Методы исследования в гистологии. Основные принципы и этапы приготовления гистологических препаратов
 Скачать 0.74 Mb.
|
|
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ И ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ. Основным методом исследования в гистологии является микроскопирование — изучение гистологических препаратов под микроскопом. В последнее время микроскопия сочетается с другими методами — гистохимией и гисторадиографией. Для микроскопии используют различные конструкции микроскопов, позволяющие изучать различные параметры гистологических препаратов. Выделяются следующие виды микроскопии: 1) световая микроскопия (наиболее распространенный вид микроскопии, при этом разрешающая способность микроскопа составляет 0,2 мкм); 2) ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность микроскопа составляет 0,1 мкм); 3) люминисцентная микроскопия (применяется для определения в исследуемом гистологическом препарате определенных химических структур); 4) фазово-контрастная микроскопия (применяется для обнаружения и изучения определенных структур в неокрашенных гистологических препаратах); 5) поляризационная микроскопия (используется в основном для изучения волокнистых структур); 6) микроскопия в темном поле применяется для изучения живых объектов; 7) микроскопия в падающем свете (предназначена для изучения толстых объектов); 8) электронная микроскопия (наиболее современный вид микроскопии, имеющий разрешающую способность 0,1—0,7 нм). Имеются две разновидности электронной микроскопии — просвечивающая (трансмиссионная) и сканирующая (или растворная) микроскопия, дающая отображение поверхностных ультраструктур. Гистологические и цитохимические методы применяются для определения состава химических веществ и их количества в определенных структурах. Принцип метода заключается в химической реакции между реактивом и субстратом, содержащимся в исследуемом веществе. При этом образующиеся побочные продукты реакции можно обнаружить с помощью световой или люминисцентной микроскопии. Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в исследуемых структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов. Данный метод чаще всего используется при экспериментах на животных. Метод интерферонометрии позволяет определять сухую массу вещества в живых или фиксированных объектах. Метод культуры клеток — это выращивание клеток в пробирках или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом. Метод витального окрашивания — введение животным в кровь или в брюшную полость красителя (трепанового синего), который при жизни животного захватывается определенными клетками — макрофагами, а после забоя животного и приготовления препарата определяются и подсчитываются клетки, содержащие краситель. Иммуноморфологические методы позволяют с помощью предварительно проведенных иммунных реакций (на основе взаимодействия антиген — антитело) определять субпопуляцию лимфоцитов, степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов, т. е. определять их гистосовместимость для дальнейшей трасплантации. Метод дифференциального центрифугирования — изучение отдельных органелл или даже их фрагментов, выделенных из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2 до 150 тыс. в 1 мин). В результате центрифугирования получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами. Методы морфометрии — количественные методы. Они позволяют определять размеры и объемы ядра — кариометрия, клеток — цитометрия, органелл — электронная морфометрия, а также определять число клеток различных популяций и субпопуляций. Данные методы широко используются в научных исследованиях. Различные экспериментальные методы — пищевая и водная нагрузка, физические методы (УВЧ, СВЧ, лазеры, магниты). Они применяются для изучения реакции интересующих структур на то или иное воздействие и сочетаются с методами морфометрии, цито- и гистохимии. Данные методы также применяются в научных исследованиях. Таким образом, основным и наиболее распространенным методом изучения в гистологии является микроскопия. Приготовление гистологического препарата включает в себя следующие этапы. 1. Взятие материала — кусочка ткани или органа. При заборе материала необходимо выполнять следующие правила: 1) забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, при возможности от живого объекта, чтобы как можно лучше сохранить структуру исследуемых клеток; 2) забор материала должен проводиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани; 3) толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор смог проникнуть на всю глубину ткани; 4) обязательно необходимо произвести маркировку кусочка, при этом указываются наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора. 2. Фиксация материала. Данный этап проводится для того, чтобы остановить обменные процессы в клетке и сохранить ее от распада. Для этого взятый на исследование кусочек ткани погружают в фиксирующий раствор. Раствор может быть простым (спирт или формалин) и сложным (раствор Карнуа, фиксатор Цинкера). Фиксатор вызывает денатурацию белков и сохраняет структуру клеток в состоянии, близком к прижизненному. Фиксацию можно проводить также путем замораживания — охлаждением жидким азотом или струей углекислого газа. 3. Заливка кусочков ткани в уплотняющие среды (парафин, смолы) — или замораживание. Данный этап необходим для того, чтобы в последующем из исследуемой ткани можно было изготовить тонкий срез. 4. Приготовление срезов на микротоме или ультрамикротоме с помощью специальных ножей. После этого срезы для световоймикроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной — монтируются на специальные сеточки. 5. Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов необходимо удалить уплотняющую среду — выполнить депарафирование. С помощью окраски достигается контрастность изучаемых структур. Красители можно подразделить на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко применяются основные красители (гематоксилин) и кислые (эозин). Часто используются и сложные красители. 6. Просветление срезов в ксилоле и толуоле. Их заключают в смолы (бальзам и полистирол) и закрывают покровным стеклом. После данных процедур препарат можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло срезы для светового микроскопа могут долго храниться и многократно использоваться. Для электронной микроскопии каждый срез используется только 1 раз, при этом он фотографируется, и изучение структур ткани производится по электронограмме. Если ткань имеет жидкую консистенцию (например, кровь, костный мозг), то препарат изготавливают в виде мазка на предметном стекле, который затем также фиксируется, окрашивается и изучается. Из ломких паренхиматозных органов изготавливают препараты в виде отпечатка органа, проводят разлом данного органа, затем к месту разлома прикладывают предметное стекло, на которое приклеиваются свободные клетки. После этого препарат фиксируется и изучается. Из некоторых органов (например, брыжейки, мягкой мозговой оболочки) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливают пленочные препараты путем растягивания или раздавления между двумя стеклами с последующей фиксацией и заливкой в смолы. Клетка: определение понятия, общий план строения. Гиалоплазма: химический состав, значение. Органеллы и включения: определение понятий, классификации. Клетка - элементарная структурная, функциональная и генети ческая единица в составе всех растительных и животных организмов. Организм взрослого человека состоит примерно из 10}3 клеток, кото рые подразделяют более чем на 200 типов, существенно различаю щихся своими структурными и функциональными особенностями. Вмес те с тем, клетки всех типов характеризуются сходством общей органи зации и строения важнейших компонентов. Компоненты клетки. Каждая клетка состоит из двух основных компонентов - ядра и цитоплазмы. В ядре находятся хромосомы, содер жащие генетическую информацию, которая в результате процесса транскрипции постоянно избирательно считывается и направляется в цитоплазму, где она контролирует ход многообразных процессов жиз недеятельности клетки, в частности, сбалансированные процессы синте за, анаболизма (от греч. anabole - повышение), и разрушения, катабо лизма (от греч. kataballo - разрушаю). Указанные процессы осуществля ются в цитоплазме благодаря взаимодействию ее компонентов. Компоненты цитоплазмы. Цитоплазма отделена от внешней (для данной клетки) среды внешней клеточной мембраной (плазмолеммой) и содержит органеллы и включения, погруженные в гиалоплазму (клеточный матрикс). Органеллы - постоянно присутствующие в цитоплазме структуры, специализированные на выполнении определенных функций в клетке. Они подразделяются на органеллы общего значения и специальные орга неллы.
(2) специальные органеллы имеются лишь в некоторых клетках и обеспечивают выполнение их специализированных функций. К ним относят реснички, жгутики, микроворсинки, миофибриллы, акросому (спермиев). Специальные органеллы образуются в ходе развития клетки как производные органелл общего значения. В состав многих органелл входит элементарная биологическая мембрана, поэтому органеллы подразделяют также на мембранные и не мембранные. К мембранным органеллам относятся митохондрии, ЭПС, комплекс Гольджи, лизосомы, пероксисомы, к немембранным рибосомы, клеточный центр, реснички, микроворсинки, жгутики, ком поненты цитоскелета. Функциональные системы (аппараты) клетки - комплексы органелл, которые под контролем ядра обеспечивают выполнение важ нейших функций клетки. Выделяют: (1) синтетический аппарат; (2) энергетический аппарат; (3) аппарат внутриклеточного перевари вания (эндосомально-лизосомальный); (4) цитоскелет. Включения - временные компоненты цитоплазмы, образованные в результате накопления продуктов метаболизма клеток. Подразделяют ся на несколько типов: трофические: лецитин в яйцеклетках; гликоген; липиды, имеются почти во всех клетках; секреторные: секреторные гранулы в секретирующих клетках (зимогенные гранулы в ацинозных клетках поджелудочной железы); секреторные гранулы в эндокринных железах и другие; экскреторные: вещества, подлежащие удалению из организма (например, гранулы мочевой кислоты в эпителии почечных канальцев); пигментные:меланин;гемоглобин;липофусцин;билирубин и другие. В процессе жизнедеятельности в некоторых клетках накапливаются случайные включения:медикаментозные;частички угля;кремния и так далее. Помимо структур цитоплазмы, которые можно четко отнести к ор ганеллам или включениям, в ней имеется огромное количество разно образных транспортных пузырьков, обеспечивающих не только перенос веществ между различными компонентами клетки, но и их частичное преобразование (процессинг) благодаря наличию ферментов в мембране, которая образует их стенку. Мембранные структуры (компоненты) клетки - совокупное на звание различных структур цитоплазмы и ядра: плазмолеммы, ряда орга нелл, включений, транспортных пузырьков, а также ядерной оболочки (кариолеммы), в состав которых входят клеточные мембраны. Послед ние в различных мембранных структурах клетки организованы сходным образом, однако существенно различаются, в первую очередь, составом мембранных белков, определяющим специфику их функций. Гиалоплазма (клеточный сок, цитозолъ, клеточный матрикс) -внутренняя среда клетки, на которую приходится до 55% ее общего объема. Она представляет собой сложную прозрачную коллоидную сис тему, в которой взвешены органеллы и включения, и содержит различ ные биополимеры: белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, а также ионы. Претерпевает превращения по типу гельзоль. В гиалоплазме про исходит большая часть реакций промежуточного обмена. МЕМБРАННЫЕ СТРУКТУРЫ КЛЕТКИ: РАЗНОВИДНОСТИ. УЛЬТРАМИКРОСКОПИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ, ЗНАЧЕНИЕ, ОБНОВЛЕНИЕ. Принцип строения мембранных органелл Мембранные органеллы представляют собой замкнутые и изолированные участки (компартменты) в гиалоплазме, имеющие свою внутреннюю структуру. Стенка их состоит из билипидной мембраны и белков подобно плазмолемме. Однако билипидные мембраны органелл имеют особенности: толщина билипидных мембран органелл меньше, чем плазмолеммы (7 нм против 10 нм), мембранные отличаются по количеству и по содержанию белков, встроенных в них. Однако, несмотря на различия, мембраны органелл имеют одинаковый принцип строения, поэтому они обладают способностью взаимодействовать друг с другом, встраиваться, сливаться, разъединяться, отшнуровываться. Общий принцип строения мембран органелл можно объяснить тем, что все они образуются в эндоплазматической сети, а затем происходит их функциональная перестройка в комплексе Гольджи. Митохондрии Митохондрии — наиболее обособленные структурные элементы цитоплазмы клетки, обладающие в значительной степени самостоятельной жизнедеятельностью. Существует мнение, что в прошлом митохондрии были самостоятельными живыми организмами, после чего внедрились в цитоплазму клеток, где ведут сапрофитное существование. Доказательством этого может являться наличие у митохондрий генетического аппарата (митохондриальной ДНК) и синтетического аппарата (митохондриальных рибосом). Форма митохондрий может быть овальной, округлой, вытянутой и даже разветвленной, но преобладает овальновытянутая. Стенка митохондрий образована двумя билипидными мембранами, разделенными пространством в 10—20 нм. При этом внешняя мембрана охватывает по периферии всю митохондрию в виде мешка и отграничивает ее от гиалоплазмы. Внутренняя мембрана отграничивает внутреннюю среду митохондрии, при этом она образует внутри митохондрии складки — кристы. Внутренняя среда митохондрии (митохондриальный матрикс) имеет тонкозернистое строение и содержит гранулы (митохондриальные ДНК и рибосомы). Функция митохондрий — образование энергии в виде АТФ. Источником образования энергии в митохондриях является ПВК (пируват), которая образуется из белков, жиров и углеводов в гиалоплазме. Окисление пирувата происходит в митохондриальном матриксе, а на кристах митохондрий осуществляется перенос электронов, фосфорилирование АДФ и образование АТФ. Образующаяся в митохондриях АТФ является единственной формой энергии, которая используется клеткой для выполнения различных процессов. В течение жизни клетки происходит неоднократное обновление митохондрий. Восстанавливаются они делением старых митохондрий. Эндоплазматическая сеть Эндоплазматическая сеть (ЭПС) в разных клетках может быть представлена в форме уплощенных цистерн, канальцев или отдельных везикул. Стенка состоит из билипидной мембраны. Различают две разновидности ЭПС: 1) зернистую (гранулярную, или шероховатую); 2) незернистую (или гладкую). На наружной поверхности мембран зернистой ЭПС содержатся прикрепленные рибосомы. В цитоплазме при электронно-микроскопическом исследовании можно обнаружить два вида ЭПС, однако один из них преобладает, что и определяет функциональную специфичность клетки. Эти две разновидности ЭПС не являются самостоятельными и обособленными формами, так как при более детальном исследовании можно обнаружить переход одной разновидности в другую. Функции зернистой ЭПС: 1) синтез белков, предназначенных для выведения из клетки (на экспорт); 2) отделение (сегрегация) синтезированного продукта от гиалоплазмы; 3) конденсация и модификация синтезированного белка; 4) транспорт синтезированных продуктов в цистерны пластинчатого комплекса; 5) синтез компонентов билипидных мембран. Функции гладкой ЭПС: 1) участие в синтезе гликогена; 2) синтез липидов; 3) дезинтоксикационная функция (нейтрализация токсических веществ посредством соединения их с другими веществами). Пластинчатый комплекс Гольджи Пластинчатый комплекс называют транспортным аппаратом клетки. Пластинчатый комплекс Гольджи (сетчатый аппарат) представлен скоплением уплощенных цистерн и небольших везикул, ограниченных билипидной мембраной. Пластинчатый комплекс подразделяется на субъединицы — диктиосомы. Каждая диктиосома представляет собой стопку уплощенных цистерн, по периферии которых локализуются мелкие пузырьки. При этом в каждой уплощенной цистерне периферическая часть несколько расширена, а центральная сужена. В диктиосоме различают два полюса: цисполюс (направленный основанием к ядру) и трансполюс (направленный в сторону цитолеммы). Установлено, что к цисполюсу подходят транспортные вакуоли, несущие в комплекс Гольджи продукты, синтезированные в ЭПС. От трансполюса отшнуровываются пузырьки, несущие секрет к плазмолемме для его высвобождения из клетки. Часть мелких пузырьков, заполненных белками-ферментами, остается в цитоплазме и носит название лизосом. Функция пластинчатого комплекса: 1) транспортная (выводит из клетки синтезированные в ней продукты); 2) конденсация и модификация веществ, синтезированных в зернистой ЭПС; 3) образование лизосом (совместно с зернистой ЭПС); 4) участие в обмене углеводов; 5) синтез молекул, образующих гликокаликс цитолеммы; 6) синтез, накопление, выведение муцинов (слизи); 7) модификация мембран, синтезированных в ЭПС и превращение их в мембраны плазмолеммы. |