содержали помимо антирезус-антител антиК-антитела Из них 9 сывороток обладали гемолизирующими свойствами, что составило 6,6%. Нами было исследовано 13 сывороток с анти-К-антителами 7 с низким и 6 с высоким титром антител. Интересной особенностью анти-Кантител оказалось то, что по сравнению с антирезусными антителами они чаще проявляли гемолизирующие свойства. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в противоположность бытующему мнению антиэритроцитарные антитела, имеющие относительно низкий титр, представляют собой не меньший фактор риска развития посттрансфузионных гемолитических осложнений, чем антитела с высокой серологической активностью. Анализ распределения субклассов IgG в образцах антител, которые обладали комплементсвязывающими свойствами (табл 12) показал, что все они относились к субклассу IgGl и IgG3 или представляли собой смесь IgGl+IgG3 44% (7 образцов) содержали IgGl, 18% (4 образца) - IgG3, 38% (5 образцов) приходилось на комбинацию IgGl+IgG3. Среди этих антител образцы, не содержавшие IgGl и IgG3, как мы и предполагали, обнаружены не были. Это объясняется тем, что именно IgGl, IgG3 в большей степени обладают комплементсвязывающей активностью и, соответственно, имеют большее клиническое значение. Таблица 12. Распределение lgG-субклассов в антителах, обладающих гемолитическими свойствами
Гемолизирующая активность антител соответствовала 3 - 25% гемолизу (табл 13). Так, из всех исследованных сывороток 25 % гемолиз наблюдали только в образцах с анти-О-антителами (строки 3, 9). Из 11 сывороток, содержащих анти-О-антитела, в том числе комбинированные, в 8 сыворотках активность антиэритроцитарных антител была достаточно высока (титр антител 1 32 - 1 512) (строки I, 2, 6 - 9, 10, 13). Однако лишь в одном образце титр антител в какой-то мере соответствовал степени гемолиза 25% (строка 9) Из 3-х сывороток анти-D с титром 18-1 16 одна сыворотка служила исключением вызывала 25% гемолиз (строка 3). В сыворотках с антителами других специфичностей 1 анти-с, 1 анти-Е и 3 анти-К также не наблюдалась связь между степенью гемолизирующей активности (6 - 12% гемолиз) и титром антител (14-1 64) (строки 11, 14-16). Таблица 13. Активность антител, обладающих гемолизирующими свойствами
Таким образом, высота титра и специфичность антител не коррелировали с уровнем их гемолизирующей активности. Наблюдалась тенденция увеличения степени гемолиза в сыворотках, содержащих анти-О-антитела. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
