Биологи. Мер по контролю за качеством выполнения лабораторного анализа на всех этапах его осуществления от периода подготовки пациентов к процедуре взятия крови до использования полученных результатов в клинике
 Скачать 157.03 Kb.
|
5. Необходимые реактивы и оборудование1. Этиловый спирт 96°. 2. Азур-эозин по Романовскому-Гимза (промышленный маточный раствор или сухая краска). 3. Метиленовый синий. 4. Этиловый эфир. 5. Глицерин. 6. Тетраборат натрия (бура). 7. Калий фосфат однозамещенный безводный - KHPO. 8. Натрий фосфат двузамещенный безводный - NaHPO. 9. Смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в равных частях). 10. Дистиллированная вода. 11. Индикаторная бумага (диапазон рН 5,0-8,0). 12. Фильтровальная бумага. 13. Химическая посуда: мерные цилиндры или стаканы на 10, 50 и 100 мл; градуированные центрифужные пробирки; колбы и стаканы; стеклянные палочки. 14. Предметные стекла 15. Шлифованные стекла. 16. Фарфоровая ступка с пестиком. 17. Аптечные равноплечие или электронные весы. 18. Эмалированные кюветы. 19. Пинцеты. 20. Часы песочные или сигнальные. 21. Стеклянные мостики или специальные контейнеры для окрашивания препаратов крови. 22. Скарификаторы стерильные одноразовые. 23. Бинты стерильные, вата. 24. Перчатки резиновые. 25. Микроскоп с осветителем (объективом х90 или х100, окуляром х7; х10). 26. Термостат. 27. Холодильник. 6. Техника паразитологической диагностики6.1. Подготовка предметных стекол1. Предметные стекла новые замачивают в мыльном растворе, нагревают до 60-80 °С, но не кипятят. 2. Каждое предметное стекло протирают ветошью с обеих сторон в этом растворе. 3. Промывают в проточной воде в течение 2-3 ч, периодически перемешивая. 4. Погружают в дистиллированную воду на 30 мин. 5. Проверяется качество отмывки предметных стекол от щелочи: на предметное стекло наносят 1 каплю фенолфталеина - появление розовой окраски раствора свидетельствует о недостаточной отмывке от щелочи. 6. Стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и помещают для обезжиривания в смесь Никифорова (из расчета 1 мл смеси на 1 стекло), где они могут храниться в течение длительного времени. 7. Извлеченные пинцетом из смеси Никифорова стекла протирают хлопчатобумажной стираной материей, заворачивают в чистую гладкую не ворсистую (!) бумагу небольшими партиями и стерилизуют. Стекла, многократно бывшие в употреблении, для приготовления препаратов крови использовать не рекомендуется. При необходимости их использования, следует удалить следы иммерсионного масла простиранной ветошью, затем отмыть каждое стекло от окрашенных препаратов крови в теплом мыльном растворе (для этой цели удобно использовать зубную щетку с коротко срезанной щетиной). Дальнейшая обработка - такая же, как и новых стекол.
6.2. Приготовление и хранение реактивов6.2.1. Раствор краски Романовского-Гимза Маточный раствор краски Романовского-Гимза (промышленный или приготовленный из сухой субстанции) представляет собой густую темно-фиолетовую жидкость, которую можно хранить длительное время в хорошо закупоренных бутылях из темного стекла в сухом защищенном от света прохладном месте (но не в холодильнике). Для текущей работы перед приготовлением рабочего раствора краски Романовского-Гимза необходимое количество маточного раствора краски, отливают в небольшой флакон, обязательно фильтруя, т.к. при хранении маточного раствора может выпасть осадок. Краску следует набирать сухой пипеткой или отливать через горлышко. Для определения качества краски рабочим раствором каждой новой серии производят пробное окрашивание мазков крови. Для приготовления маточного раствора из сухой краски Романовского-Гимза необходимы следующие реактивы: азур-эозин - 10 г; глицерин - 100 мл; спирт этиловый 96° - 900 мл. Техника приготовления краски предусматривает следующие этапы: 1. Азур-эозин тщательно растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством спирта и глицерина до получения кашицеобразной массы и сливают в колбу или бутыль из темного стекла. Затем постепенно добавляют остальной спирт и глицерин. 2. Полученную взвесь тщательно встряхивают в течение 10 мин 2-3 раза. 3. Емкость с краской помещают в термостат при температуре 37° на 3-5 дней для созревания краски с ежедневным встряхиванием этой емкости вручную не менее 10 мин. При наличии магнитной мешалки встряхивание можно продолжать несколько часов. При наличии подогревателя в мешалке взвесь можно подогревать, при этом подогрев не должен превышать 40-50°, периодически подогреватель следует выключать с тем, чтобы температура не повышалась выше указанного уровня. Встряхивание и подогрев улучшают качество краски. После каждого встряхивания раствор снова помещают в термостат. 4. Через 3-5 дней готовый раствор краски фильтруют через бумажный фильтр. 6.2.2. Буферный раствор Необходимые реактивы: 1. Дистиллированная вода - 1 л. 2. Фосфат калия однозамещенный безводный - KHPO - 0,27 г. 3. Фосфат натрия двузамещенный безводный - NaHPO - 0,67 г. Техника приготовления: 1. Соли растворить в дистиллированной воде (1/3 объема) комнатной температуры, после полного растворения довести до метки 1000 мл и размешать. 2. Приготовленный раствор должен иметь рН 7,0±0,2. Точное соблюдение требуемой реакции буфера важно для правильной окраски. Если рН<6,8, то следует добавить NaHPO, если рН>7,2, то добавляется KHPO. Количество реактивов, необходимых для доведения рН, подбирается опытным путем. Буферный раствор следует хранить в хорошо закупоренной посуде в холодильнике (до 1 месяца). Для приготовления краски используется буферный раствор комнатной температуры. Нельзя использовать буферный раствор с осадком, который после окраски затрудняет просмотр препарата и даже может привести к диагностическим ошибкам. Периодически следует проверять рН буферного раствора, особенно при искажении цвета окрашенных элементов крови. 6.3. Взятие проб крови для исследования на малярию1. Кровь для паразитологического исследования берут из пальца руки (у взрослых - обычно безымянного, у детей - из большого), у новорожденных детей - из большого пальца ноги (но не мочки уха). 2. Периферическую кровь для исследования берут вне зависимости от температуры тела и клинических проявлений. 3. Для прокола кожи пальца используют стерильные одноразовые скарификаторы или специальные стерильные разового использования иглы. 4. В целях безопасности пациента взятие крови на малярию производят на стерильные предметные стекла, т.к. во время взятия крови возможно их касание к месту прокола. 5. Перед проколом кожу пальца тщательно протирают ватным тампоном, смоченным в 70%-ном спирте, чем достигается не только предупреждение инфицирования места прокола, но и попадание с кожи пальца бактерий, различных посторонних частиц на препарат крови, которые могут затруднить диагностику при микроскопии. 6. Первую каплю крови, выступившую после прокола, вытирают сухим стерильным ватным тампоном, чтобы избежать фиксации эритроцитов остатками спирта, которым дезинфицировали кожу. 7. Последующие капли (выступающие самостоятельно или при надавливании на палец массирующими движениями) используются для приготовления препаратов крови. При этом кровь забирают в стерильный сухой гематологический капилляр, из которого быстро переносят на предметное стекло, либо выступившую кровь непосредственно из прокола пальца наносят на предметные стекла. Если кровь набирают в капилляр, то можно использовать не стерильные стекла, но подготовленные так же, как описано в п.6.1. 8. От одного пациента готовят не менее 2-3 стекол с "толстыми каплями" и 2-3 "тонких мазка" крови. Рекомендуется первоначально окрасить по одному стеклу, с тем чтобы иметь возможность исправить дефекты окраски.
6.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация6.4.1. Препарат "толстая капля" 1. Препарат "толстая капля" на предметном стекле без мазка (рис.1): на предметное стекло наносят каплю крови диаметром около 5 мм, кровь распределяют в равномерный диск или прямоугольник размером 1-1,5 см. на краю стекла делается мазок в виде полоски крови для маркировки препарата, при массовых обследованиях делаются две полоски, где наносят маркировку. Рис.1. "Толстые капли" на предметном стекле без мазкаРис.1. "Толстые капли" на предметном стекле без мазка 2. Препарат "толстая капля" на мазке (рис.2): на предметном стекле готовят мазок крови более толстый, чем требуемый для исследования на малярию; сразу после приготовления мазка, пока мазок не высох, его влажной поверхностью прикасаются к выступившей капле крови или наносят кровь из капилляра; кровь на влажном мазке распределится в равномерный диск при осторожных наклонах предметного стекла под небольшим углом в разные стороны; чем больше взятая капля крови, тем больше площадь, по которой она распределится. Рис.2. "Толстые капли" на мазкеРис.2. "Толстые капли" на мазке Капля крови, нанесенная на мазок, более прочно прикрепляется, чем нанесенная непосредственно на предметное стекло. Толщина "толстой капли" должна быть такой, чтобы через нее просматривался печатный текст. Слишком толстая капля может оторваться от стекла при высушивании; такой препарат непригоден для исследования. Независимо от методики приготовления показателем достаточного содержания крови в "толстой капле" является обнаружение в 1 поле зрения микроскопа в среднем 10-15 лейкоцитов (увеличение: объектив х90-100, окуляр х7). 3. Комбинированные препараты (рис.3). Рис.3. Комбинированное приготовление препаратов кровиРис.3. Комбинированное приготовление препаратов крови В целях экономии стекол, особенно при массовых обследованиях, на предметном стекле одновременно готовят "тонкий мазок" и "толстую каплю". Этот метод, однако, требует ряда предосторожностей. Для того чтобы оба препарата были пригодны для исследования, необходима четкая последовательность их обработки. Необходимо начинать с окраски "толстой капли" погружением соответствующего участка предметного стекла в раствор краски. Затем фиксируют "тонкий мазок" и окрашивают его. Нельзя начинать с фиксации "тонкого мазка", т.к. даже при очень аккуратном погружении в фиксирующую жидкость участка предметного стекла, на который нанесен "тонкий мазок", в "толстой капле" эритроциты могут подвергнуться фиксации парами фиксатора. При последующей окраске такая капля станет непригодной для исследования, даже если фиксация была неполной. Все препараты высушивают на воздухе. Для ускорения высыхания "толстых капель" можно использовать обычный комнатный вентилятор.
Особенно это относится к "толстой капле", которая под действием тепла подвергается аутофиксации и необходимый гемолиз при окраске не наступает. "Толстые капли" (особенно в процессе высыхания) и фиксированные "тонкие мазки" следует беречь от тараканов, мух и муравьев, съедающих кровь. 6.4.2. Препарат "тонкий мазок " (рис.4) Рис.4. "Тонкий мазок" кровиРис.4. "Тонкий мазок" крови 1. На край предметного стекла, отступив 0,5-1 см, наносят небольшую каплю крови (объемом меньше в 5-10 раз, чем для препарата "толстая капля"). 2. Предметное стекло с нанесенной каплей кладут на горизонтальную поверхность стола, при этом край стекла с каплей крови должен быть справа*. 3. Двумя пальцами левой* руки предметное стекло за боковые поверхности фиксируется на столе. 4. Край шлифованного стекла (фиксированного в правой* руке) ставится под углом 45° к предметному стеклу, прикасаясь к левому* краю капли крови. 5. После того как капля растекается по касательной линии в месте соприкосновения обоих стекол, шлифованное стекло быстрым движением продвигают справа налево* к противоположному краю предметного стекла, постепенно ослабляя давление на предметное стекло, что позволяет закончить "тонкий мазок" бахромчатой частью, где наиболее четко видны специфические особенности морфологии паразитов и изменения пораженных эритроцитов. Мазок крови должен быть тонким, равномерным, не доходить до конца и краев предметного стекла, заканчиваться бахромчатым краем (рис.4). ________________ * Для лаборанта левши читать вместо левого положения - правое, вместо правого - левое. Если угол наклона шлифованного стекла увеличить, то мазок получится короткий и толстый, с расположением эритроцитов в несколько слоев (это маскирует некоторых паразитов, а также приводит к их деформации); если уменьшить угол наклона, то трудно создать бахромчатую часть мазка. Качество "тонкого мазка" зависит также от правильной подготовки предметного стекла и равномерности края шлифованного стекла. На плохо вымытом жирном стекле и при дефектах на краю шлифованного стекла "тонкий мазок" получается неравномерным и с просветами. Возможные дефекты тонких мазков показаны на рис.5. Рис.5. Дефекты приготовления "тонких мазков''Рис.5. Дефекты приготовления "тонких мазков'' 6.4.3. Маркировка препаратов крови 1. Высохшие препараты крови маркируют простым карандашом (он не смывается во время фиксации и окрашивания). 2. Маркировка включает фамилию и инициалы или номер истории болезни (можно номер страхового полиса), или порядковый номер по списку обследуемого и, обязательно, дату взятия крови. 3. Препарат "толстая капля", приготовленный непосредственно на предметном стекле, маркируют на полоске крови. 4. Препарат "толстая капля" на подкладке маркируют по мазку, не задевая каплю. 5. "Тонкий мазок" маркируют в толстой части (не следует делать надпись вдоль всего мазка). 6.4.4. Фиксация "тонких мазков" 1. Фиксацию мазков проводят: в этиловом спирте 96% - 10 мин или в смеси Никифорова - 20 мин. 2. Мазки погружают и извлекают из фиксирующей жидкости пинцетом. Препараты по окончании фиксации высушивают на воздухе.
При длительном хранении (особенно в жарком климате) неокрашенных "толстых капель" может произойти их аутофиксация. При необходимости хранения "толстых капель" для предотвращения аутофиксации препараты до окраски следует обработать забуференным раствором метиленового синего (1 г метиленового синего + 3 г NaHPO + 1 г KHPO + 300 мл дистиллированной воды). "Толстую каплю" после высыхания погружают в этот раствор на 1 секунду, промывают водой и высушивают. В таком виде каплю можно хранить длительное время. Перед исследованием окрашивают по Романовскому меньше, чем обычное время - в течение 6-10 минут. 6. Развитие системы стандартизации в здравоохранении обусловлено объективной необходимостью обобщения и унификации новых позитивных результатов исследований и разработок в форме нормативнотехнической документации для создания в конечном счете условий для многократного эффективного применения их в сфере оказания медицинской помощи. Эта система создает необходимую нормативную базу для развития доказательной медицины. Анализ существующих в здравоохранении проблем позволяет установить следующие причины, определяющие приоритетность работ по стандартизации: • отсутствие единых подходов к формированию нормативной базы отрасли; • необходимость повышения эффективности использования ресурсов здравоохранения на фоне растущей стоимости медицинских товаров и услуг; • неуклонный рост числа новых медицинских технологий, который усложняет процесс выбора врачом оптимального способа профилактики, диагностики, лечения и реабилитации больных. С учетом возросшей необходимости системного решения этих проблем в 1997 г. было принято совместное решение коллегии Министерства здравоохранения РФ, Государственного комитета РФ по стандартизации и сертификации и Совета исполнительных директоров территориальных фондов обязательного медицинского страхования (ТФОМС) «Об основных положениях стандартизации в здравоохранении», которое положило начало созданию современной системы стандартизации в здравоохранении Российской Федерации. Этим решением были определены основные направления развития системы стандартизации в современных условиях модернизации здравоохранения: • стандартизация в области ресурсов здравоохранения; • стандартизация в области технологий в здравоохранении; • стандартизация в области результатов применения технологий. Под стандартизациейв здравоохранении понимают деятельность,
направленную на совершенствование управления отраслью, повышение качества медицинской помощи и эффективности использования ресурсов путем разработки и установления нормативов, правил, требований, условий, технологий при производстве и реализации медицинских товаров и услуг. Осуществление этой деятельности предусматривает последовательное решение целого комплекса задач: • создание единой системы оценки показателей качества и экономических характеристик медицинских услуг, установление научно-обоснованных требований к их номенклатуре и объему; • установление требований к условиям оказания медицинской помощи, а также технологической совместимости и взаимозаменяемости процессов, оборудования, материалов, лекарственных средств и других компонентов, применяемых при оказании медицинской помощи; • нормативное обеспечения метрологического контроля в здравоохранении; • установление единых требований к аккредитации медицинских учреждений, сертификации специалистов; • создание и информационная поддержка систем классификации, кодирования и каталогизации в здравоохранении и др. В основе процесса стандартизации лежит понятие «стандарт». В общем понимании стандарт- это нормативный документ, регламентирующий набор правил, нормативов и требований к объекту стандартизации и утвержденный компетентным органом. Применительно к системе здравоохранения стандарт- это нормативный документ, разработанный на основе консенсуса и утвержденный соответствующим органом, в котором устанавливается определенный набор правил, нормативов, условий, требований, касающихся различных видов медицинской деятельности и их результатов. Действующая в здравоохранении Российской Федерации система стандартизации базируется на следующих основных принципах.
• Принцип актуальности:соответствие требованиям законодательства и нормативным правовым актам РФ, международным нормам и современным достижениям науки. • Принцип согласия (консенсуальности):все субъекты-участники процесса стандартизации должны стремиться к единообразию формы и содержания нормативных документов. • Принцип единообразия:в системе здравоохранения должен быть установлен единый порядок разработки, согласования и использования нормативных документов по стандартизации. • Принцип целесообразности:требования должны быть целесообразными как с научной, так и с практической точек зрения и соответствовать федеральному и международному законодательству, современным достижениям науки и техники. • Принцип комплексности и проверяемости:требования, предъявляемые к различным объектам стандартизации, должны согласовываться между собой и быть проверяемыми объективными методами. Стандартизация в здравоохранении - процедура сложная и многоплановая, поэтому стандартизации подлежат практически все составляющие процесса оказания медицинской помощи, которые называют объектами стандартизациив здравоохранении. К ним относятся: • организационные технологии; • медицинские услуги; • технологии выполнения медицинских услуг; • качество медицинских услуг; • системы жизнеобеспечения в экстремальных ситуациях; • квалификация медицинского, фармацевтического, вспомогательного персонала; • производство, условия реализации, качество лекарственных средств, изделий медицинского назначения, медицинской техники, диетического питания; • учетно-отчетная документация; • информационные технологии; • критерии экономической деятельности; • технологии изъятия, переработки и введения в организм человека органов и тканей, полученных от донора;
• этические правила и др. 4.4. Правила разработки и выполнения технологических карт клинических лабораторных исследований Клиническое лабораторное исследование представляет собой единый процесс, состоящий из жестко взаимосвязанных этапов и охватывающий деятельность не только лабораторного персонала, но и сотрудников клинических подразделений. Каждый участник этого процесса должен понимать абсолютную необходимость точного выполнения своей функции и своей части технологических операций для получения достоверного конечного результата, нести личную ответственность за свою часть обеспечения качества лабораторного исследования и его постоянного улучшения. Способом достижения взаимосвязи всех участников различных этапов клинического лабораторного исследования служит разработка технологических карт на основе сетевой модели технологического процесса по каждому из видов исследо- вания и практическое их применение. В технологические карты должны быть внесены все последовательные операции и процедуры, предусмотренные нормативными документами по технологиям простых или комплексных медицинских услуг по ГОСТ Р 52623.0: от подготовки пациента к обследованию до доставки результата исследования в клиническое отделение и подведения статистических и хозяйственных итогов проведенной работы. Применительно к каждой операции должны быть приведены данные о месте и продолжительности ее проведения, исполнителе, а также о показателях качества. По каждому этапу в карту должны быть занесены предостережения о типичных технологических нарушениях, а в завершение всего процесса - предложения о возможном совершенствовании технологии. Должны быть определены меры контроля за правильным выполнением обследования пациента и предусмотрено постоянное совершенствование качества выполнения исследований. Структура и содержание технологической карты должны быть тщательно обоснованы и согласованы со всеми участниками процесса обследования - работниками лаборатории и клиническим персоналом. Формы технологических карт и правила их заполнения должны быть приведены в «Руководстве по качеству». 7. Тромбоэластография представляет собой один из методов, который позволяет оценить состояние свертывающей системы крови на основании исследования сгустка. Особое внимание уделяют его вязкости и эластичности. Основная суть тромбоэластограммы – оценка гемостаза посредством интегрального характера. Эта методика способна показать результаты работы системы коагуляции, тромбоцитов, а также она оценивает работу системы фибринолиза и антисвертывающих механизмов. Информация получается лишь на основании плотности сгустка. Врачи широко применяют такой способ оценки нарушений гемостаза для коррекции лечения. Проба получила распространение во всех хирургических специальностях, то есть ей пользуются общие и сосудистые хирурги, гинекологи, онкологи, а также некоторые терапевтические специалисты – кардиологи, невропатологи. В чем суть исследования Основной принцип работы аппарата, который называется тромбоэластограф, основан на оценке главных физических свойств кровяного сгустка. Биологический материал помещается в кювету – чашу цилиндрической формы. Она отклонена от своей оси на 4.45 градуса, в таком положении аппарат начинает вращательные движения. Один цикл вращения длится ровно 10 секунд. В биологический материал помещается стержень с якорем. Он подвешен на специальной скручивающейся нитке. Крутящий момент цилиндра-кюветы сначала не передается на них. Это происходит после начала формирования сгустка и сворачивания. С целью образования сгустка, необходимо после погружения материала в кювету, некоторое время подождать. Как только чашечка со стержнем соединяются за счет сгустка, начинается фиксация показателей, стержень начинает их передавать. Результат определяется за счет силы связи агрегатов аппарата. Важно учитывать, что несвернувшаяся кровь никоим образом не передает вращения, а чем сильнее затвердевает тромб, тем больше амплитуда движения. Организованный сгусток обуславливает синхронное движение кюветы и стержня. Таким образом, если сформировался плотный сгусток, стержень начинает вращаться вместе с чашечкой. Это максимальная амплитуда аппарата. Получается, что его угол вращения зависим от того, насколько плотный сгусток формируется. Когда начинается лизис или другой вариант его разрушения, либо же он сжимается, связи в крови ослабевают, ухудшается и совместная работа чашечки и стержня, соответственно, передача также уменьшается. Вращательное движение стержня перемоделируется из механических колебаний в электрические сигналы. Их фиксация осуществляется посредством компьютеров. Как итог – врач получает информацию о начале формирования самых первых фибриновых ниток, как тромб образуется, насколько он плотный, как проходит его разрушение. Также посредством этого метода исследования врач проводит оценку состояния гемостаза, получает всю необходимую информацию о системе свертывания. Использование компьютера для интерпретации анализа позволяет зафиксировать кинетические изменения кровяного сгустка, которые можно оценить не только в цельной крови, но и в плазме, или же обогащенной тромбоцитами плазме. Речь идет о формировании тромба, его разрушении, лизисе. Исходя из этого, ученые пришли к выводу, что при помощи тромбоэластографии можно будет получить информацию о физических свойствах тромба, который состоит из форменных элементов крови и нитей фибрина. По своей сути, прибор для проведения этого исследования, проводит измерение механической работы тромба или кровяного сгустка на протяжении работы системы свертывания. Он начинает фиксацию результатов с самого начала запуска свертывания еще до появления самых первых нитей фибрина, оценивает развитие и структуру тромба, а также его деструкцию и лизис. Отличие тромбоэластограммы от основных тестов коагулограммыЭта методика позволяет оценить те компоненты, которые приняли участие в формировании тробма – фибрин, тромбин, форменные элементы крови, особенно тромбоциты. Также она не подразумевает центрифугирования биологического материала, что снижает время проведения анализа. Тромб формируется почти в естественных условиях, что также является преимуществом. |