КОЛОК. Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней бактериоскопический, бактериологический, биологический, серологический, аллергический и собственно иммунный. Их достоинства и недостатки
 Скачать 6.71 Mb.
|
|
БИОЛОГИЧЕСКИЕМЕТОДЫ Биологические методы направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содержании в исследуемом образце или когда возбудитель не может быть обнаружен методом посева, - например, при вирусных и риккетсиозных заболедваниях). Животных заражают для выделения чистой культуры возбудителя в тех случаях, когда нельзя получить ее другими способами (например, при загрязнении исследуемых объектов посторонней микрофлорой, подавляющей рост возбудителя; при незначительном содержании микроорганизмов или переходе их в фильтрующиеся формы). Методы включают заражение чувствительных лабораторных животных (чувствительных к предполагаемому возбудителю) исследуемым материалом споследующим выделением чистой культуры патогена либо установлением фактаприсутствия микробного токсина и его природы, либо воспроизводят характернуюклиническую картину. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутрисистемы микроорганизм—макроорганизм. Для проведения биологических пробиспользуют только здоровых животных определённых массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, черезтрепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головногомозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели —кровь, кусочки различных органов, СМЖ, экссудат из различных полостей. Недостатки: а) необходимость содержания вивария; б) длительность проведенияисследования. Кроме того, даже при лабораторном заражении далеко не всегда удаетсявыделить возбудителя, что особенно характерно для вирусных инфекций. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ метод заключается в определении титра специфических антител в сыворотке больного. Для его реализации используют различные реакции иммунитета, как простые (агглютинация и ее разновидности), так и сложные (РСК, ИФА и др.). Классическая серодиагностика основана на: 1). Определении антител к возбудителю в диагностическом титре; 2).Обнаружение в исследуемой сыворотке крови антител к возбудителю ряда инфекционных болезней недостаточно для постановки диагноза, поскольку оно может отражать наличие постинфекционного или поствакцинального иммунитета. Именно поэтому исследуют парные сыворотки больного, взятые в первые дни болезни и через 7-10 дней (иногда этот интервал может быть более длительным). В этом случае оценивают нарастание титра антител. Нарастание титра антител в 4 раза и более свидетельствуетоб инфекционной природе антител. 3).При экзотических инфекционных болезнях, а также при гепатитах, ВИЧ- инфекции и при некоторых других заболеваниях сам факт определения антител свидетельствует об инфицированности пациента и имеет диагностическое значение. Серологический метод диагностики применяют с конца первой-начала второй недели заболевания. Для обнаружения антитела к исследуемой сыворотке прибавляют известный антиген. Эти препараты, называемые диагностикумами, представлят собой взвесь убитых микроорганизмов (их отдельных антигенов) или эритроцитов (частиц латекса), на которых адсорбированы микроорганизмы или их антигены. СОБСТВЕННО ИММУННЫЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ Собственно-иммунный метод (экспресс) Цель: поиск антигенов микробов в патологическом материале с помощью серологических иммунных реакций (см. реакции в приложении 6 в разделе 4). РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА Серологическими называют реакции иммунитета между антигенами (АГ) и антителами (AT). Детерминанта АГ связывается с активным центром AT. Соединение АГ и AT осуществляется посредством водородных и гидрофобных связей, взаимодействия ионов, кулоновских и ван-дер-вальсовых сил. Прочность соединения АГ с AT обеспечивается не только силами связывания, но и оптимальной адаптацией активного центра AT к АГ-детерминанте. Серологические реакции протекают в две фазы. Первая — специфическая невидимая — заключается во взаимодействии АГ с AT. Вторая фаза — видимая — проявляется в зависимости от типа реакции, который определяется свойствами АГ, AT и другими ингредиентами реакций. Различают несколько типов реакций: агглютинация, преципитация (иммунная диффузия), лизис, нейтрализация и др. Реакция агглютинации В реакции агглютинации (РА) антиген участвует в виде корпускулярной частицы. Это могут быть суспензии микроорганизмов, клеток организма, например эритроцитов. При смешивании со специфической антисывороткой происходит склеивание и оседание визуально различимых хлопьев — иммунных комплексов. Реакцию агглютинации можно ставить качественно — на стекле и количественно — в пробирках, где готовятся разведения сыворотки. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) является своеобразной модификацией РА. Сущность ее состоит в том, что молекулы антигена адсорбируются на поверхности эритроцитов (после обработки эритроцитов танином или формалином). Такие «нагруженные» АГ эритроциты приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для данного АГ. Образование комплекса АГ—AT влечет за собой и склеивание эритроцитов (на дне лунки или пробирки образуется гемагглютинат в виде «перевернутого зонтика»), что легко учитывать. Таким образом, эритроциты не участвуют непосредственно в образовании комплекса АГ—AT, но служат его индикаторами. РНГА более чувствительна, чем РА. Реакция Кумбса Это тест на выявление неполных антител, которые сами не могут агглютинировать антигены, но способны к ним присоединяться. Реакцию проводят поэтапно: к сыворотке крови обследуемого добавляют эритроцитарный диагностикум — известные антигены, адсорбированные на эритроцитах. После инкубации эритроциты отмывают и добавляют кроличьи AT против человеческих глобулинов. В результате антиглобулиновая сыворотка склеивает эритроциты через образовавшиеся на них комплексы АГ—AT. Существуют две разновидности реакции Кумбса: прямой и непрямой: • Прямой метод: выявление антирезусных антител, адсорбированных на эритроцитах новорождённого. Кровь берут у новорождённого, отмывают эритроциты, добавляют к ним антиглобулиновые антитела: реализуется феномен «решётки» - происходит видимая глазом агглютинация эритроцитов • Непрямой метод: выявление антирезусных анител в сыворотке матери. ///1. В пробирку с материнской сывороткой вносят стандартные резус-положительные эритроциты. На эритроцитах адсорбируются антирезусные антитела сыворотки матери. 2.Вносят в пробирку антиглобулиновую сыворотку (антиглобулиновые антитела): реализуется феномен «решётки» - происходит видимая глазом агглютинация эритроцитов Реакция преципитации В реакции преципитации (РП) участвует мелкодисперсный (растворимый антиген). При контакте с антителами — преципитинами образуется осадок. Реакцию преципитации можно проводить в жидкой среде (в узких пробирках) и в геле (в чашках Петри). При постановке РП в узких пробирках жидкость, содержащую один из реагентов, например, прозрачный экстракт из микробных клеток (0,2 мл), наслаивают на прозрачную преципитирующую сыворотку (0,2 мл). В положительных случаях на границе соприкосновения жидкостей через 1—5 минут образуется серо-белое кольцо. РП, как и РА, идет в электролите, но отличается более высокой чувствительностью. ////Схемы реакций преципитации в пробирке (А) и агаре (Б). Одной из разновидностей РП в геле является реакция определения токсигенности дифтерийной палочки. Для этого в чашку Петри на питательную среду помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Затем чашку засевают испытуемыми культурами в виде пятачков на расстоянии 0,6—0,8 см от края бумаги. Чашки инкубируют при 37°С в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются лини преципитации в виде дуг (усов, полуколец). Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) Прямая (метод Кунса). Микроорганизмы, обработанные антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в люминесцентном микроскопе. Непрямая. На первом этапе микроорганизмы взаимодействуют со специф ческой сывороткой. Далее воздействуют на образовавшийся иммунный комплекс антиглобулиновой сывороткой, меченной флюорохромом. Иммунный комплекс с помощью этого конъюгата светится в люминесцентном микроскопе. Реакция связывания комплемента (РСК) Это реакция лизиса антигена (например, цитолиза, бактериолиза) под действием антител с участием комплемента. Если антиген - это бактериальная клетка или вирус, то лизис не сопровождается видимыми проявлениями. Поэтому, чтобы обнаружить наличие комплекса АГ + AT + комплемент в опытной системе, где неизвестен один из компонентов (АГ или AT), используют индикаторную систему АГ + AT, где оба компонента известны и лизис антигена хорошо проявляется, так как в качестве АГ берут эритроциты. Реакция основана на способности комплемента — комплексной системы белков нормальной сыворотки позвоночных — фиксироваться на комплексе АГ—AT и последующем лизисе антигена. В РСК участвуют пять компонентов: АГ—AT опытной системы, в которой один из реагентов неизвестен, комплемента и индикаторной системы. Индикаторная — гемолитическая система состоит из взвеси эритроцитов барана и гемолитической сыворотки кролика, полученной путем его иммунизации эритроцитами барана. Если АГ и AT в опытной системе соответствуют друг другу, то результатом этого взаимодействия является связывание комплемента. Индикаторная система выявляет свободный, несвязавшийся комплемент. Если комплемент остался свободным, то он свяжется с комплексом эритроциты — гемолитическая сыворотка и будет лизировать эритроциты. Таким образом, наличие гемолиза означает отрицательный результат РСК, а отсутствие гемолиза — положительный результат. Иммуноферментный метод Высокочувствительный метод выявления АГ или AT на основе реакции АГ—AT с применением меченных ферментами АГ или AT. Принципиальная схема иммуноферментного анализа для выявления AT следующая. Известный АГ (вирус, белок) — диагностикум — фиксируется на твердой фазе. К нему добавляют сыворотку обследуемого с неизвестными AT. После инкубации и промывки на антигене остаются специфичные к нему AT, если таковые имелись в сыворотке обследуемого. Для обнаружения комплекса АГ—AT к нему добавляют кроличью антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом (АГС-Ф). Для получения данной сыворотки иммунизируют кролика глобулинами человека. Полученную от кролика сыворотку метят каким-либо ферментом, например, пероксидазой хрена. Если в исследуемой сыворотке есть AT к АГ (диагностикум), то они будут служить антигеном для антиглобулиновой сыворотки. После второй промывки образовавшийся комплекс АГ + AT + АГС-Ф можно обнаружить, добавив субстрат к ферменту и индикатор на продукты расщепления субстрата. Изменение цвета индикатора свидетельствует о наличии искомых AT в сыворотке обследуемого. АЛЛЕРГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ. При многихинфекционных заболеваниях развивается состояние повышенной чувствительностик повторному введению возбудителя или продуктов его жизнедеятельности. Такоесостояние, называемое инфекционной аллергией, характерно для туберкулеза,туляремии, бруцеллеза, сапа, сифилиса, сибирской язвы, токсоплазмоза, паротита,простого герпеса и ряда других инфекций. Для выявления инфекционной аллергии применяют аллергическиедиагностические пробы, для чего строго внутрикожно вводят соответствующий аллерген.Наличие гиперемии и инфильтрата указывает на положительный результатреакции, т. е. на наличие инфекционной аллергии. Аллергический метод диагностики основан на аллергической реакции – реакциигиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). В основе формирования реакции ГЗТ лежит не гуморальный, а клеточныйиммунный ответ организма на первый (сенсибилизирующий) контакт с определеннымантигеном. Сенсибилизация связана с преимущественной пролиферацией Т-лимфоцитов,несущих специфические для данного аллергена рецепторы. После этого в организменадолго сохраняется размножившийся клон сенсибилизированных Т-лимфоцитов,который вступает в реакцию с конкретным аллергеном при его повторном попадании ворганизм. Выявление клеточного иммунного ответа - гиперчувствительности замедленноготипа (ГЗТ), схема * Введение внутрикожно Аг бактерий * Через 48 – 72 часа появляется воспаление * Измеряют величину покраснения и папулы • Аг Тх выделяют лимфокиныактивация Тцтл активация фагоцитоввоспаление В реакциях ГЗТ участвуют: Т-хелперы (стимулируют образование Т-эффекторовчерез ИЛ-2) → Т-эффекторы (продуцируют лимфокины - хемоаттрактанты и привлекаютмакрофаги в очаг воспаления) → макрофаги (продуцируют медиаторы-монокины) →мононуклеарный инфильтрат на месте введения аллергена → величина инфильтратазависит от степени сенсибилизации организма и достигает максимума через 24-48 ч Аллергические диагностические пробы позволяют диагностировать туберкулез (реакция Манту), бруцеллез (проба Бюрне), туляремию (проба с тулярином), сибирскую язву (проба с антраксином), мягкий шанкр (реакция Дюкрея), проказу (реакция Мицуды), а последняя - даже дифференцировать туберкулоидную (лепромин-положительную) форму от лепроматозной (лепромин-отрицательной). Положительная кожная аллергическая проба указывает, что введение аллергена при постановке пробы является повторным, т. е. индивидуум в прошлом имел контакт с микробным агентом. Здесь сказывается основной недостаток диагностической ценности кожно-аллергических проб, так как они могут быть положительными не только у инфицированных, но и у привитых против этих болезней, а также у лиц, переболевших много лет назад, в том числе и у носителей, т. е. положительный тест у здоровых лиц указывает только на контакт с микробным антигеном. При определении природы заболевания истинное диагностическое значение имеет только переход от отрицательной кожной пробы к положительной, который наблюдается в течение болезни. Кроме того, вираж реакции, т. е. увеличение выраженности ее проявления при повторном исследовании, также служит основанием для более детального обследования на инфицированность данным возбудителем. При приеме некоторых препаратов кортикостероидных гормонов, иммунодепрессантов, а также при некоторых заболеваниях (саркоидозе, болезниХоджкина и отдельных опухолях) учет результатов постановки аллергических проб затруднен, потому что в этих случаях наблюдается так называемая анергия, т. е. значительное снижение общей кожной реактивности. Более того, при появлении сыпи у детей, когда ребенок переносит одно из таких заболеваний, как корь, ветряная оспа, также может иметь место анергия, и в этот период при постановке пробы Манту туберкулиноположительный ребенок может стать временно туберкулиноотрицательным, т. е. получается ложноотрицательный результат. Генетические методы диагностики инфекционных заболеваний (ДНК-зондирование, ПЦР). Их принцип, область применения. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ в исследуемом материале обнаруживают нуклеотидные последовательности ДНК возбудителя. К ним относятся метод ДНК-гибридизации и полимеразная цепная реакция. Метод ДНК- г и б р и д и з а ц и и основан на способности денатурированной одноцепочечной ДНК возбудителя достраивать гомологичную цепь в бесклеточной системе. В качестве материала для этой второй нити используют ДНК-зонды. Это лабораторно приготовленные фрагменты молекулы ДНК, гомологичные фрагментам ДНК искомого возбудителя. Зонд метят либо радиоактивным изотопом, либо ферментом. В последнем случае для регистрации включения ДНК-зонда в ДНК бактерий, содержащуюся в исследуемом материале, к пробе добавляют субстрат, соответствующий использованному ферменту. Положительная реакция субстрат-фермент проявляется в изменении окраски субстрата и свидетельствует о соответствии ДНК-зонда ДНК возбудителя, находящейся в исследуемом материале. Чувствительность метода уступает ПЦР (103 микроорганизмов в пробе), что ограничивает его применение как диагностического теста, тем более что аналогичную чувствительность имеют иммунологические методы, выявляющие микробные антигены. По л и ме р а з н а я ц е п н а я р е а к ц и я (ПЦР) представляет собой метод направленной амплификации (воспроизведения) ДНК, позволяющий найти в исследуемом клиническом материале небольшие участки генетической информации любого организма и многократно размножить их. Для реализации ПЦР создают набор праймеров - фрагментов ДНК, являющихся маркером данного возбудителя. При добавлении такого праймера к пробе исследуемого материала, содержащей денатурированную одноцепочечную ДНК, происходит их соединение с комплементарным участком ДНК. Образовавшийся двунитевой стартовый участок воспроизводится с помощью фермента Taq-полимеразы, входящей в набор для ПЦР. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации и т. д. Это и есть цепная реакция. В течение нескольких часов происходит 30-40 циклов амплификации. В результате амплификации количество копий специфической нуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в 106-108 раз, что обеспечивает высокую чувствительность метода. Преимущества молекулярно-генетических методов диагностики состоят в их высокой специфичности и чувствительности. Они позволяют обнаруживать в исследуемом материале единичные клетки возбудителя. ПЦР имеет три технологические стадии: ❖ выделение и экстракция ДНК (пробоподготовка); ❖ амплификация; ❖ регистрация результатов амплификации. Вторая стадия ПЦР — циклическая амплификация — протекает поэтапно при определённой температуре реакционной смеси. Образовавшиеся в каждом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для последующих циклов, при этом число копий ДНК нарастает в геометрической прогрессии (2n, где n — число прошедших циклов амплификации). Описанные процессы протекают в термоциклере — программируемом термостате, по заданной программе осуществляющем смену температур согласно числу циклов шплификации. Схема цикла полимеразной цепной реакции: 1 — нативная двухцепочечная ДНК; 2 — денатурация ДНК при температуре 94 °С; 3 — гибридизация (присоединение праймеров при температуре 55⁰ С); 4 — синтез комплементарной цепи ДНК при температуре 72 ⁰С, образование двухцепочечной ДНК. Визуализацию результатов ПЦР осуществляют электрофоретическим разделением продуктов реакции в агарозном геле или методом гибридизации ампликонов с комплементарным к определяемой последовательности олигонуклеотидным зондом, меченным флюоресцентной, ферментной или другой меткой. Принципиально новое направление развития регистрационных систем — использование оптических биосенсоров, позволяющих определять в ходе гибридизации в реальном режиме времени пикограммовые количества фрагментов нуклеиновых кислот, иммобилизованных на поверхности оптической кюветы. Достоинства ПЦР: - высокая чувствительность метода, позволяющая определять 10-1000 клеток впробе; - высокая специфичность — в исследуемом материале выявляют уникальный для данного возбудителя фрагмент ДНК; - универсальность процедуры выявления различных возбудителей, что даёт возможность диагностировать несколько возбудителей в одной биопробе; - высокая скорость анализа — унифицированная обработка биоматериала и детекция продуктов реакции, а также автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 ч; - возможность проводить количественный анализ и определять число копий специфических последовательностей нуклеотидов в пробе, контролируя таким образом вирусемию или бактериемию (например, вирусную нагрузку при вирусных гепатитах или ВИЧ-инфекции); - возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. ПЦР можно эффективно использовать для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, её использование целесообразно для выявления возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Метод ПЦР имеет свои ограничения, в частности, для диагностики инфекций, вызванных условно-патогенной микрофлорой. Высокая чувствительность ПЦР создаёт опасность получения ложноположительных результатов за счёт минимальных загрязнений ДНК окружающей среды лабораторий, регулярно выполняющих однотипные исследования. Это формирует строгие требования к режиму проведения анализа. 3. Условно-патогенные микроорганизмы, их общая характеристика. Условия возникновения гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных условно-патогенной микрофлорой. Методы микробиологической диагностики. Условно-патогенные микроорганизмы – это большая группа микроорганизмов, которые в норме никаких заболеваний у человека не вызывают.    Часто обнаруживаются в воде, почве, пищевых продуктах, на объектах окружающей среды Встречаются среди всех групп микробов. 30-35 % всех хирургических вмешательств осложняется гнойно-воспалительными процессами. Их них на долю стафиллококов и стрептококков 20-25%, остальные вызываются различными грамотрицательными бактериями, чаще представителями родов Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Proteus, Bacteroides |