Шұжық өнімдері үшін шикізат көзі. Перизат диссертация. Жаманкулова перизат мажитовна
 Скачать 1.82 Mb.
|
|
1.2 Новые правила и технологии иммуногематологического обследования беременных 1.4 Количество беременных женщин по Жамбылской области Таблица 1. Количество беременных женщин по Жамбылской области на 31 декабря 2018-2020 гг
Материалы_и_методы_исследование'>2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Материалы и методы исследование Материалом исследования служили 356 сывороток крови, содержащих аллоиммунные антиэритроцитарные антитела с титром от Ц ( реакция с цельной сывороткой) до 1 8192, предоставленные 19 учреждениями службы крови, содержащие групповые антигены в различных сочетаниях (табл 1) Таблица 1. Характеристика исследованного материала
Отдельные сыворотки с относительно высоким титром антител представляли собой образцы, взятые из большого объема сырья, предназначенного для производства тестовых реактивов, другие сыворотки были заготовлены в небольших объемах в прцессе скринига антител у пациентов лечебно-профилактических учреждений РК и имели активность и титр. Тестирование сывороток проводили с использованием стандартных нативных и консервированных эритроцитов, имеющих различные сочетания групповых антигенов, собственного производства, а также 3-11 клеточных панелей стандартных эритроцитов с известной антигенной структурой производства Bio-Rad (Франция), Gryfols (Испания), Dia-Med (Швейцария). Использовали стандартные поли- и моноклональные реагенты для титпирования групповых антигенов эритроцитов отечественных и зарубежных фирм, антиглобулиновые сыворотки, 33% полиглюкин, 10% желатин, ID-карты (Bio-Rad, Dia-Med) для скринига и идентификации антител в непрямой пробе Кумбса, ID-карты (Dia-Med) для определения субклассов иммуноглобулинов IgG1 и IgG3, протеазу-С. Сравнивали 7 принятых в РК методов выявления антиэрироцитарных антител, используя их в соответствии с действующими инструкциями, методическими рекомендациями и другими источниками экспресс-метод с 33% полиглюкином, реакцию конглютинации в пробирках с 10% желатином, непрямой антиглобулиновый тест, 2-этапную модернизированную пробу, гелевый тест, ферментный метод и его модификацию с добавлением преципитирующе й антиглобулиновый сыворотки – Кумбс-фермент. Определяли активность, специфичность и титр антител, их принадлежность к субклассам IgG1 и IgG3. В последнее десятилетие уделяется большое внимание валидации методов анализа Нормативных документов, касающихся валидации серологических методов, применяемых в иммуногематологии, нам найти не удалось, поэтому валидация методик проводилась только по двум параметрам. Под чувствительностью (пределом определения) понимали способность метода детектировать антиэритроцитарные антитела в низком титре. Чувствительность методов оценивали как визуально, по авидности антител, агглютинирующих эритроциты, так и путем микроскопирования при сомнительных или отрицательных результатах. За титр антител принимали максимальные разведение сыворотки, при котором определялась агглютинация эритроцитов к минутам наблюдения. Воспроизводимость результатов иммуносерологических ракций оценивалась путем двукратного повторения серий исследований с одними и теми же реактивами при одних и тех же рабочих условиях в течение короткого периода времени. С целью определения субкласса иммуноглобулинов стандартные эритроциты инкубировали с исследуемыми сыворотками, отмывали и затем тестировали с сыворотками анти-IgG1 и анти- IgG3. О наличии антител, относящихся к субклассу IgG1 и IgG3, судили по агглютинации эритроцитов, нагруженных соответствующими антителами. Отсутствие агглютинации эритроцитов с сыворотками анти- IgG1 и анти- IgG3 служило показателем того, что антитела, адсорбированные на эритроцитах, относятся к субклассу IgG2 и IgG4. Для характеристики серологических параметров антиэритроцитарных антител исследовали их способность агглютинировать эритроциты на плоскости в комбинации с фиколл-верографином – конглютинином, способствующим проявлению агглютинирующей активности неполных антител на плоскости при комнатной температуре. Исследование проводили путем смешивания тестируемой сыворотки с фиколл-верографином 3 к 1, и далее 1 реакции учитывали визуально через 5 минут по наличию или отсутствию агглютинации при покачивании пластинки. Для ферментного метода использовали 0,1% раствор протеазы-С. Трижды отмытые 0,9% NaCl эритроциты инкубировали с пятью объемами раствора протеазы-С в течение 45 минут при температуре 37ºС. Затем эритроциты дважды отмывали 0,9% NaCl и готовили 5-7% взвесь в физиологическом растворе. Исследование проводили на плоскости путем смешивания равных объемов исследуемой сыворотки и энзимированных эритроцитов. Результат реакции учитывали визуально через 10 минут при осторожном покачивании пластинки по наличию или отсутствию агглютинации. О достаточности энзимирования эритроцитов судили по их способности агглютинироваться неполными анти-D-антителами на плоскости в солевой среде. В качестве контроля на специфичность реакции энзимированных эритроцитов использовали сыворотки, свободные от антител. Комплементсвязывающую активность сывороток оценивали по степени гемолиза ( от 3% до 50% по шкале гемолиза). Для этого к трижды отмытым 0,9% NaCl эритроцитам, нагруженным исследуемыми антителами, добавляли свежую сыворотку AB(IV), содержащую комплемент. Смесь выдерживали в течение 10 часов при температуре 6-8 ºС, далее инкубировали в течение 1 часа при температуре 37 ºС, после чего учитывали степень гемолиза путем сравнения испытуемого образца с контрольными образцами, имеющими окраску, соответствующую гемолизу 6%, 12%, 25% и 50%. Приготовление контрольных образцов осуществляли путем добавления 2 объемов 5% уксуной кислоты к 1 объему плотно упакованного осадка эритроцитов (100% гемолиз). Контрольные образцы 50%, 25%, 2%, 6% гемолиза готовили из образца со 100% гемолизом путем разведения его дистиллированной водой в 2,4,8,16 раз соответственно. Статистическую обработку данных и построение диаграмм осуществляли с помощью программы Microsoft Access, Microsoft Exel и статистического пакета SPSS 12 для Windows (программа автоматизированной статистической обработки). Для удобства обработки данных титр антител выражали в ступенях разведения (1 2 – 1-я ступень, 1 4 – 2-я ступень и так далее до 13 ступени, соответсвующей разведению 1 8192). Статистическую значимость (достоверность) различий между группами устанавливали посредством описательного (дескриптивного) анализа (с вычислением медианы и квартилей), использовали критерий Колмогорова-Смирнова, критерий Уилкоксона для сравнения 2-х зависимых выборок (С Гланц, 19998). Выявление антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител осуществляется для диагностики гемолитической болезни новорожденных, а также при иммунологических конфликтах при несовместимости по групповой или резус-принадлежности в процессе беременности. Реакция гемагглютинации - один из основных методов, с помощью которого определяют эритроцитарные антигены. Агглютинация эритроцитов опосредована антителами. Скорость и выраженность этого процесса зависят от числа эритроцитов, концентрации антител, рН, температуры и ионной силы раствора. Агглютинация происходит, когда силы связывания превышают силы отталкивания, обусловленные отрицательным зарядом клеточной поверхности эритроцитов. IgM, несущие 10 участков связывания, вызывают агглютинацию эритроцитов даже в физиологическом растворе. IgG не могут вызвать агглютинацию, пока отрицательный заряд эритроцитов не будет снижен с помощью какого-либо высокомолекулярного вещества (например, бычьего альбумина) или удаления сиаловых кислот (для этого эритроциты обрабатывают протеазами: фицином, папаином, бромелином или трипсином). Агглютинация также зависит от доступности, т. е. количества и локализации молекул антигена на поверхности эритроцита. Антигены системы AB0 (эритроцитарные антигены A и В ) находятся на внешней поверхности клеточной мембраны и поэтому легко связываются с антителами, а антигены системы Rh - в ее толще. Доступность таких антигенов повышается при обработке эритроцитов ферментами. Антиглобулиновый тест или Проба Кумбса - метод лабораторной диагностики, основанный на реакции гемагглютинации. Основной метод диагностики аутоиммунных гемолитических анемий - проба Кумбса. В основе ее лежит способность антител, специфичных к иммуноглобулинам (особенно к IgG) или компонентам комплемента (особенно СЗ), агглютинировать эритроциты, покрытые IgG или СЗ. Связывание IgG и СЗЬ с эритроцитами наблюдается при аутоиммунной гемолитической анемии и лекарственной иммунной гемолитической анемии. Прямой антиглобулиновый тест (Прямая проба Кумбса) - применяется для выявления антител или компонентов комплемента, фиксированных на поверхности эритроцитов. Проводится он следующим образом: - для получения антител к человеческим иммуноглобулинам (антиглобулиновой сыворотки) или комплементу (антикомплементарной сыворотки) животное иммунизируют человеческой сывороткой, иммуноглобулинами или комплементом человека. Полученную от животного сыворотку очищают от антител к другим белкам; - эритроциты больного отмывают физиологическим раствором для полного удаления сыворотки, которая нейтрализует антитела к иммуноглобулинам и комплементу и может стать причиной ложноотрицательного результата; - если на поверхности эритроцитов фиксированы антитела или компоненты комплемента, добавление антиглобулиновой или антикомплементарной сыворотки вызывает агглютинацию эритроцитов. Прямую пробу Кумбса применяют в следующих случаях: - аутоиммунный гемолиз; - гемолитическая болезнь новорожденных; - лекарственная иммунная гемолитическая анемия; - гемолитические трансфузионные реакции. Непрямой антиглобулиновый тест (Непрямая проба Кумбса) позволяет обнаружить антитела к эритроцитам в сыворотке. Для этого сыворотку больного инкубируют с донорскими эритроцитами группы 0, а затем проводят прямую пробу Кумбса. Непрямую пробу Кумбса применяют в следующих случаях: - определение индивидуальной совместимости крови донора и реципиента; -выявление аллоантител, включая антитела, вызывающие гемолитические трансфузионные реакции; - определение поверхностных эритроцитарных антигенов в медицинской генетике и судебной медицине; - подтверждение однояйцовости близнецов при трансплантации костного мозга. По способности вызывать гемолиз и разрушение эритроцитов плода при иммунологическом конфликте мать-плод, антитела подразделяют на имеющие и неимеющие клиническое значение. Клиническое значение антител- способность вызывать гемолитическое посттрансфузионное осложнение или гемолитическую болезнь новорожденного. Клинически значимые антитела, это антитела способные вызывать разрушение эритроцитов, несущий соответствующий антиген. Анти-А, В, антитела всегда имеют клиническое значение. Среди иммунных антител клиническое значение имеют только те антитела, которые активны в непрямом антиглобулиновом тесте, выполняемом при температуре +37ºС. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||