.П. Бочков - КЛИНИЧЕСКАЯ - ГЕНЕТИКА. Медицинская генетика,Бочков, 2014 (1). Медицинская генетика Медицинская генетика БиблиографияМедицинская генетикаЭлектронный ресурс
 Скачать 2.91 Mb.
|
|
Глава 7. Диагностика наследственных болезней 7.1. ПРИНЦИПЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ Раздел диагностики - один из самых важных и сложных в наследственной патологии. Сложность обусловлена тем, что наследственных болезней очень много, клиническая картина каждой формы разнообразна, имеется много сходных симптомов при разных болезнях. Даже в пределах каждой специальности наследственные заболевания многочисленны и многообразны: в неврологии - свыше 300 наследственных болезней, в дерматологии - свыше 250, в офтальмологии - свыше 250. К тому же большинство форм наследственных болезней встречается крайне редко (1 на 100 000 и реже), и врач в своей практике мало или совсем не встречает таких пациентов. Врачу не под силу владеть всем запасом знаний, необходимых для диагностики редких наследственных болезней, даже в рамках его специальности. Следовательно, он должен знать общие принципы диагностики наследственных болезней. Они позволят ему заподозрить наследственную болезнь у пациента и провести «прицельное» обследование. Диагностика наследственных болезней основывается на данных врачебного осмотра и обследования, генеалогического анализа, параклинических и лабораторно-генетических методов. Ход постановки диагноза наследственной болезни должен быть, по меньшей мере, двухэтапным: общее клиническое обследование в соответствии с характером клинической картины (анамнез, осмотр, врачебные методы, лабораторные анализы, инструментальные исследования); при подозрении на конкретную наследственную болезнь необходимо провести специализированное дифференциально-диагностическое обследование вместе с врачом-генетиком с использованием диагностических атласов, компьютерных диагностических программ, лабораторно-генетических методов. С генетической точки зрения при общем клиническом обследовании больного диагностика должна завершиться одним из трех заключений: четко поставлен диагноз ненаследственного заболевания (острая пневмония, дизентерия, конъюнктивит, экзема и т.д.); четко поставлен диагноз наследственной болезни (болезнь Дауна, полипозный рак толстой кишки, нейрофиброматоз, ахондроплазия, хорея Гентингтона и т.д.); имеется подозрение, что основная или сопутствующая болезнь является наследственной. Диагностика наследственных болезней не всегда «прямолинейна». Кажущиеся на первый взгляд ненаследственные заболевания могут быть осложнением или проявлением скрытой наследственной патологии. Например, пиелонефрит часто возникает у больных с наследственными врожденными аномалиями мочевой системы; нарушение сердечного ритма может быть проявлением наследственного синдрома Элерса-Данло; хроническая пневмония часто является проявлением муковисцидоза. Наряду с оценкой общих особенностей клинических проявлений наследственных болезней (см. гл. 6), необходимо придерживаться следующей схемы обследования, чтобы не пропустить наследственное заболевание. 1. Существенным признаком, указывающим на наследственную пато- логию, является нарушение течения беременности и пренатального развития плода. Признаками наследственных болезней у плода могут быть: мало- и многоводие, малая подвижность плода, симптомы прерывания беременности. Особенно надо обращать внимание на пренатальную гипоплазию (синдром внутриутробной задержки развития плода), т. е. несоответствие размеров и массы плода или новорожденного гестационному сроку. Для некоторых наследственных болезней характерно избыточное развитие в пренатальном периоде (внутриутробная макросомия). Разумеется, все выше перечисленные признаки не обязательно встречаются при наследственной патологии. Подробная беседа с женщиной о протекании и «событиях» беременности позволяет правильно использовать информацию. 2. Наиболее очевидные признаки наследственной патологии - врожденные пороки развития. Полный осмотр больного дает возможность выявить врожденный порок развития. Он может быть изолированным (в одном органе), системным (в пределах одной системы органов) и множественным (в органах двух и более систем). 3. Важным элементом обследования больного с клинико-генетичес-кой точки зрения является антропометрия. Нарушения роста скелета, диспропорциональность развития отдельных частей скелета являются специфическими признаками наследственных болезней. Для диагностики наследственных болезней полезными оказыва- ются следующие антропометрические сведения: рост, масса тела, телосложение, длина конечностей и их частей, окружность груди и черепа, соотношение сагиттального и латерального размеров черепа. Антропологические показатели пациента сравниваются с контрольными данными. Если они «выходят» за пределы допустимых вариаций, то они являются диагностическими признаками. 4. При осмотре пациентов наряду с выявлением врожденных пороков развития и проведением антропометрии необходимо обращать внимание на микроаномалии развития, или врожденные морфогенетические варианты. Они являются неспецифическими признакамиэмбрионального дисморфогенеза. Для дифференциальной диагностики наследственных болезней необходимо распознавать следующие наиболее распространенные признаки пре- и постнатального дисморфогенеза. 1. Кожа: ангиомы, телеангиэктазии, пигментные пятна, веснушки темные (более 20), депигментация, гипертрихоз, гирсутизм, липомы, фибромы, венозная сеть, келоидные рубцы, ихтиоз, повышенная растяжимость, нарушение потоотделения. 2. Ногти: широкие, короткие, вогнутые; дистрофия, гипоплазия, аплазия. 3. Волосы: сухие, редкие, шерстистые; алопеция (тотальная, гнезд-ная), седая прядь надо лбом, «мыс вдовы», низкий рост волос на лбу и/или на шее. 4. Подкожная жировая клетчатка: избыточное отложение, уменьшенное количество, липомы. 5. Мышцы: гипертрофия, гипотрофия, аплазия. 6. Череп: микроцефалия, гидроцефалия, макроцефалия, брахицефа- лия, долихоцефалия, костные выступы или дефекты, выступающий лоб, плоский затылок. 7. Ушные раковины: микротия, макротия, деформированные, низ- копосаженные, отклоненные назад, оттопыренные, завитки со сглаженным упрощенным рисунком, предушные фистулы, пре-душные папилломы. 8. Область глаз и глаза: эпикант, страбизм (косоглазие), монголоид- ный разрез, антимонголоидный разрез, гипертелоризм, гипоте-лоризм, телекант, колобома радужки, двойной или тройной ряд ресниц, миопия, гиперметропия, птоз, блефарофимоз, короткая глазная щель, гетерохромия радужек, синофриз, микрофтальм, экзофтальм, голубые склеры. 9. Лицо: плоское, круглое, треугольное, вытянутое, с грубыми чертами. 10. Нос: седловидная переносица, широкая плоская переносица, короткий нос, открытые вперед ноздри, плоские крылья носа, клювовидный нос. 11. Губы и рот: фильтр (длинный, короткий, плоский, глубокий), губы (тонкие, толстые); макростомия, микростомия, короткая уздечка языка, множественные уздечки губ, микроглоссия, мак-роглоссия. 12. Челюсти: прогения, ретрогения, микро- и макрогения, микро- и макрогнатия, диастема (верхняя, нижняя). 13. Зубы: гипоплазия эмали, неправильная форма, неправильное расположение, врожденный избыток зубов, врожденное отсутствие одного или нескольких зубов. 14. Небо: плоское, высокое, арковидное, готическое; расщепление язычка. 15. Шея: короткая и длинная, кривошея, низкая линия роста волос, крыловидные складки. 16. Грудная клетка и позвоночник: долихостеномелия, воронкообразная, килевидная, дополнительные соски, гипертелоризм сосков, сколиоз, кифоз, лордоз, пиломидальная ямка. 17. Конечности и сустав: укороченные или удлиненные, Х- или О-образные, переразгибание суставов, полидактилия, олигодак-тилия, брахидактилия, арахнодактилия, клинодактилия, камп-тодактилия, синдактилия, широкий первый палец, гипоплазия первого пальца, укорочение отдельных пальцев, поперечная ладонная складка, одна складка на пятом пальце, плоскостопие, косолапость, полая стопа, конская стопа. 18. Мочеполовая система: крипторхизм, гипоспадия, шалевидная мошонка, увеличенный клитор. 7.2. ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ Лабораторная диагностика наследственных болезней развивалась параллельно с пониманием генетической этиологии болезней и их патогенеза. Так, например, биохимическая диагностика алкапто-нурии была осуществлена 100 лет назад; в 30-х годах ХХ века была открыта простая реакция для диагностики фенилкетонурии (зеленая окраска в реакции мочи с хлоридом железа). Широкое применение лабораторных методов диагностики наследственных болезней началось в 50-х годах, и их арсенал быстро пополнялся. В практику входили многочисленные методы лабораторных исследований: биохимический, иммунологический, цитологический, гематологический, цитогенетический, молекулярно-био-логический. Это способствовало прогрессу клинической генетики, что в свою очередь стимулировало развитие лабораторно-генетичес-ких методов. Лабораторная диагностика наследственных болезней может быть направлена на идентификацию одной из трех «ступеней»: этиологии, первичного звена патогенеза, вторичных изменений патогенеза. Первая ступень - этиология болезни, т.е. характеристика генотипа, а точнее - выявление конкретной мутации у обследуемого индивида. Это могут быть генные, хромосомные или геномные мутации. Генные мутации выявляются молекулярно-биологическими методами, хромосомные и геномные - цитогенетическими. Вторая ступень - выявление первичного продукта патологического гена, т.е. первой ступени патогенеза. Для его регистрации применяют точные биохимические, иммунологические или имму-ноферментные методы. Третья ступень - регистрация специфических метаболитов измененного обмена, возникающих в процессе реализации мутантного первичного продукта или его отсутствия. Эта ступень выполняется на уровне клеток или жидкостей (кровь, секрет, моча) с использованием биохимических, иммунологических, цитологических методов. В данной главе будут рассмотрены только принципы трех специфически генетических лабораторных методов. Они входят в арсенал методик всех медико-генетических консультаций и проводятся врачом-лаборантом вместе с фельдшером-лаборантом. Наибольшее место в диагностической практике занимают цитогенетические и биохимические методы, реже - молекулярно- генетические. 7.2.1. Цитогенетические методы Изучение строения и функции хромосом привело к выделению самостоятельного раздела области науки - цитогенетики. Началом развития цитогенетики человека можно считать 50-60 годы, когда впервые появились публикации работ, в которых удалось получить убедительные картины морфологии всех Х-хромосом человека и правильно определить их диплоидное число. Суть цитогенетических методов, при всем разнообразии отдельных этапов, заключается в микроскопическом анализе хромосом, позволяющем выявить числовые и структурные изменения хромосомного набора (кариотипа), так называемые хромосомные и геномные мутации. В 50-х гг. нашего столетия использование цитогенети-ческих методов послужило толчком к открытию этиологии нового класса заболеваний у человека - хромосомных болезней. В 1959 г. впервые появились сообщения о специфических изменениях числа хромосом при синдроме Дауна (добавочная 21-я хромосома), аномалиях в системе половых Х-хромосом. Далее, в течение достаточно короткого периода времени описаны и другие хромосомные болезни. Цитогенетические методы стали широко входить в медицину. Было выявлено, что множественные пороки развития у новорожденных часто обусловлены нарушением хромосом. Значительная часть хромосомных и геномных мутаций выявлена у мертворожденных и спонтанно абортированных эмбрионов. Стала развиваться и цитоге-нетика злокачественных опухолей человека. Таким образом, в настоящее время цитогенетика прочно вошла в клиническую медицину. Методы цитогенетического исследования можно условно подразделить на прямые и непрямые.Прямые методы - это методы получения препаратов делящихся клеток без культивирования.Непрямые методы - это получение препаратов хромосом из клеток, культивированных в искусственных питательных средах. При обоих методах объектом цитогенетического исследования являются хромосомы в стадии метафазы митоза, поскольку, как уже говорилось выше, именно на этой стадии возможна точная идентификация хромосом и выявление их нарушений. Исследование хромосом в мейозе также возможно, однако у человека это связано с методическими трудностями в получении биоптатов из половых желез. Прямые методы позволяют проводить хромосомный анализ клеток опухолей, но в основном используются для изучения костного мозга. Костный мозг получают при стернальной пункции, помещают его в питательную среду, добавляют колхицин (он останавливает деление клеток на стадии метафазы митоза), инкубируют клетки около 2-3 часов при 37 °С, а затем готовят препараты хромосом. Непрямые методы связаны с культивированием клеток. Наиболее простым и доступным методом в клинической цитогенетике являет- ся анализ хромосом лимфоцитов периферической крови человека на стадии метафазы. Для этого используется цельная периферическая кровь, полученная при соблюдении стерильных условий, в количестве 1,0 мл. Кровь помещают в питательную среду с добавлением митогена ФГА (фитогемагглютинина), стимулирующего митотичес-кое деление лимфоцитов. Далее культура помещается в термостат и при 37 °С культивируется 48-72 часа. За 2 часа до окончания культивирования вводится колхицин. Приготовление препаратов хромосом проводится по общепринятым методам, описанным в соответствующих лабораторных справочниках. Препараты хромосом можно получать и из других клеток и тканей, используя различные модификации описанного метода культивирования лимфоцитов. Так, в пренатальной диагностике наиболее часто используют получение хромосом из клеток ворсин хориона, плаценты, пуповинной крови и амниотической жидкости, эмбриональных органов. Разработаны различные варианты приготовления препаратов хромосом путем «прямых» методов, краткосрочной культивации, культивирования в течение 2-3 суток и, наконец, длительного культивирования в течение нескольких недель. Очень важным моментом для анализа хромосом является их окрашивание. Сплошное или равномерное окрашивание хромосом получило название рутинной окраски. Для рутинной окраски используют простые красители: азур-эозин или краситель Гимза. Пример метафазной пластинки, окрашенной красителем Гимза, представлен на рисунке (рис. 7.1). Использование такого метода окрашивания позволяет провести подсчет хромосом и их групповую принадлежность, проанализировать повреждения хромосом, называемые хромосомными аберрациями (рис. 7.2). Однако этот метод имеет ограничения при кариотипировании, поскольку не дает возможности индивидуальной идентификации хромосом. Методы окраски хромосом, дающие достаточно полное представление о кариотипе, появились в 70-х гг. нашего столетия - это методы дифференциального окрашивания хромосом. Большое практическое значение этих методов состоит в том, что дифференциальная окраска позволяет идентифицировать все хромосомы человека, благодаря специфическому линейному рисунку - продольной окрашиваемости для каждой хромосомы в соответствии с типом окраски. На практике наибольшее применение получили методы дифференциальной окраски красителем Рис. 7.1. Метафазная пластинка; окрашивание хромосом красителем Гимза Гимза (G-окраска) и флюоресцирующим красителем акрихином или акрихин- пиритом (Q-окраска) (рис. 7.3). Для каждого из видов окраски разработаны многочисленные модификации технического выполнения этапов, в этих случаях применяется трехбуквенная система обозначения вида окраски. Например, G-метод с применением трипсина (GTG); Q-метод с использованием акрихина и его производных (QFQ) и т.д. Методы дифференциального окрашивания пригодны для анализа хромосом, полученных из культур клеток любых тканей. Цитогенетические методы сразу же нашли практическое применение в диагностике хромосомных болезней. Клиническая картина при хромосомных синдромах достаточно специфична, но есть и стертые формы, трудные для клинической диагностики. Их невозможно клинически дифференцировать. В этих ситуациях определяющей является цитогенетическая диагностика. Так, например, на консультацию по поводу бесплодия обратились супруги (23-24 лет), живущие в браке 3 года. Жена в течение 3 лет наблюдалась в женской консультации по поводу бесплодия и получала все это время достаточно интенсивную терапию. При этом муж не был обследован. При осмотре мужа врачом-генетиком был заподозрен синдром Клайнфельтера (высокий рост, скудное оволосение по женскому типу, избыточное развитие молочных желез, недоразвитие одного яичка). При цитогенетическом исследовании кариотипа подтвержден диагноз синдрома Клайфельтера. Его хромосомный набор - 47,XXY. Эта хромосомная патология и явилась причиной бесплодия. В середине 70-х гг. исследования цитогенетиков показали, что большинство крупных и малых сегментов метафазных хромосом образуются путем слияния субсегментов, которые более четко видны на ранних стадиях митоза - профазы и прометафазы. На этих стадиях хромосомы менее конденсированы, недоспирализованы и поэтому имеют большую линейную подразделенность. Далее были разработаны различные методы получения делящихся клеток на стадии прометафазы. Таким образом, метод анализа хромосом на стадиях профазы и прометафазы дал возможность более точно устанавливать точки разрывов в перестроенных хромосомах, если в перестройку Рис. 7.2. Метафазная пластинка с хромосомными абберациями (указаны стрелочками) Рис. 7.3. Метафазная пластинка с дифференциальной окраской хромосом (46,XY) акрихин-ипритом вовлечены небольшие участки хромосом. Такие аномалии называют микроперестройками. Использование этого методического подхода позволило получить хромосомы с разной степенью сегментации - от 550 до 2500 сегментов на гаплоидный набор (для сравнения в метафазных хромосомах средней конденсации число сегментов на гаплоидный набор составляет 350-400). С точки зрения практического использования анализа промета-фазных хромосом, этот метод целесообразно применять для диагностики болезней с микроперестройками в структуре одной или нескольких хромосом (транслокации, делеции, инверсии) для уточнения локализации точек разрывов хромосом. Иногда аномальные хромосомы, претерпевшие транслокацию, появляются в результате разрывов двух различных хромосом и их последующего аберрантного объединения. Транслокация может происходить de novo в половых клетках одного из родителей, но может и представлять собой наследование мутации, произошедшее у одного из предков. Носители транслокаций клинически здоровы. Эти и другие структурные перестройки хромосом часто являются причиной спонтанных абортов, мертворождений, неонатальной смертности и бесплодия. Например, в консультацию обратилась супружеская пара по поводу привычного невынашивания беременности. Из анамнеза: пять самопроизвольных выкидышей на сроке до 8 недель, клиническое обследование супругов не выявило особенностей. При цитогене-тическом обследовании выявлено, что кариотип мужа нормальный (46, XY), а у жены - 45,XX,t(13;14), т.е. выявлена транслокация. При такой транслокации нет изменений у носительницы, но в мейозе у нее образуются аномальные гаметы. Некоторые микроструктурные перестройки хромосом выявляют при множественных врожденных пороках развития, при различных злокачественных новообразованиях до развития клинических проявлений. Так, показано, что в ряде случаев в клетках ретиноб-ластомы, остеосаркомы, феохромоцитомы, имеются хромосомные перестройки (делеции хромосом). Однако при некоторых нозологических формах даже использование таких высокоразрешающих методов хромосомного анализа не приводит к обнаружению хромосомных повреждений. Это может свидетельствовать о генетической гетерогенности самих заболеваний, а также, возможно, и о пределе разрешающих возможностей описанного метода. Относительно недавно в арсенале лабораторной цитогенетики появились высокоразрешающие методы - молекулярно-цитогенети- ческий метод гибридизации in situ, в частности флуоресцентная гибридизация in situ, или FISH-метод. Метод гибридизации in situ основан на обработке препаратов хромосом специфическим ДНК-зондом, который присоединяется к исследуемой хромосоме, и после обработки специальными соединениями и флуоресцентными красителями препарат исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа. Для сравнения разрешающих способностей метода приведем следующие сведения. При рутинной окраске хромосом самый маленький нарушенный участок хромосомы в виде делеции или дупликации, который можно различить под обычным световым микроскопом, содержит 30 х 10 6 нуклеотидов. Применение дифференциальных методов окраски увеличивает такую возможность до (7- 10) х 10 6 нуклеотидов. При анализе хромосом на стадии ранней метафазы или профазы различимы микроперестройки размером (1-3) х 10 6 нуклеотидов. А вот следующий уровень разрешения уже обеспечивается только моле- кулярно-цитогенетическим методом. Такая высокая разрешающая способность метода позволяет применять непосредственно FISH-метод или его варианты в достаточно широких пределах: от определения локализации гена до расшифровки сложных перестроек хромосом. Как пример практических возможностей метода можно привести следующее. У ребенка с множественными врожденными аномалиями при использовании метода дифференциального окрашивания обнаружены сложные перестройки в шести хромосомах (1, 4, 7, 8, 9, 12) с десятью разрывами. Полная идентификация разрывов стала возможной только с помощью FISH-метода. Этот же метод можно применять для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах. Например, специфический для 21-й хромосомы зонд ДНК гибридизируется с денатурированной ДНК в клетках из амниотической жидкости на предметном стекле. Если у плода две 21-Х-хромосомы (норма), то везде будут видны 2 флюоресцирующие соответствующим цветом точки. При наличии у плода трисомии-21 в ядре визуализируются три светящиеся точки. Как и для других цитогенетических методов, в зависимости от цели исследования, используются различные варианты FISH-мето-да. Так, в онкоцитогенетике достаточно сложно получить хромосомы хорошего качества, поэтому используется метод сравнительной геномной гибридизации,основанный на гибридизации ДНК пациента с контрольными препаратами хромосом. При таком подходе можно выявить участки ДНК с делециями (потерями) и дупликациями (удвоениями). Метод применяют и для составления карт генов, вовлеченных в опухолевый процесс. Таким образом, цитогенетические методы стали практически незаменимыми процедурами в разных областях науки и клинической практики. Кроме диагностики заболеваний, цитогенетичес-кие методы широко используются в профилактической медицине. Уже давно показано повышение уровня хромосомных повреждений (аберраций) у курильщиков, у лиц, подвергшихся действию ионизирующей радиации, при воздействии на организм человека вредных химических факторов производства и окружающей среды, употреблении ряда лекарственных препаратов. В определенной степени типы хромосомных аберраций специфичны для разных групп мутагенных факторов. Так, при воздействии химических мутагенов чаще возникают аберрации хроматидного типа (повреждена одна хромати-да; рис. 7.4), а при воздействии ионизирующего излучения - хромосомного типа (рис. 7.5). Изучены количественные закономерности спонтанного и индуцированного мутагенеза. На этой основе разработаны системы цитогенетического мониторинга (контроля), реально работающие во многих странах, в том числе и у нас. Они позволяют следить за уровнем мутагенных воздействий факторов окружающей среды на Рис 7.4. Метафазная пластинка. Стрелкой указан одиночный фрагмент (абберация хроматидного типа) Рис. 7.5. Метафазная пластинка. Стрелками указаны парный фрагмент и дицентрическая хромосома наследственность человека. Для целей клиники анализ хромосомных аберраций помогает оценить отрицательные эффекты применяемой терапии и корректировать длительность применения того или иного лекарственного средства. Для описания нормального кариотипа человека, а также для обозначения структурных и количественных перестроек хромосом используется определенная универсальная схема и специальные символы. Описание кариотипа начинают с указания общего числа хромосом в клетке, затем ставится запятая и обозначается набор половых хромосом, который указывает пол обследуемого, в случае патологии далее ставится запятая, а затем обозначается хромосомная аномалия. Например, запись 46,XX характеризует нормальный кариотип женщины, 46,XY - нормальный кариотип мужчины, 47,XX,+21 кариотип больного с синдромом Дауна. Иногда при обследовании обнаруживают так называемый нормальный полиморфизм хромосом - индивидуальные особенности их строения. Как правило, полиморфизм отражает вариабельность размеров гетерохроматиновых сегментов, наличие спутников и спутничных нитей в области коротких плеч акроцентрических хромосом и их величину. В большинстве случаев наличие полиморфизма строения хромосом не приводит к возникновению патологических симптомов у их обладателя. Однако следует отметить, что иногда при наличии нормального полиморфизма хромосом может увеличиваться риск рождения ребенка с хромосомными аномалиями. Выявление полиморфизма хромосом обозначается при записи кариотипа. Например, запись 46,XX9gh+ означает увеличение размера гетерохроматинового участка в длинном плече хромосомы 9 женщины. Изучение нормального полиморфизма хромосом может иметь значение для определения родительского происхождения хромосомной перестройки. Если установлено, от кого из родителей унаследован полиморфизм хромосом, то это обязательно указывается при записи кариотипа. Например, 46XY15ps+pat означает, что мужчиной унаследованы от отца увеличенные спутники на хромосоме 15. Методы цитогенетической диагностики, применяемые в клинической генетике, часто используются в комплексе с другими методиками лабораторной диагностики, дополняя друг друга. Это позволяет более точно диагностировать сложные проявления наследственных и врожденных заболеваний человека. В нашей стране, как и во всем мире, цитогенетические методы прочно вошли в арсенал необходимых диагностических процедур для решения сложных дифференциально-диагностических задач практически во всех областях медицины. Особое же значение эти методы имеют при оказании помощи больным педиатрического, акушерско-гинекологического и эндокринологического профилей. Все вопросы назначения того или иного цитогенетического исследования осуществляются при медико-генетическом консультировании. В целом же все практические проблемы, решаемые лабораторными цитогенетическими методами, можно свести к следующим: • подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике; • наличие у ребенка множественных врожденных пороков развития, не относящихся к генному синдрому; • многократные спонтанные аборты, мертворождения или рождение детей с врожденными пороками развития; • нарушение репродуктивной функции неясного генеза у женщин и мужчин (первичная аменорея, бесплодный брак и др.); • существенная задержка умственного и физического развития ребенка; • пренатальная диагностика (риск по возрасту, в связи с наличием транслокации у родителей, при рождении предыдущего ребенка с хромосомной болезнью); • подозрение на синдромы, характеризующиеся хромосомной нестабильностью; • лейкозы (для дифференциальной диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза течения); • оценка мутагенных воздействий (радиационных, химических). Участие цитогенетиков в анализе трудных с диагностической точки зрения случаев часто приводит к более точной диагностике и, соответственно, к своевременному лечению и предупреждению рождения больного ребенка. 7.2.2. Биохимические методы Биохимические показатели отражают сущность наследственной болезни точнее, чем клиническая симптоматика. При биохимической диагностике оценивается фенотип организма на молекулярном уровне, а наследственная болезнь в конечном счете и есть фенотип. Поэтому биохимическим методам принадлежит ведущая роль в диагностике многих моногенных болезней. Однако сложность диагностики заключается в том, что сотни наследственных болезней по некоторым биохимическим показателям мочи или крови могут быть сходными (например, ацидоз, протеинурия и т.д.). Определять для каждого больного многие метаболиты очень трудоемко и дорого. Знание общих характеристик изменений обмена веществ при разных наследственных болезнях позволило по-новому построить исходную схему обследования, исходя из клинической картины болезни, генеалогических сведений и плана биохимического анализа. Такой подход позволяет проводить обследование на основе поэтапного исключения определенных классов болезней (просеивающие методы). В биохимической диагностике наследственных болезней используются как классические биохимические методы (электрофорез, хроматография, спектроскопия), так и современные высокоточные технологии, такие как жидкостная хроматография, масс-спектро-метрия, магнитно-резонансная спектрометрия, бомбардировка быстрыми нейтронами. Биохимическое обследование пациента позволяет идентифицировать любые метаболиты, специфические для той наследственной болезни, с подозрением на которую он был направлен. Каждое обследование должно начинаться с составления плана, в основе которого лежит клинико-генетическая информация о пациенте и его семье. «Объектами» биохимической диагностики являются биологические жидкости: моча, пот, плазма и сыворотка крови, эритроциты, лейкоциты, культуры фибробластов, лимфоцитов. Практически во всех случаях биохимическая диагностика начинается с просеивающего подхода, в котором выделяют два уровня: первичный и уточняющий. Каждый из этих уровней может быть более или менее полным в зависимости от оснащенности лаборатории. Основная цель первичного уровня диагностики заключается в том, чтобы исключить здоровых индивидов из дальнейшего обследования. Различают два вида программ первичной биохимической диагностики: массовые и селективные. На первом этапе в таких программах используются моча и кровь. Существуют массовые просеивающие программы диагностики среди новорожденных фенилкетонурии, врожденного гипотиреоза, врожденной гиперплазии надпочечников, муковисцидоза, галак-тоземии. Биологическим материалом для диагностики является кровь. Высушенные капли капиллярной крови новорожденных на хроматографической или фильтровальной бумаге пересылают из родильных домов в лабораторию (можно по почте). Материал должен поступить в лабораторию в течение двух-трех дней после взятия пробы. Для диагностики фенилкетонурии кровь новорожденных берут в родильном доме на 3-5 день после рождения. Если кровь будет взята раньше, то возможны ложноположительные результаты. В лаборатории в пятнах крови определяют количество фенилалани-на с помощью любого из следующих методов: микробиологический тест Гатри, флюорометрия, распределительная хроматография на бумаге, тонкослойная хроматография. Между методами нет принципиальной разницы, поэтому каждая лаборатория выбирает более подходящий для ее условий метод. Опыт показал, что пропущенные случаи фенилкетонурии являются не ошибками лабораторных исследований, а следствием недобросовестности или небрежности в работе медицинских сестер при взятии крови в родильных домах. В случае положительного результата на фенилкетонурию проводится уточняющая биохимическая диагностика путем количественного определения фенилаланина в крови. Врожденный гипотиреоз (снижение функции щитовидной железы) может быть обусловлен разными причинами: агенезия щитовидной железы; эктопия щитовидной железы; наследственные формы дисгормоногенеза; аутоиммунные процессы. Клинически врожденный гипотиреоз проявляется задержкой умственного развития, резким отставанием в росте, отечностью кожных покровов, развитием зоба. Программа массовой диагностики врожденного гипотиреоза одинакова для всех форм. Суть ее сводится к тому, чтобы в крови ребенка после 3-го дня жизни проверить, нет ли снижения тироксина (гормона щитовидной железы) в плазме крови и увеличено ли содержание тиреоидстимулирующего гормона - тиреотропного гормона гипофиза. В практике применяется два метода просеивающей диагностики: радиоиммунный или иммуноферментный (иммуно-флюоресцентный). Чувствительность и специфичность их примерно одинакова. По техническим причинам (не требуется условий для работы с радиоактивными веществами) иммуноферментный метод предпочтительнее, хотя он и дороже. Тироксин и тиреоидстимулиру-ющий гормон определяют в образцах крови новорожденных, предварительно высушенных на специальной фильтровальной бумаге. При положительном ответе просеивающего метода диагноз гипотиреоза обязательно должен быть подтвержден в клинических условиях эндокринологом и лабораторным анализом гормонов щитовидной железы в сыворотке крови. Просеивающие программы массовой диагностики наследственных болезней применяются не только среди новорожденных. Они могут быть организованы для выявления тех болезней, которые распространены в каких- либо группах населения или популяциях. Например, среди евреев-ашкенази отмечается высокая частота тяжелого заболевания Тея-Сакса. В США организована просеивающая биохимическая программа по выявлению гетерозиготнос-ти по этому заболеванию с последующим медико- генетическим консультированием таких семей. На Кипре и в Италии (Сицилия) с высокой частотой встречается тяжелое заболевание крови - талас-семия (гемоглобинопатия). Органы здравоохранения этих стран организовали биохимическое просеивание населения для выявле- ния скрытых носителей талассемии (гетерозигот), для которых было обеспечено в последующем медико-генетическое консультирование и пренатальная диагностика. Селективные диагностические программы предусматривают проверку биохимических аномалий обмена (моча, кровь) у пациентов, у которых подозреваются генные наследственные болезни. Фактически такие программы должны «функционировать» в каждой большой больнице. Показания для их применения достаточно широкие, стоимость каждого анализа невысокая. В селективных программах могут использоваться простые качественные реакции (например, тест с хлоридом железа для выявления фенилкетонурии или с динитрофенилгидрозином для выявления кетокислот) или более точные методы, позволяющие обнаруживать большие группы отклонений. Например, с помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать наследственные нарушения обмена аминокислот, олигосахаридов и гликозами-ногликанов (мукополисахаридов). Газовая хроматография применяется для выявления наследственных болезней обмена органических кислот. С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируется вся группа гемоглобинопатий. Нередко приходится углублять биохимический анализ - от количественного определения метаболита до определения активности фермента (использование нативных тканей или культивированных клеток), например, с помощью флюорометрических методик. В современных условиях очень многие этапы биохимической диагностики осуществляются автоматическими приборами (с ами-ноанализаторами). Реальным примером программы селективного скрининга на наследственные болезни обмена веществ с острым течением и ранним летальным исходом является программа, приводимая ниже. Первый этап программы включает качественный и количественный анализ мочи и крови (14 тестов): на белок, на кетокислоты, на цистин и гомоцистин, креатинин ионы аммония и др. Второй этап основан на методах тонкослойной хроматографии мочи и крови для выявления аминокислот, фенольных кислот, моно- и дисахаридов и других соединений. С помощью электрофореза мочи выявляют гликозаминогликаны. Эта программа позволяет выявлять 140 наследственных болезней обмена веществ у детей из следующих основных классов: • аминоацидопатии; • органические ацидурии; • лизосомные болезни накопления; • болезни углеводного обмена; • болезни обмена металлов; • болезни пуринового и пиримидинового обмена; • наследственные болезни метаболического транспорта; • наследственные болезни желудочно-кишечного тракта; • наследственные болезни нейротрансмиттерного обмена; • наследственные болезни обмена витаминов; • митохондриальные болезни; • болезни β-окисления жирных кислот; • пероксисомные болезни. Важность такой программы в детских больницах трудно переоценить. Показаниями для применения биохимических методов диагностики у новорожденных являются такие симптомы, как судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический запах мочи и пота, ацидоз, нарушенное кислотно-основное равновесие, остановка роста. У детей биохимические методы используются во всех случаях подозрения на наследственные болезни обмена веществ (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, специфическая для какой-либо наследственной болезни клиническая картина). 7.2.3. Молекулярно-генетические методы Успехи, достигнутые в последние годы в молекулярной биологии, биофизике, биохимии, медицинской генетике и смежных областях, привели к созданию и внедрению в практическую медицину моле-кулярно- генетических методов исследования генома человека, в частности для диагностики целого ряда наследственных и широко распространенных заболеваний. Методы ДНК диагностики позволяют осуществлять точную и, что очень важно, доклиническую (до развития симптомов заболевания) диагностику многих заболеваний, проводить пренатальную (дородовую) диагностику наследственных болезней. Молекулярно-генетическая диагностика может быть проведена на самых ранних этапах развития эмбриона и плода независимо от биохимических или клинических проявлений болезни. Это подчас является решающим для решения вопроса о судьбе конкретной беременности. Молекулярно-генетические методы предназначены для выявления особенностей в структуре дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). В основе анализа ДНК лежат две ее характеристики как носителя генетической информации: • последовательность составляющих ДНК элементов (нуклеоти-дов) имеет индивидуальные особенности у каждого отдельного человека, кроме идентичных (однояйцовых) близнецов или клонированных организмов; • у каждого человека во всех соматических клетках структура ДНК совершенно одинакова. Исходным материалом для проведения ДНК-диагностики заболеваний, обусловленных мутациями ядерных генов, могут служить любые клетки организма, содержащие ядро. Обычно для этих целей используются лейкоциты, выделяемые из 5-20 мл периферической крови. В некоторых случаях (например, при митохондриальных энцефаломиопатиях, обусловленных мутациями митохондриаль-ной ДНК с преимущественной экспрессией мутации в мышечной и нервной ткани) более адекватным источником ДНК являются био-птаты мышц. Генодиагностика может также проводиться на основе исследования ДНК, выделяемой из клеток эпителия полости рта, кожных фибробластов и т.д. При проведении пренатальной ДНК-диагностики у плода (обычно на 10-21 неделе беременности) источником ДНК служат биоптаты хориона, плаценты, клетки амниоти- ческой жидкости (получаемые при амниоцентезе) или лимфоциты пуповинной крови (кордоцентез). Все разнообразие процедур, применяемых при проведении ДНК- диагностики, можно разделить на 2 большие группы - прямые и косвенные методы. 7.2.3.1. Прямая ДНК-диагностика Прямая ДНК-диагностика предполагаетнепосредственноевыявле-ние мутации в исследуемом гене. Она обладает высокой точностью. Для анализа требуется только образец ДНК обследуемого лица. Диагностика может проводиться как в семейных, так и в спорадических случаях заболеваний. Для проведения прямой ДНК-диагностики необходимо точно знать структуру гена (или конкретного участка гена, содержащего анализируемую мутацию). Методические подходы, используемые при прямой ДНК- диагностике того или иного наследственного забо- левания, зависят от характера мутаций и молекулярной организации соответствующего гена. В настоящее время большинство протоколов прямой ДНК-диагностики базируется наполимеразной цепной реакции (ПЦР) (рис. 7.6). Разработка принципов ПЦР стала поистине революционизирующим этапом в развитии молекулярной генетики, что нашло свое отражение в присуждении ее автору К. Муллису Нобелевской премии в 1993 году. Метод ПЦР заключается в циклическом синтезе in vitro строго заданных, ограниченных участков ДНК длиной от десятков до нескольких тысяч п.о. Это позволяет в течение 3-5 часов получить огромное число копий искусственно синтезированных молекул нужной последовательности ДНК (т.е. амплифщироватънеобходимый участок ДНК, являющийся предметом молекулярного анализа). По сути, метод ПЦР как бы «имитирует» на ограниченном участке гена естественный процесс репликации ДНК, имеющий место in vivo (см. главу 2). Сущность метода ПЦР заключается в циклическом чередовании 3 основных биохимических этапов: 1) денатурация двойной спирали ДНК-матрицы при температуре 95 °С; 2) гибридизация (отжиг) одноцепочечной ДНК-матрицы и праймеров при температуре 45-60 °С, в процессе которой праймеры распознают комплементарные им участки ДНК-матрицы; 3) полимеризация при температуре 65-72 °С, т.е. синтез комплементарной цепи на ДНК- матрице, начинающийся от места гибридизации праймера и происходящий в направлении 5'->3'. В последующих циклах вновь синтезируемые молекулы ДНК становятся, в свою очередь, матрицей для аналогичного синтеза новых копий. Поскольку синтез каждой из 2 антипараллельных цепей ДНК начинается от места гибридизации праймера, эти места и становятся границами синтезируемого участка. Число указанных циклов в ПЦР составляет обычно от 25 до 40, причем в каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка ДНК, приводящее к увеличению в геометрической прогрессии общего содержания продуктов реакции. Обычно ПЦР осуществляется в автоматическом режиме на специальных программируемых приборах (амплификаторах), контролирующих заданные параметры реакции (температура, длительность отдельных этапов, число циклов и т.д.). Дальнейший анализ продуктов ПЦР в процессе прямой ДНК-диагностики предполагает исследование конкретных особенностей амплифицированного участка гена. Так, при заболеваниях, Рис. 7.6. Полимеразная цепная реакция обусловленных экспансией тринуклеотидных повторов, продукты амплификации различаются по своей длине (отражающей различное число триплетов в изучаемом участке гена) и, как следствие - по их скорости движения в геле. Благодаря этому достигается четкое электрофоретическое разделение нормальных и мутантных аллелей и точное определение патологически удлиненного фрагмента, т.е. ДНК-диагностика болезни. В конкретных популяциях мутационный поиск при том или ином наследственном заболевании может быть существенно упрощен в связи с высокой частотой так называемых мажорных мутаций,т.е. мутаций, которые являются преобладающими и обусловливают значительный процент всех случаев заболевания в данной популяции. Наличие мажорных мутаций может быть обусловлено либо эффектом основателя (высокая распространенность конкретной мутан-тной хромосомы, исторически унаследованной от одного предка), либо частым возникновением одного и того же повреждения в связи с некоторыми особенностями нуклеотидного состава данной области гена (так называемые горячие точки мутаций). Примером такого рода является гепатолентикулярная дегенерация. При данном аутосом-но-рецессивном заболевании описано свыше 100 различных мутаций в сложноорганизованном гене медной АТФ-азы (АТР7В), что значительно затрудняет мутационный скрининг. Однако одна и та же точковая мутация в 14-м экзоне гена, ведущая к замене гистидина на глутамин, выявляется в славянских популяциях России более чем у 60 % больных. Это позволяет проводить относительно простую и экономную ДНК-диагностику гепатолентикулярной дегенерации в большинстве обследуемых семей из данной этнической группы, не прибегая к технически сложному исследованию всей кодирующей области гена. 7.2.3.2. Косвенная ДНК-диагностика Косвенная (непрямая) ДНК-диагностика используется при заболеваниях, ген которых достаточно точно картирован, т.е. локализован в конкретном узком участке определенной хромосомы. Важно подчеркнуть, что косвенная ДНК- диагностика может проводиться даже в тех случаях, когда какая-либо другая информация о гене болезни, помимо его хромосомного расположения, отсутствует (т.е. когда неизвестны структура и размер гена, характер мутаций в нем, кодируемый геном белок и т.д.). Сущность косвенной ДНК-диагностики заключается в анализе наследования у больных и здоровых членов семьи полиморфных генетических маркеров, расположенных в изучаемой хромосомной области и, следовательно, сцепленных с геном болезни. В качестве таких маркеров выступают участки ДНК, существующие в виде нескольких возможных аллельных вариантов и различающиеся у разных лиц по тем или иным структурным особенностям (например, по составу нуклеотидов или по числу копий динуклеотидных СА-повторов). Благодаря вариабельности состава таких маркерных участков ДНК обычно бывает возможно дифференцировать материнское или отцовское происхождение конкретного варианта маркера при анализе ДНК обследуемого лица. Сцепление конкретного маркера с геном болезни означает, что данный маркер располагается в непосредственной близости от патологического гена, поэтому маркер и ген болезни после кроссинговера остаются в составе одного хромосомного сегмента и передаются потомству как единое целое. Таким образом, благодаря анализу полиморфных генетических маркеров удается проследить в ряду поколений наследование каждой из родительских Х-хромосом. Пример косвенной ДНК-диагностики аутосомно-доминантного заболевания показан на рис. 7.7. На первом этапе необходимо определить, какой из аллелей изучаемого маркера сцеплен с мутантным геном в данной семье у заведомо больных лиц (на рисунке это отцовский аллель размером 210 п.о., поскольку именно он всегда обнаруживается у больных лиц II-2, II-3, и III-2 - дорожки 1, 3, 4 и 6). Дальнейший анализ наследования данного аллеля позволяет проследить передачу патологического участка отцовской хромосомы, содержащего мутантный ген. Так, на рисунке видно, что указанный 210-нуклеотидый аллель передался от больного II-3 (дорожка 6) его клинически здоровому сыну III-4, входящему в группу риска (дорожка 7); на основании этого делается вывод о том, что сын III-4 унаследовал от отца патологическую хромосому и является носителем мутантного гена (положительный результат косвенной ДНК-диагностики). Напротив, сын III-3 (дорожка 5) унаследовал от больного отца II-2 (дорожка 4) другой аллель изучаемого маркера размером 206 п.о., расположенный на «здоровой» хромосоме и сцепленный с нормальным геном; следовательно, у него результат ДНК-диагностики отрицательный (носи-тельство мутантного гена отвергнуто). Косвенная ДНК-диагностика обладает некоторыми недостатками: 1) так для ее проведения требуется анализ ДНК нескольких членов семьи, из 2-3 поколений (в неполных семьях такая диагностика Рис. 7.7. Косвенная ДНК-диагностика аутосомно-доминантного заболевания. Черным цветом обозначены больные лица, белым - клинически здоровые, серым цветом - клинически здоровый родственник, являющийся носителем мутантной хромосомы. Исследована ДНК родственников из 2 нижних поколений родословной. В нижней части рисунка показана электрофоре- грамма с результатами исследования изучаемого (СА)п-маркера (каждая дорожка геля соответствует индивиду в родословной, расположенному сверху от дорожки). Справа от электрофореграммы указанны размеры аллелей (в парах оснований) невозможна); 2) косвенная ДНК-диагностика неприменима для спорадических случаев заболевания, т.к. косвенная диагностика требует предварительно диагностировать заболевания хотя бы у одного индивидуума в родословной. Сегодня молекулярно-генетические методы используют при диагностике более 1000 наследственных болезней: гемофилии, гемоглобинопатии, митохондриальных болезней, муковисцидозе, фенилке-тонурии, миопатии Дюшенна и других. Их число постоянно растет. Кроме того, ДНК технологии находят применение: в исследованиях для определения происхождения популяций людей; в практике судебной медицины; для определения отцовства или степени родства; для генетического анализа клеток костного мозга при его трансплантации от донора реципиенту; для определения мутаций, при диагностике наследственных болезней и для расшифровки генома человека. Контрольные вопросы и задания 1. В чем отличие прямых и непрямых методов цитогенетического исследования? 2. Какие биологические материалы можно использовать для получения препаратов хромосом? 3. Назовите основные методы окрашивания хромосом. 4. Перечислите преимущества метода анализа профазных и промета-фазных Х-хромосом. 5. На чем основаны молекулярно-цитогенетические методы? 6. Назовите основные показания для применения цитогенетических методов в клинической практике. 7. Для каких групп наследственных болезней используют биохимические методы диагностики? 8. Назовите основную цель первичного уровня биохимической диагностики наследственных болезней 9. Каковы различия между массовыми и селективными программами первичной биохимической диагностики? 10. Какие основные показания для применения биохимических методов диагностики вы знаете? 11. Какие характеристики ДНК лежат в основе молекулярно-генети-ческих методов исследования? 12. Что является материалом исследования при молекулярно-гене-тическом методе? 13. Что лежит в основе гибридизационного анализа? 14. Что такое ПЦР? 15. Что такое амплификация, ее возможности? |