Методвказ_вки (БП). Методичні вказівки до практичних занять з біологічної та біоорганічної хімії для студентів медичного факультету
 Скачать 491 Kb.
|
Самостійна аудиторна робота
2. Виконати лабораторну роботу „Вплив рН середовища на активність амілази слини” і захистити протокол. Принцип методу. Оптимум рН для дії амілази можна визначити при взаємодії її з крохмалем при різних значеннях рН середовища. Ступінь розщеплення крохмалю можна оцінювати за реакцією крохмалю з розчином йоду. При оптимальному значенні рН розщеплення крохмалю відбувається повністю (забарвлення з йодом відсутнє). По мірі віддалення від точки оптимального рН в кислий або лужний бік розщеплення крохмалю пройде тільки частково до стадії декстринів (червоно-буре або фіолетове забарвлення) або крохмаль взагалі розщеплюватися не буде (синє забарвлення). Хід роботи. У 6 пробірок наливають по 2 мл буферного розчину з різним значенням рН (див. табл.). Потім в кожну пробірку доливають по 1 мл 0,5% р-ну крохмалю та по 1 мл попередньо розведеної слини. Вміст пробірок перемішують і поміщають в термостат при 38оС на 10 хвилин. У всі пробірки приливають по 1 краплі розчину йоду, перемішують. Спостерігають забарвлення і відмічають рН (оптимум рН), при якому амілаза діє найбільш активно. Таблиця Приготування буферних розчинів
Література
Обговорено і затверджено на засіданні кафедри, протокол №1 від 28.08.2008р. Зав. кафедрою проф. Ерстенюк А.М. Заняття №4 Тема: МЕХАНІЗМ ДІЇ ТА СПЕЦИФІЧНІСТЬ ФЕРМЕНТІВ.Актуальність теми: Знання механізмів дії ферментів лежать в основі медичної ензимології. Здатність ферментів каталізувати одну специфічну реакцію є найбільш важливою їх властивістю. Завдяки цьому швидкості специфічних метаболічних процесів можуть регулюватись шляхом зміни каталітичної активності ферментів. Навчальні цілі: Знати: механізм дії ферментів і види специфічності. Вміти: провести дослідження специфічності дії амілази і сахарази, трактувати одержані дані. Самостійна позааудиторна робота В зошитах для протоколів: а) намалюйте енергетичну діаграму неферментативної і ферментативної хімічної реакцій, покажіть на ній енергію активації і зміну вільної енергії. б) підготуйте вихідні дані для оформлення протоколу лабораторної роботи „Специфічність ферментів”. Контрольні питання
Самостійна аудиторна робота
а) абсолютна; б) відносна; в) стереохімічна; 2. Охарактеризувати стадії ферментативного каталізу і ефекти, які їх супроводжують: а) приєднання субстрату до ферменту, б) активація фермент-субстратного комплексу, в) утворення продуктів реакції, г) вивільнення продуктів реакції. 3. Виконати лабораторну роботу „Специфічність ферментів” і захистити протокол. Принцип методу. Ферменти володіють специфічністю, оскільки здатні каталізувати тільки певні хімічні реакції. Ферменти специфічні у відношенні як типу реакцій, які вони каталізують, так і субстратів, на які вони діють. Амілаза слини прискорює гідроліз тільки полісахаридів, не діючи на дисахариди. Мальтаза слини прискорює гідроліз дисахариду мальтози, який утворюється при гідролізі крохмалю, але немає ніякої дії на інший дисахарид - сахарозу. Сахароза не має вільної альдегідної групи, тому не дає реакції з реактивом Фелінга. Реакція може бути позитивною тільки в тому випадку, коли сахароза розщепиться на свої складові частини - глюкозу і фруктозу. Хід роботи. а) Специфічність дії амілази слини. В 2 пробірки наливають по 5 крапель слини, розведеної в 5 разів. В 1 пробірку добавляють 10 крапель 1% р-ну крохмалю, в 2 - 10 крапель 1% р-ну сахарози. Обидві пробірки на 10 хв. поміщають в термостат або водяну баню при температурі 38оС, після чого з вмістом їх проробляють р-цію з реактивом Фелінга (див. нижче). б) Специфічність дії сахарази. 1 г дріжджів розтирають з 2-ма грамами скляного піску, приливають 97 мл води і 2 мл толуолу, розчин фільтрують. Беруть 2 пробірки і в кожну доливають по 5 крапель сахарази фільтрату дріжджів. В 1-у пробірку добавляють 10 крапель 1% р-ну крохмалю, в 2 - 10 крапель 0,5% або 1% р-ну сахарози. Обидві пробірки поміщають в термостат при температурі 38оС на 10 хв., після цього проробляють з вмістом кожної пробірки реакцію Фелінга: до 5 крапель досліджуваного розчину приливають 3 краплі реактиву Фелінга, нагрівають пробірку до кипіння і кип’ятять 1 хв. У випадку позитивної реакції на глюкозу спостерігається червоне забарвлення внаслідок утворення закису міді. Порівнюють дію амілази слини і сахарази фільтрату дріжджів на сахарозу. Література
Обговорено і затверджено на засіданні кафедри, протокол №1 від 28.08.2008р. Зав. кафедрою проф. Ерстенюк А.М. Заняття №5Тема: ШВИДКІСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНИХ РЕАКЦІЙ. одиниці активності ферментів.Актуальність теми: Знання кінетики ферментативних процесів має важливе значення для розуміння принципів застосування ензимів у клінічній практиці. Навчальні цілі: Знати: залежність швидкості ферментативних процесів від температури, рН середовища, концентрації ферменту і субстрату. Вміти: провести дослідження активності аспартатамінотрансферази і трактувати одержані дані. Самостійна позааудиторна робота В зошитах для протоколів: 1. намалюйте графіки залежності швидкості ферментативної реакції від концентрації ферменту і субстрату. 2. підготуйте вихідні дані для оформлення протоколу лабораторної роботи „Визначення активності аспартатамінотрансферази”. Контрольні питання
Самостійна аудиторна робота Дайте відповідь на поставлені запитання 1 Як залежність швидкість ферментативних реакцій від: а) концентрації ферменту, б) концентрації субстрату, в) температури, г) рН середовища. 2.Виконати лабораторну роботу „Визначення активності аспартатамінотрансферази” і захистити протокол. Принцип методу. В результаті переамінування під дією аспартатамінотрансферази (АсАТ) аспарагінова кислота перетворюється в щавелевооцтову (ЩОК). ЩОК здатна в процесі ферментативної реакції перетворюватися в піровиноградну кислоту (ПВК). При додаванні кислого 2,4-динітрофенілгідразину (2,4-ДФГ) ферментативний процес зупиняється і утворюється динітрофенілгідразин піровиноградної кислоти, який в лужному середовищі дає коричнево-червоне забарвлення, інтенсивність якого пропорційна кількості утвореної ПВК. Таким чином, по кількості утвореної ПВК можна судити про активність ферменту. Активність амінотрансфераз виражають в мікромолях ПВК, утвореної 1 мл сироватки крові за 1 годину інкубації при температурі 37оС. В нормі активність АсАТ сироватки крові становить 0,1-0,45 мкмоль/год х мл. Хід роботи. В дві пробірки (дослідну і контрольну) вносять по 0,5 мл субстратної суміші для визначення АсАТ і ставлять в термостат при 37оС на 5 хвилин. Потім в дослідну пробірку додають 0,1 мл сироватки крові, а в контрольну - 0,1 мл води і 0,5 мл р-ну 2,4-ДФГ. Ставлять обидві пробірки в термостат на 60 хвилин при температурі 37оС. Виймають пробірки, додають в дослідну пробу 0,5 мл розчину 2,4-ДФГ і залишають при кімнатній температурі на 20 хвилин. Далі додають по 5 мл 0,4 н розчину NаОН в кожну пробірку, ретельно перемішують і залишають при кімнатній температурі на 10 хв для розвитку забарвлення. Оптичну густину вимірюють на ФЕКу в кюветі на 10 мм при зеленому світлофільтрі (500-560 нм) проти контролю. Розрахунок активності ферменту виконують по приготовленому заздалегідь калібрувальному графіку (за допомогою стандартного розчину ПВК). Активність виражають в умовних одиницях з розрахунку на 1 мл сироватки. 1 одиниця АсАТ відповідає такій активності ферменту, яка здатна за даних умов утворювати 1 мкг ПВК. При обчисленні ферменту необхідно врахувати і розведення сироватки: Х = А х 10, де Х – одиниця активності ферменту; 10 - перерахунок на 1 мл; А - кількість ПВК в 0,1 мл сироватки, знайдена по калібрувальному графіку, мкг. У сироватці крові здорових людей активність АсАТ, визначена при допомозі даного методу, коливається від 8 до 40 од. Перерахунок активності ферменту в мікромолі ПВК, що утворилася при інкубації 1 мл сироватки протягом 1 години при 37оС, проводять за формулою: А х 10 АсАТ = --------- , де 88 А – кількість ПВК в 0,1 мл сироватки, знайдена по калібрувальному графіку, мкг; 88 - маса 1 мкмоль ПВК, мкг; 10 - коефіцієнт перерахунку на 1 мл сироватки. Література
Обговорено і затверджено на засіданні кафедри, протокол №1 від 28.08.2008р. Зав. кафедрою проф. Ерстенюк А.М. Заняття №6Тема: активатори та інгібітори ферментів.Актуальність теми: Знання впливу модуляторів на активність ферментів необхідні для розуміння регуляції метаболічних процесів в організмі людини. Навчальні цілі: Знати: механізми дії активаторів та інгібіторів. Вміти:визначати вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази слини і трактувати одержані дані. Самостійна позааудиторна робота В зошитах для протоколів: 1. покажіть схематично дію йодацетату, малонової кислоти, сполук миш’яку, солей ртуті на активність ферментів. 2. підготуйте вихідні дані для оформлення протоколу лабораторної роботи “Вплив активаторів і інгібіторів на активність амілази слини”. Контрольні питання
а) зворотне: конкурентне і неконкурентне; б) незворотне; в) безконкурентне;
Самостійна аудиторна робота І. Дайте відповідь на поставлені запитання: 1. Які речовини активують - цитохромоксидазу; - церулоплазмін; - карбоангідразу; - α – амілазу; - пепсин 2. Які фактори є неспецифічними інгібіторами ферментів? 3. Докажіть конкурентну дію малонової кислоти стосовно сукцинатдегідрогенази. 4. Яким чином впливають іони важких металів на активність ферментів? 5. Який механізм дії ціанідів? 6. Який механізм дії сульфаніламідних препаратів? 7. Назвіть приклади інгібіторів для серинових і тіолових ферментів. ІІ.Виконати лабораторну роботу “Вплив активаторів і інгібіторів на активність амілази слини” і захистити протокол. Принцип роботи. Активуючий вплив хлористого натрію та інгібуючий - сірчанокислої міді на активність амілази визначають за ступенем розщеплення крохмалю. Хід роботи. В три пробірки наливають по 1 мл слини, розведеної в 40 разів. В залежності від активності слини її можна розводити в 10, 20, 40, 50 разів. В першу пробірку додають 2 краплі води, в другу - 2 краплі 1% р-ну NaCl, в третю - 2 краплі 1% р-н CuSO4. Після цього в кожну пробірку додають по 5 крапель 1% р-ну крохмалю. Всі три пробірки залишають при кімнатній температурі на 2 хв., після чого у всі пробірки додають по одній краплі розчину йоду, перемішують, спостерігають забарвлення і визначають у якій пробірці діє активатор або інгібітор. Доцільно в кожну пробірку додати води (2 мл) і перемішати – забарвлення буде більш наглядне. |