Химия. Навчальний посібник для студентів біологічних спеціальностей вищих навчальних закладів
 Скачать 5.37 Mb.
|
|
ЗАПИТАННЯ ДЛЯ САМОПЕРЕВІРКИ 1. Які характеристики живої системи вам відомі? Відповідь проілюст- руйте прикладами. 2. Сучасне поняття проживу систему. 3. Що вважають елементарною живою системою Чому? 4. Чи можна вважати елементарною живою системою хлоропласт Якщо можна, то чому? 5. Чи можна вважати елементарною живою системою мітохондрію? Чому? 6. Чи всі характеристики живої системи притаманні хлоропласту Ві- дповідь обґрунтуйте. 7. Чи всі характеристики живої системи властиві мітохондрії? Відпо- відь обґрунтуйте. 8. Які характеристики живої системи притаманні клітині? Відповідь обґрунтуйте. 9. Які існують гіпотези виникнення клітинної форми життя. 10. Походження еукаріотів. 11. Походження прокаріотів. 12. Теорії виникнення клітин сучасного еукаріотичного типу. 13. Теорії виникнення мітохондрій. 14. Теорії виникнення хлоропластів. 15. Теорія ендосимбіозу. 16. Теорії виникнення ядра. 17. Формування різноманіття внутрішніх мембран еукаріотичної клітини. 18. Збільшення кількості спеціалізованих клітин і вдосконалення методів координації їхньої активності як передумова еволюції вищих тварин. 19. Основні положення клітинної теорії 25 Розділ 2 МЕТОДИ ВИВЧЕННЯ КЛІТИН 2.1. З історії вивчення клітин Історія вивчення клітини невід'ємно повязана з історією розвитку мето- дів її дослідження. За свідченнями істориків у ХVІ столітті в західній Європі, зокрема в Голландії, відзначається інтенсивний розвиток оптичної техніки. Природно, що саме наприкінці цього століття з'являються перші складні оптичні прилади: телескоп і мікроскоп. Хто створив перший мікроскоп дос- теменно не відомо. Найпевніше, його неодноразово конструювали неза- лежно один від одного різні дослідники, майстри-шліфувальники та просто аматори модної справи. Історія зберегла імена голландців: майстра з виго- товлення окулярів Г. Янсена та двох його синів, про мікроскоп яких, створе- ний у 1590 р, є більш-менш надійні відомості. Цей громіздкий прилад (трубу довжиною 45 см і діаметром 5 см з позолоченої латуні підтримували три мідні дельфіни, предметний столик був у вигляді кола з чорного дерева) був подарований австрійському ерцгерцогу Альберту, правителю Бельгії. Проте знадобилося понад 70 років, доки мікроскоп, нарешті, стали за- стосовувати у природознавстві: у середині ХVІІ століття англійський фі- зик Р. Гуку сконструйованому ним мікроскопі (рис. 2.1), який збільшував зображення в 40 разів, уперше побачив і замалював клітини в корку. Власне, виявлені й описані були не стільки самі клітини, скільки їхні це- люлозні оболонки з порожнинами (рис. 2.2), названі порами, або кліти- нами (cellula). Так у 1665 р. почалось вивчення клітинного рівня організа- ції живої матерії. Незабаром спостереження, аналогічні тим, що провів Р. Гук, були зроблені й іншими дослідниками. При цьому пори Гука нази- вали то пухирцями (Н. Грю), то мішечками (М. Мальпігі). У 1674 р, суттєво поліпшивши оптичні властивості мікроскопа (що дозволило побачити мікроскопічні об'єкти збільшеними у 270 разів), Антоні ван Левенгук уперше повідомив про відкриття одноклітинних організмів, а ще через девять років – бактерій. У 1678 р. одночасно з Ніколасом Ха- ртсекером він відкриває сперматозоїд, помилково вважаючи при цьому, що відкрив справжній зародок людини, який у подальшому не зазнає сут- тєвих перебудов, а лише збільшується у розмірах. Проте, якщо Антоні ван Левенгук так і не зміг побачити у своєму мікроскопі "маленьку людину", то Н. Хартсекер врешті-решт просто намалював те, що хотів побачити рис. 2.3). І лише через 200 років у 1876 р. Оскар Гертвіг довів, що заро- док утворюється в результаті злиття сперматозоїда та яйцеклітини. 26 Рис. 2.1. Мікроскоп Р. Гука Рис. 2.2. Клітини корка на малюнку Р. Гука Рис. 2.3. Сперматозоїд з малюнка Н. Хартсекера 27 Рис. 2.4. Мікроскопи 18 століття Антоні ван Левенгуку також належить першість у відкритті еритроци- тів, проте подібність рослинної та тваринної клітин ним визначена так і не була. Пізніше, у 1781 р, клітини тварин описує Ф. Фонтана, але й ці дослідження тоді не призвели до розуміння універсальності клітинної будови й розуміння того, чим насправді є клітина. Протягом ХVІІІ століття мікроскопічна техніка зазнає подальшого розвитку рис. 2.4), ускладнюється система освіт- лення, поліпшується якість лінз, аналі- зуються все нові й нові об'єкти. У 1933 р. Р. Броун, спостерігаючи за клітинами орхідей, уперше описує ядро клітини. У 20–30-ті роки ХІХ століття Я. Пуркін'є формулює поняття про протоплазму (цитоплазму, як основний вміст живої клітини (головним у клітині по- чали вважати вже не її стінку, а вміст – протоплазму. Накопичений величезний фактичний матеріал з мікроскопії живих об'єктів вимагав чіткого наукового аналізу й систематизації. У 1838 р. ботанік М. Шлейден (рис. 2.5) зробив перші узагальнення стосовно клітинної бу- дови всіх рослинних організмів. Зоолог Т. Шванн 1939 р. поширює це узагальнення на всі тваринні організми, що й лягло в основу першого варіанта клітинної теорії, яка постулювала єдність клітинної будови всіх тваринних і рослинних організмів і принципову схожість (гомологію) клі- тин тваринних і рослинних організмів. Разом з тим, М. Шлейден і Т. Шванн поділяли хибні, але прийняті на той час погляди, згідно з якими клітини утворюються шляхом кристаліза- ції міжклітинної рідини. Центром такої кристалізації вважалося ядро. Тривалий час це положення було частиною клітинної теорії. Виправив його Р. Вірхов, який сформулював тезу "кожна клітина від клітини", дові- вши, що єдино можливим шляхом утворення клітин є їхній поділ. Створення клітинної теорії в середині ХІХ століття було подією вели- чезного значення. Вона стала одним з вирішальних доказів єдності всієї живої природи, підґрунтям для розвитку таких дисциплін, як ембріологія, гістологія, фізіологія, теорія еволюції. З розвитком уявлень про структуру живої клітини поглиблювались знання і про її хімічний склад. Визначальна роль у розвитку гістохімії (цитохімії) – науки про хімічний склад клітин і окремих її компонентів – належить французькому біологу Ф.-В. Распайлю. І хоча хімічні реакції ставили на зрізах мікропрепаратів і до нього (на зрізах рослинних тканин 28 уже були виявлені танін і галова кислота (метод Лінка, 1807), крохмаль метод де Клобі, 1814)), проте саме Ф.-В. Распайль уперше теоретично обґрунтував уже існуючі гістохімічні методи та розробив ряд нових, окре- сливши напрямок перспективного розвитку гістохімії як науки. Він запро- понував використовувати ксантопротеїнову реакцію для визначення біл- ків, фурфуролову – вуглеводів, альдегідну – триптофану. Модифікував- ши ряд методів аналітичної хімії, вчений застосував їх для визначення окремих речовин на мікроскопічних об'єктах. Ним також була запропоно- вана техніка мікроспалювання для визначення у тканинах деяких неорга- нічних сполук і окремих хімічних елементів. Рис. 2.5. М. Шлейден і Т. Шванн – засновники клітинної теорії Невизнання революційних для свого часу підходів Науковим комітетом Академії наук Франції не зупинило ані Ф.-В. Распайля, ані його послідовни- ків. У другій половині ХІХ століття було розроблено низку нових гістохімічних методика також упроваджено в практику анілінові барвники й гематоксилін, що суттєво прискорило розвиток уявлень про структурованість протоплазми (цитоплазми) клітини. У 1857 р. А. Колікером уперше описано мітохондрії в м'язових клітинах, а в 1894 р. Р. Альтманом і в 1897 р. К. Бенда – на інших об'єктах (власне К. Бенда й запропонував термін "мітохондрія"). Під назвою "тигроїд" Ф. Ніслем описано гранулярну ендоплазматичну сітку. Е. Ван Бе- неден 1875 року описав клітинний центра К. Бенда у 1889 р. – пластиди. У 1898 р. К. Гольджі, використавши техніку імпрегнації сріблом, відкрив пла- стинчастий комплекс, названий його ім'ям – апарат Гольджі. 29 Детальний опис процесів поділу клітин і відкриття хромосом пов'язані з працями цілого ряду науковців. Гофмейстер і Страсбургер на рослин- них клітинах, Шнейдер і Флеммінг на тваринних з 1867 р. пор. дали досить детальний опис мітозу й поведінки хромосом під час цього процесу. У 1887 р. Флемінгом був описаний інший тип поділу – мейоз. Значному прогресові у гістологічних дослідженнях сприяло створення у 1886 р. К. Цейсом і Е. Аббе світлового мікроскопа, який дозволяв розг- лядати об'єкти, розміри яких були на межі теоретично можливої розділь- ної здатності світлового мікроскопа. Наприкінці ХІХ століття було закла- дено також основи методу ліофільного сушіння. ХХ століття відкрило перед цитологією та гістологією нові горизонти, запропонувавши принципово нові методи й напрямки досліджень: мікро- хірургія, темнопольна мікроскопія, рентгенівський аналіз структур, метод прижиттєвого (вітального) забарвлення. Відкриття явища радіоактивності зробило можливим появу нового методу радіоавтографії, уперше застосованого Лекассанем у 1924 р. За допо- могою методу авторадіографії стало можливо відслідковувати шлях різних речовин у процесі функціонування клітини. У цьому ж 1924 р. Фельген і Рос- сенбек запропонували метод визначення ДНК, що згодом став класичним. ХХ століття відзначається суттєвим прогресом у мікроскопічній техніці: у 1930 р. Лебедєвим було створено перший інтерференційний мікроскоп, у 1932 р. Зерніке – фазово-контрастний, на початку х років – перші електронні мікроскопи (1931 р. – Руска, 1939 р. – Сіменс). Вільямс і Віков у 1944 р. розробили метод контрастування металом і вже через рік Портер, Клод і Фуллам використали електронний мікроскоп для вивчення клітин у культурах після їхньої фіксації та забарвлення. У 1948 р. Пізу й Бейкеру вперше вдалося проаналізувати в електронному мікроскопі зрізи біологічних об'єктів. Ще через декілька років (1952) Палладе, Портером і Шестрандом було детально розроблено методи фікса- ції та виготовлення тонких зрізів. Це, зокрема, дозволило Хакслі показа- ти, що скелетний м'яз містить сітки білкових філаментів, які перекрива- ються. Таким чином було отримано докази на користь гіпотези "ковзних ниток, що пояснює принцип скорочення м'яза. У 1930-ті рр. було закладено основи й іншого методу електронної мікрос- копії – сканувальної (растрової). Кноль у 1935 р. запропонував ідею такого мікроскопа, а в 1938 р. фон Ардене створив його першу діючу модель. Фундаментальним методом кількісного аналізу складу клітини стає розроблений у 1936 р. Касперсоном метод цитофотометрії. Ух рр. удосконалюються гістохімічні методи. 1939 р. А. Шабадаш запропонував метод виявлення глікогену, а Гоморі й Така- мацу – лужної фосфатази. У 1942 р. Браше винайшов спосіб одночасно- го виявлення ДНК і РНК. 30 У 1941 р. А. Кунс уперше використав зв'язані з флуоресцентними барвниками антитіла для виявлення певних антигенів. Так з'явився метод імуноцитохімії (імуногістохімії). Цей метод дозволив вивчати вибірко- во вміст і розподіл у клітині окремих білків. У другій половині ХХ століття завдяки широкому застосуванню просвічувальних і сканувальних електронних мікроскопів було здійсне- но прорив у деяких питаннях, зокрема у вивченні біологічних мембран. Так, створення в 1953 р. ультрамікротома (Портер і Блюм) разом з вико- ристанням запропонованого Глауертом середовища для замикання – арал- диту – дозволили Робертсону в 1957 р. запропонувати першу, тришаро- ву, модель біологічної мембрани. Того ж 1957 р. Стиром винайдено метод заморожування-сколювання, який згодом був удосконалений завдяки працям Мура й Мюреталера, а в 1966 р. Брентон застосував його для вивчення внутрішньої будови біологічних мембран. У 1955–1959 рр. Холл, Бреннер і Хорн розробили метод негативного контрастування, а Сінгер уперше використав антитіла, зв'язані з ферити- ном для виявлення молекул клітини за допомогою електронного мікрос- копа. Так була започаткована електронна імуногістохімія. Дещо пізніше, у 1963 р, Сабатіні, Бенш і Барнет почали використову- вати глутаральдегід і осмієва кислота для фіксації зразків для електрон- ної мікроскопії. Значного розвитку набули методи культури тканин і клітин. Завдяки їм стало можливим вивчати функціонування окремих клітин у стандартизо- ваних умовах. У межах цього напрямку стало можливим вивчення ембрі- ональних клітин, клонування тощо. На основі цих методів виникла така галузь, як біотехнологія. У 1952 р. Номарський описав нову систему диференціального інтер- ференційного контрасту. Науковий інтерес до прижиттєвого вивчення клітин в умовах клітинної культури зумовив появу та подальший розвиток нових мікроскопічних методів. Першим з них став метод конфокальної мікроскопії, який у по- єднанні з імуногістохімічним забарвленням дозволив створювати триви- мірне зображення живої клітини. Першу робочу модель такого мікроскопа було створено в 1955 р. М. Мінскі для вивчення нервових закінчень у шкірі. Новим словом у мікроскопії стала сканувальна зондова мікроскопія, яка дала змогу досліджувати поверхню об'єкта з нечуваною до цього часу точ- ністю. Перший сканувальний зондовий (тунельний) мікроскоп – який вико- ристовує так званий "тунельний ефект", – був сконструйований у 1981 р. Г. Біннігом і Г. Роре. Наступного року Д. Пол запропонував сканувальний близькопольний мікроскоп, роздільна здатність якого досягала 50 нм. У 1989 р. було створено близькопольний акустичний мікроскоп, який мав роздільну здатність 10 нм, а через пять років (1994) – безапертурний бли- зькопольний оптичний мікроскоп, роздільна здатність якого досягла 1 нм. 31 2.2. Мікроскопічні методи дослідження клітин Світловий мікроскоп складається з оптичної та механічної систем. Оптична система мікроскопа забезпечує створення зображення об'єкта, а механічна підтримує частини оптичної системи в певному положенні. До оптичної системи належать дзеркальце, конденсор з діафрагмою та системою світлофільтрів, об'єктив, окуляр, бінокулярна насадка. Доме- ханічної системи належить основа мікроскопа, штатив, мікро- та макрог- винти, гвинт конденсора, предметний столик з препаратоводієм, револь- верна голівка (на якій кріпляться об'єктиви), тубус. Світло від його джерела (дзеркальце чи освітлювальний пристрій) йде до конденсора (риса, що збирає окремі промені в пучок на препараті. Після проходження крізь об'єкт промені світла потрапляють до системи лінз об'єктива, де формується первинне зображення. За допо- могою лінз об'єктива це зображення додатково збільшується. а 6 4 7 8 б 1 Загальне збільшення мікрос- копа знаходять як результат мно- ження збільшення об'єктива на збільшення окуляра та (якщо мік- роскоп бінокулярний) на збіль- шення бінокулярної насадки. Так, збільшення мікроскопа зоб єкти- вом ×40, окуляром ×10 і бінокуля- рною насадкою ×1,5 буде 600- кратним (40 × 10 × 1,5 = 600). За допомогою світлового мікроско- па вдається досягнути збільшення у 2000–2500 разів. Збільшення мікроскопа залежить від його роздільної здатності, тобто найменшої відстані між двома точками, які помітні роздільно. Чим менша частка, помітна в мікроскоп, тим більша його роздільна здатність. Остання усвою чергу визначається Рис. 2.6 [8]. Хід променів у світловому а) та електронному (б) мікроскопах: 1 – конденсор, 2 – препарат, 3 – об'єк- тив, 4 – окуляр, 5 – зображення, 6 – фотопластинка, 7 – джерело світла, 8 – джерело електронів апертурою об'єктива (апертура – "діючий" отвір оптичної системи, ви- значається розмірами лінз або діаф- рагмами) і довжиною хвилі світла. Роздільна здатність мікроскопа обчи- слюється за формулою d =(0,61×λ)/(n×sinα), 32 де d – роздільна здатність, λ – довжина світлової хвилі (ділянка видимої частини – 400–700 нм, n – показник заломлення середовища між препаратом і першою (фронтальною) лінзою об'єктива, α – кут між оптичною віссю об'єктива та найбільш відхиленим променем, який потрапляє на об'єктив (тобто кут дифракції променів). Величину n × sinα, яка є постій- ною для кожного об'єктива, називають числовою апертурою. Для світлової мікроскопії знаменник формули оптимізовано таким чином для світла даної довжини світлової хвилі роздільну здатність можна обчислити за наближеною формулою d ≈ λ/2. Підвищення роздільної здатності мікроскопа, що є необхідною умовою деталізації структури клітини, досягається двома шляхами. По-перше, збільшенням числової апертури об'єктива, подруге, зменшенням довжи- ни хвилі світла, яким освітлюється об'єкт. З метою збільшення числової апертури збільшують "кут зору" об'єкти- ва (яку об'єктивах з великим збільшенням) або застосовують спеціальні імерсійні об'єктиви. Простір між препаратом і фронтальною лінзою такого об'єктива заповнюють імерсійною рідиною. Як такі рідини використо- вують воду (n = 1,33), гліцерин (n = 1,45), кедрову олію (n = 1,51) у порів- нянні з n повітря, що дорівнює 1). Оскільки показник заломлення імерсій- них рідин більше 1, то числова апертура об'єктива зростає, і в нього мо- жуть потрапляти промені, які складають з оптичною віссю об'єктива бі- льший кут, ніж у тому випадку, коли між фронтальною лінзою об'єктива та препаратом міститься повітря. Інший шлях збільшення роздільної здатності мікроскопа передбачає застосування світла з меншою довжиною хвилі, ніж у променів видимого світла (фіолетове світло – близько 400 нм, зелене – близько 550 нм, че- рвоне – близько 700 нм. Обидві можливості збільшення роздільної здатності мікроскопа швид- ко вичерпуються. Так, при мікроскопуванні у променях білого світла без застосування імерсійних рідин d дорівнює 200–350 нм (або 0,2–0,35 мкм. Для порівняння, людське око має роздільну здатність 100 мкм (0,1 мм, отже, за допомогою приладу її буде збільшено в 1000 разів. Сьогодні існує багато різноманітних моделей світлових мікроскопів, які забезпечують можливість всебічного дослідження клітинних структур та їхніх функцій. Одним з різновидів світлового мікроскопа є мікроскоп порівняння, який дозволяє водному полі зору побачити два об'єкти, що містяться на двох різних предметних столиках. Його використовують для більш зручного порівняння об'єктів (наприклад, нормальні й патологічно змінені клітини), оскільки дозволяє тримати водному полі зору як дослі- джуваний, так і еталонний об'єкти. Мікроскопія в темному полі, яка ґрунтується на явищі розсіювання світла між двома середовищами, що мають різні показники заломлення |