Химия. Навчальний посібник для студентів біологічних спеціальностей вищих навчальних закладів
 Скачать 5.37 Mb.
|
|
33 світла, вимагає застосування спеціального темнопольного мікроско- па, темнопольний конденсор якого забезпечує бічне освітлення об'єкта. Клітини препарату містять дрібні структури різної оптичної щільності, і при освітленні збоку на загальному темному фоні вони починають світи- тися. Світлова пляма, яка утворюється внаслідок розсіювання світла кожною часткою, розмірами більша, ніж сама частка. Це робить доступни- ми для вивчення елементи клітини, за розмірами менші ніж 0,2 мкм, у відбитому від них світлі (ефект Тиндаля). Темнопольний мікроскоп широко застосовують при дослідженні мік- роорганізмів і клітинних культур, що дозволяє відокремити живі клітини, в яких світиться лише оболонка, від мертвих, що світяться яскраво. Крім того, він відкриває можливості для дослідження внутрішньоклітинних структур, мітохондрій і міофібрил. Фазово-контрастна мікроскопія дає можливість отримувати конт- растні зображення прозорих і незабарвлених об'єктів, які практично не- можливо побачити за допомогою стандартних методів світлового мікрос- копічного аналізу. Метод ґрунтується на тому, що окремі ділянки прозорого препарату відрізняються від оточуючого середовища за показником зало- млення. Тому, світло, яке проходить крізь них, поширюється з різною шви- дкістю, тобто відчуває зсув фаз, що й відбивається на зміні яскравості. За рахунок використання спеціальної кільцевої діафрагми конденсора й так званої фазової пластинки, у фазово-контрастному мікроскопі вда- ється досягти додаткового зсуву фази коливання світлових хвиль. Фазові зміни світлових хвиль при інтерференції перетворюються на світлові ко- ливання різної амплітуди, що й формує контрастне зображення препарату, в якому розподіл освітленості відповідає розподілу фаз. Людське ж око чутливе саме до змін інтенсивності світла (а не фазових зсувів), яке за- лежить від амплітуди світлової хвилі. Структури живої клітини з більш високим показником заломлення (хоча є зовсім прозорими) у фазово-контрастному мікроскопові вигля- дають темнішими або світлішими, ніж оточуючий фон. Застосування мікроскопа дозволило вивчити процес мітозу, будову хромосоми, вклю- чення, проаналізувати характер впливу на клітину різних хімічних спо- лук, зокрема токсинів і отрути. Інтерференційна мікроскопія певним чином подібна до фазово- контрастної. Вона також дозволяє виявляти об'єкти, здатні впливати на фазу коливань світлової хвилі. Проте в інтерференційному мікроскопі світловий промінь, що має освітлювати об'єкт, поділяється на два коге- рентні (тобто однакові за всіма фізичними характеристиками. Один про- мінь проходить повз об'єкт, а інший – крізь нього. Після цього промені зливаються, інтерферують. Якщо в об'єкті немає структур, що змінюють фазу коливань, при інтерференції виникає промінь більш інтенсивний, 34 ніж обидва вихідних. Якщо ж зсув фази відбувся, то промені взаємно га- сяться й об'єкт виглядає темнішим. Поляризаційна мікроскопія дозволяє виявляти об'єкти, які здатні повер- тати площину поляризації світлового променя (ці, так звані, анізотропні об'єк- ти мають властивості, що залежать від вибраного напрямку). Кожна світлова хвиля, крім таких характеристик, як амплітуда коливань, довжина хвилі, фаза, має щей певну площину, в якій ці коливання відбуваються (рис. 2.7). У світлі, джерелом якого є сонце або настільна лампа, кожен квант світла має свою площу поляризації. Таке світло називається неполяризованим. ХО λ а О Х t Δ φ б О УХ в Рис. 2.7. Основні характеристики світлової хвилі: а – хвиля з амплітудою Ай довжиною світлової хвилі λ; б – дві хвилі з однаковою амплітудою і довжиною хвилі, фази яких різняться на Δφ; в – дві хвилі (1 і 2) з однаковою амплітудою та довжиною хвилі, коливання якої відбуваються в різних площинах 35 Деякі речовини (наприклад, ісландський шпат) здатні вибірково про- пускати через себе кванти лише з визначеною площиною поляризації, а решту гасити. За таким принципом працюють поляризатор і аналізатор поляризаційного мікроскопа. Поляризатор міститься на шляху світла до об'єкта. Отже, об'єкт освітлюється поляризованим світлом, яке має одну єдину площину поляризації. Аналізатор розташований за об'єктомі до- зволяє проходити крізь себе лише такому світлу, площа поляризації яко- го перпендикулярна площі поляризації світла, яке пройшло крізь поляризатор. Таким чином, якщо досліджуваний об'єкт є ізотропним (об'єк- том з властивостями, що не залежать від вибраного напрямку), а отже, нездатним змінити площину поляризації світла, то світлові промені крізь аналізатор не пройдуть, а поле зору буде темним. Якщо ж на препараті є анізотропні структури, то ситуація стає дещо іншою. У цьому випадку світло розділяється на два промені. Перший (звичайний) не зазнає змін і зберігає площу поляризації. Другий промінь має ті самі характеристики, що й звичайний, за винятком площини поляризації, яка в нього змінена на перпендикулярну. Саме такий "незвичайний" промінь, "повернутий навколо своєї осі", зможе пройти крізь аналізатор. Тому анізотропні об'є- кти будуть виглядати в поляризаційному мікроскопі світлими. Усі перераховані види мікроскопії розширювали наші можливості при дослідженні об'єктів мікросвіту, проте залишали нездоланним єдиний рубіж – роздільну здатність мікроскопа. Як було зазначено, роздільна здатність світлового мікроскопа приблиз- но дорівнює половині світлової хвилі. Отже, якщо взяти світло з меншою, ніж звичайно, довжиною хвилі (ультрафіолетове світло, наприклад), то роздільну здатність можна було б значно зменшити. Однак людське око не здатне бачити ультрафіолетове випромінювання. Тому в ультрафіолето- вому мікроскопі зображення виводять на фотоплівку або на люмінесцен- тний екран, на якому око вже зможе побачити зображення. Особливим типом мікроскопії є люмінесцентна. У люмінесцентному мік- роскопі об'єкт також освітлюється ультрафіолетовим світлом. Проте в даному типі мікроскопа нас цікавлять структури, здатні до люмінесценції – випроміню- вання під дією ультрафіолету променів з більшою довжиною світла. Так, хло- рофіл у хлоропластах під дією ультрафіолету світиться червоним світлом. Поворотним пунктом у мікроскопічній техніці стало створення елект- ронного мікроскопа. Його загальний план будови досить схожий з планом будови звичайного світлового або ультрафіолетового мікроскопів. Тільки замість світлових променів у цьому мікроскопі використовується потік електронів, який випромінюється з електронної гармати. Між катодом і анодом електронної гармати створюється напруга 50–150 кВ, яка розганяє електрони до великої швидкості. При цьому електрони мають дуже малу довжину хвилі, тому електронний мікроскоп практично вирі- шує проблему роздільної здатності при вивченні біологічних об'єктів, 36 оскільки в ньому можна побачити навіть окремі атоми, а не тільки моле- кули. Роздільна здатність сучасного електронного мікроскопа досягає 0,1 нм. Проте тут постають кілька інших проблем. Так, електрони дуже дрібні, атому навіть молекули в повітрі здатні неконтрольовано відхиля- ти напрямок їхнього руху. Отже, з корпусу електронного мікроскопа треба відкачати повітря. У звичайному мікроскопі промені світла фокусують скляні лінзи, але тут їх також не можна застосувати, оскільки склоне просто відхилить електрони, а взагалі не пропустить їх далі. Тому замість скляних конденсора, об'єктива та окуляра в електронному мікроскопі ви- користовують потужні електромагніти. Звичайно, жодна людина ще не бачила електрон на власні очі, тому зображення в електронному мікроскопі створюється на люмінесцентному екрані чи фотоплівці. Така фотографія, зроблена на електронному мікро- скопі, називається електронограмою. Електронограми зазвичай чорно- білі, тобто об'єкти на них різняться лише за ступенем яскравості, який залежить від того, наскільки проникні для електронів ті чи інші об'єкти. Але іноді ділянки з однаковим ступенем освітленості забарвлюють яки- мось кольором, ділянки з іншим ступенем освітленості – в інший і т. д. У результаті утворюється електронограма із "симульованими кольорами". Описаний тип електронного мікроскопа називається просвічуваль- ним, або трансмісійним. Він дозволяє розглянути досить тонкі препара- ти (до 0,1 мкм. Товстіший препарат просто не пропустить потік електро- нів. Проте часто досліднику необхідно встановити тривимірну будову клітини. Для розв'язання цієї проблеми застосовують різні підходи. Один з них полягає у створенні тривимірної реконструкції на основі серійних зрізів. Порівнюючи зображення органел або ядра на сусідніх зрізах, мож- на скласти уяву про тривимірну будову тих чи інших структур. Інший підхід – застосування високовольтного електронного мікро- скопа. Використання вищої напруги (1–3 млн вольтів) дозволяє розігнати електрони до більшої швидкості, а отже, вони зможуть "проскочити" через більш товстий шар препарату, який можна буде розглядати на різних рівнях, безпосередньо створюючи уявлення про тривимірну будову дос- ліджуваних структур. Роздільна здатність високовольтного електронного мікроскопа становить близько 0,5 нм. Для вивчення поверхонь біологічних об'єктів, зокрема тривимірної будови сколів клітин, застосовують сканувальну (або растрову) електронну мік- роскопію. При цьому методі пучок електронів біжить уздовж поверхні дослі- джуваного об'єкта й відбивається від нього в різні боки. Спеціальні детектори фіксують напрямок, в якому відбивається потік електронів, і на основі цього й створюється тривимірна реконструкція поверхні досліджуваного об'єкта. Надзвичайно важливим методом, який дозволяє вивчати дуже дрібні об'єкти й водночас створювати тривимірні реконструкції живих клітин є конфокальна мікроскопія. Ця методика полягає в тім, що за об'єкти- 37 вом установлюють діафрагму, що звичайно зменшує поле зору практично до точки, проте дозволяє підвищити роздільну здатність і контраст. Додатково світло також фокусують на тій саме точці препарату (рис. 2.8). а б в г Рис. 2.8. Принцип роботи конфокального мікроскопа: а – хід променів у звичайному світловому мікроскопі, коли у фотоприймальний пристрій потрапляє світло з різних точок зразка; б – застосування діафрагми дозволяє істотно знизити фонове підсвічування від точок зразка поза аналізо- ваною ділянкою; в – додаткове підвищення контрасту досягається застосуванням підсвічування, що фокусує світло в аналізовану точку г – схема зі світлоділильною пластинкою спрощує конструкцію мікроскопа за рахунок подвійного використання об'єктива (для підсвічування і збирання відбитого сигналу. 38 Зображення створюється шляхом сканування препарату, тобто об'єкт досліджується точка заточкою. Сканувати можна не лише одну площину, а декілька, одну за одною. Потім на екрані комп'ютера можна відтворити об'ємне зображення досліджуваного об'єкта. Як правило, конфокальний принцип поєднують з використанням флюоресценції. Використовують також не звичайне світло, а лазер. Су- часні конфокальні мікроскопи за роздільною здатністю порівнянні з ульт- рафіолетовими й електронними мікроскопами, проте на відміну від останніх дозволяють досліджувати живі об'єкти. 2.3. Методи підготовки матеріалу для цитологічних досліджень і методи дослідження клітини Кожен з методів, який використовують в експериментальній цитології, має свої переваги й недоліки й характерну для кожного окремого методу сферу застосування. Порівняння результатів, отриманих з використанням різних методів, дає можливість різнобічної характеристики досліджуваного об'єкта. Розрізняють методи досліджень прижиттєві (вітальні) і фіксованого матеріалу. Прижиттєві методи досліджень. Головною проблемою, з якою сти- кається дослідник при вивченні живих об'єктів є низький показник залом- лення світла вмістом живої клітини. Тому для спостереження за живими об'єктами застосовують методи темного поля, фазового контрасту, по- ляризаційну, флуоресцентну й конфокальну мікроскопію. Також для ви- ділення окремих структур спеціально для прижиттєвих досліджень викори- стовують барвники з якомога меншою токсичністю (вітальні барвники), які беруть у мінімальних концентраціях. Це янус зелений, нейтральний червоний, метиленовий синій тощо. Для вивчення живих об'єктів, яким не властива власна флюоресценція, у люмінесцентному мікроскопі засто- совують флуоресцентні барвники – флюорохроми. Часто виникає необхідність втручання дослідника у процеси, що від- буваються в живій клітині. Для цього застосовують мікрургію (мікрохіру- ргію). За допомогою спеціальних приладів (мікроманіпуляторів) та ін- струментарію (скляних голок, піпеток, петель, електродів тощо) можна видаляти й пересаджувати з клітини в клітину ядра, окремі органели, визначати прижиттєву кислотність внутрішньоклітинних структур, вимі- рювати різницю потенціалів та ін. Метод культури тканин і клітин є особливим методом дослідження живих об'єктів. При цьому окремі клітини або невеликі ділянки органів 39 вміщують у спеціальне поживне середовище, сприятливе для життєдія- льності та розмноження клітин. Таким способом можна простежити весь життєвий цикл клітин, вивчати їх стійкість до окремих факторів зовніш- нього середовища або вплив тих чи інших біологічно активних речовин безпосередньо на ті чи інші клітини. Подібні дослідження (in vitro) дозво- ляють зробити висновки саме про безпосередню взаємодію клітини і зо- внішнього чинника. Проте в організмі впливи різноманітні та, як правило, опосередковані, тому не можна результати досліджень у клітинних культурах механічно переносити на живий організм. У цьому разі потрібні досліди in vivo, тобто в живому об'єкті. Метод авторадіографії застосовують для вивчення шляхів руху та пе- ретворення речовин у клітині. Ним можна послуговуватися для досліджен- ня як клітин у культурі, так і фіксованого матеріалу. Для вивчення клітин цим способом у поживне середовище, культуру клітин (в їжу або в кров досліджуваного об'єкта) уводять речовину – попередник молекули, топо- графію біосинтезу якої потрібно вивчити. При цьому ця речовина повинна мати у своєму складі радіоактивний ізотоп (наприклад, ізотоп водню – три- тій), що поступово розпадається. Місця розпаду ізотопу виявляються за- вдяки фотоемульсії, яка наноситься на препарат чи поверхню досліджува- них клітин по закінченні терміну експерименту. Варіюючи час, який мічений радіоактивним ізотопом попередник перебуває в організмі або клітині, мо- жна встановити шляхи його руху по клітині чи органам тіла тощо. Методи роботи з фіксованим матеріалом є також поширеними. Інколи (наприклад, якщо працюють з електронним мікроскопом) попере- дня обробка матеріалу та умови мікроскопування повністю виключають можливість дослідження живої клітини. У цьому випадку найважливішим виявляється вдала фіксація клітинного матеріалу, тобто така зупинка життєдіяльності клітини, за якої всі складові клітини залишалися б у міс- цях прижиттєвої локалізації в незміненому стані. Розрізняють фізичні й хімічні методи фіксації. До фізичних методів відносять заморожування та фіксацію нагріванням або сушінням. Так, для приготування препарату для сканувального електронного мікроскопа застосовують метод заморожування-сколювання. Спочатку матеріал за- морожують у рідкому азоті, що виключає утворення кристалів льоду, які можуть пошкодити матеріал. Потім заморожені клітини розколюють хо- лодним ножем. Сколи при цьому, як правило, ідуть по середині біліпідно- го шару мембран. Потім матеріал нагрівають у вакуумі, у результаті час- тина льоду сублімується (переходить одразу в газоподібний стан. Унас- лідок цього процесу поверхня сколу стає більш рельєфною. Потім на неї наноситься тонка плівка важкого металу (золота, платини тощо), яка точно повторює рельєф поверхні об'єкта. Потім власне клітина руйнується кислотою (цей процес називають травленням) і об'єктом мікроскопічного дослідження стає саме плівка з важкого металу – репліка. 40 Хімічні методи фіксації – це введення у клітину тієї чи іншої речови- ни або суміші, яка припиняє процеси життєдіяльності в клітині, водночас зупиняючи в ній усі процеси, зокрема процеси аутолітичного руйнування клітини. Різні фіксатори мають різні механізми дії. Деякі (спирти) осаджу- ють (денатурують) білки, для інших (альдегіди) властиво утворення мо- лекулярних містків, що ковалентно зв'язують органічні молекули, обме- жуючи їхню рухливість. Розрізняють прості та складні фіксатори. Прості – це розчини якоїсь однієї сполуки, наприклад, й етиловий спирт або метанол, формалін (розчин формальдегіду у воді), розчин глутарового альдегіду тощо. Скла- дні фіксатори (фіксуючі суміші) містять декілька речовин, що забезпечують більш швидку (попередню) і більш надійну, але повільнішу фіксацію. Прикладами складних фіксаторів є суміші Буену (формалін-пікринова кислота – оцтова кислота, Карнуа (етанол – хлороформ – оцтова кислота, Нікіфо- рова (етанол – діетиловий ефір), спиртово-оцтова кислота тощо. Для досягнення якісної фіксації необхідно, щоб фіксатор якомога швидше досяг глибинних шарів фіксованого матеріалу, перш ніж прижит- тєвий стан структур буде порушений унаслідок аутолітичних процесів, що проходять усередині загиблої клітини. Для цього об'єм фіксуючого розчину повинен перевищувати об'єм фіксованого матеріалу у 20–100 разів. Сам матеріал має бути зафіксований якомога швидше після взяття (біопсії чи забиття піддослідної тварини). З останньою вимогою пов'язані й обмежен- ня, які накладаються на розмір фіксованого об'єкта: його діаметр має бути не більше 1–3 мм. Збільшення розміру об'єкта призводить до збільшення часу проникнення фіксатора у глибинні його шари, а це може призвести до погіршення якості матеріалу внаслідок аутолітичних процесів. Та якщо необхідно уявити цілісну картину в органі чи у великій ділянці тканини, то застосовують розділення органу на зрізи товщиною в декіль- ка міліметрів, що полегшує проникання фіксатора всередину об'єкта, або застосовують метод перфузії (уведення фіксуючого розчину через кро- воносну систему органу чи цілісного організму). В останньому випадку спочатку кровоносні судини промивають фізіологічним розчином, а потім заповнюють фіксуючою рідиною. Швидкість і якість фіксації під час пер- фузії робить цей метод досить популярним. |