Химия. Навчальний посібник для студентів біологічних спеціальностей вищих навчальних закладів
 Скачать 5.37 Mb.
|
|
Приготування зрізів клітин. Для якісного мікроскопування необхідно приготувати зрізи досліджуваної тканини, оскільки товстий шар тканини є просто непроникним для світла, а тим більше для електронів. Але біоло- гічний матеріал досить м'який, що ускладнює приготування надто тонких зрізів. У такому разі працюють зі спеціальними приладами – мікротомами. Вібротом – прилад, за допомогою якого можна отримувати зрізи з мате- ріалу, що не зазнав додаткової обробки (з нефіксованого матеріалу). Він дозволяє робити зрізи навіть із живого матеріалу товщиною близько 20 –50 мкм. Заморожувальні мікротоми (кріотоми) здатні зменшити тов 41 щину зрізу до 10–15 мкм. У цих мікротомах об'єкт заморожується до тем- ператури близько –20 С. Відомо, що приморожені об'єкти можна різати на більш тонкі шари (навіть морожене мясо ріжеться на тонкіші шматки). Для отримання найтонших зрізів (1–7 мкм і менше) застосовують заливку у пластичні середовища: целоїдин, парафін, парапласт і епоксидні смоли (епон, аралдит тощо). Целоїдинову, парафінову та парапластну заливку використовують, як правило, для світлової, а епоксидну – для електрон- ної трансмісійної мікроскопії. Найпоширенішою є заливка в парафін. При парафіновій заливці пев- ну проблему становить те, що парафін – це гідрофобна речовина, а бі- льшість фіксаторів є гідрофільними. Тому в цьому випадку матеріал про- водять через ряд середовищ, які здатні розчинятися одне водному, і в такий спосіб доводять матеріал до парафіну. Так, фіксований матеріал проводять через спирти, концентрація яких зростає, потім уміщують в органічний розчинник (ксилол, бензол, хлороформ тощо). Потім мате- ріал занурюють у суміш органічного розчинника з парафіном (так звана "гістологічна каша) і, нарешті, у чистий парафін або парапласт. Залитий після цього в парафіновий або парапластний блок матеріал рі- жуть на санному або роторному мікротомі. Ці два типи мікротомів різняться за розташуванням мікротомного ножа й препарату. У роторному мікротомі ніж закріплений нерухомо, а рухається об'єкт. У санному мікротомі об'єкт подається на 3–7 мкм за один прохід угору, а рухається й робить зріз ніж. Мікротомний ніж заточують так, щоб уникнути будь-яких нерівностей ріжучої кромки. Тільки її ідеально рівна поверхня забезпечує рівномірну товщину зрізу. Закріплюється ніж під кутом 10–15º до поверхні об'єкта. Зрізи для електронної мікроскопії заливають в епоксидні смоли й рі- жуть на ультрамікротомі, що дає можливість отримати зрізи товщиною в частки мікрометра. Якість зрізів у цьому разі контролюється під мікрос- копом, а ніж для ультрамікротома роблять зі скла або алмазу. Забарвлення зрізів клітин. Для виявлення певних структур отримані на мікротомі зрізи забарвлюють. Розрізняють оглядові, що дають можли- вість роздивитись загальну будову об'єкта, і спеціальні методи забарв- лення, за допомогою яких можна побачити окремі елементи й деталі бу- дови клітини. Для прижиттєвих досліджень клітин використовують віта- льні барвники (див. вище). Зрізи для електронної мікроскопії забарвлю- ються одразу під час фіксації. Матеріал у цьому випадку фіксують глута- ровим альдегідом і осмієвою кислотою. Остання саме й зв'язується зі структурами в клітині, роблячи їх непрозорими для потоку електронів. За фізико-хімічними властивостями барвники поділяють на гідрофобні (неполярні) і гідрофільні (полярні). Неполярні барвники розчиняються в ліпідах і забарвлюють їх. До цієї групи належать судан чорний, судан Ж тощо. Гідрофільні барвники поділяють на кислотні, основні та нейтральні. Кислотні забарвлюють основні (еозинофільні або оксифільні) структури 42 в клітині, а основні з'єднуються з базофільними (кислими) структурами. Так, основний барвник гематоксилін забарвлює нуклеїнові кислоти в ядрі, а кислотний барвник еозин – основні білки цитоплазми. Нейтральні барв- ники здатні забарвлювати як кислі, так і основні структури (наприклад, барвник Май-Грюнвальда). Розрізняють також прогресивне й регресивне забарвлення. Припер- шому препарат поступово зв'язує барвник, доки забарвлення не досягає оптимуму. Під час другого забарвлення препарат, який має "підвищену спорідненість" з барвником, одразу перефарбовує його, після чого над- лишок барвника відмивають, доки забарвлення не досягне оптимуму. Після забарвлення постійні препарати замикають у спеціальне сере- довище. Для цього використовують канадський або піхтовий бальзам (витяжки з кедрового або піхтового дерева, синтетичне середовище DPX тощо. При цьому, якщо середовище не є водорозчинним, то після забарвлення (наприклад, гематоксиліном і еозином) препарат необхідно зневоднити. Для цього його проводять через спирти зростаючої концент- рації, органічний розчинник і замикають у вибране середовище (напри- клад, канадський бальзам. Цитохімічні методи дослідження. Для вивчення хімічного складу клітин і розташування певних класів хімічних речовин у клітині застосо- вують цитохімічні методи. В основі їх лежать методи аналітичної хімії, якими послуговуються для аналізу складу розчинів, але адаптовані під конкретні умови приготування цитологічного препарату. Тобто на препа- раті ставлять певну хімічну реакцію, за результатами якої роблять ви- сновок про наявність або відсутність певного класу речовин у складі клі- тини. При цьому цитохімічні реакції є чутливішими, ніж відповідні реакції аналітичної хімії, оскільки результат реакції оцінюється не на око, а під мікроскопом, а отже, можна побачити найдрібніші часточки продукту реа- кції. Так, для реакції берлінської блакиті, завдяки якій можна виявити іони заліза, відповідна цитохімічна реакція є в 10000 разів чутливішою, ніж при проведенні цієї реакції в пробірці. Нині відомо й широко застосовуються багато цитохімічних реакцій: нін- гідринова (для виявлення білків), ШІК-реакція на вуглеводи, реакція Фельгена на виявлення ДНК тощо. Важливим класом гістохімічних реак- цій є реакції на виявлення ферментів. У цьому випадку на препарат на- носять розчин субстрату реакції, яку каталізує фермента потім цитохімі- чно виявляють продукт реакції. За розташуванням нерозчинного продукту реакції визначають локалізацію досліджуваного ферменту. Таким чином виявляють кислу й лужну фосфатазу, пероксидазу та інші ферменти. Імуногістохімічні методи. Для виявлення певного типу молекул іс- нують методи імуногістохімії. Ці методи дозволяють вибірково визначати локалізацію певних молекул, навіть за умови їхньої високої подібності до інших (наприклад, пролактину людини та пролактину птаха. Однак ви- 43 значенню піддаються лише складні органічні речовини, які при введенні в організм тварини здатні викликати специфічну імунну відповідь, а саме утворення антитіл. Імуногістохімічні методи засновані на використанні саме антитіл – складних білкових молекул, які виробляються спеціалі- зованими клітинами і здатні зв'язувати молекули, котрі індукували їхнє утворення – антигени. Специфічність зв'язування антитіл з антигенами є надзвичайно високою, що й використовується в імуногістохімії. Саме утворення комплексу антиген–антитіло є ключовим у будь-якому імуногістохімічному методі. Зв'язані ж антитіла виявляють по-різному. Мож- на помітити антитіла флуорохромом і побачити йогов люмінесцентному мікроскопі, можна – радіоактивною міткою, яку виявлятимуть так само, як і при авторадіографії, можна – ферментом, який буде установлено гістохіміч- но. Для підвищення чутливості методу застосовують метод подвійних анти- тіл, коли до антитіл І порядку, що безпосередньо зв'язують досліджуваний білок, приєднуються так звані вторинні антитіла ("антитіла, що виявляють антитіла"), які вже й мають бути знайдені одним із зазначених вище методів. Методи кількісної оцінки. Для встановлення функціонального стану клітини іноді недостатньо лише визначити якісний склад цитоплазми, білків ядра тощо. Надзвичайно важливим є з'ясувати скільки досліджува- ної речовини міститься в клітині. Суху масу речовини дозволяє визначи- ти метод інтерференційної мікроскопії. Існує можливість кількісної оцінки результатів авторадіографії. Проте надзвичайно важливим методом кі- лькісної оцінки результатів цитохімічних та імуногістохімічних реакцій є цитофотометрія. Метод заснований на здатності забарвлених проду- ктів реакції поглинати світло заданої довжини хвилі. Зрозуміло, що для адекватної оцінки результатів усі препарати повинні мати однакову тов- щину, крім того, має бути стандартизована сама процедура забарвлення. Цитофотометрично може бути визначена й кількість незабарвлених про- дуктів, наприклад нуклеїнових кислот, що здатні поглинати ультрафіоле- тове світло, а також здатних до флюоресценції речовин. Метод диференційного центрифугування. Різниця в щільності та пи- томій вазі частин клітини використовується для відокремлення однакових органел з певної суміші клітин. Для цього клітини спочатку гомогенізують, а потім отриманий гомогенат центрифугують при різних швидкостях обер- тання центрифуги. Спочатку (при найменших швидкостях) осідають агрегати з кількох клітин, потім – цілі клітини. Далі – ядра і мітохондрії, потім – грану- лярна ЕПС, після неї – гладенька ЕПС, апарат Гольджі, лізосоми (так звана мікросомальна фракція). Останніми (при найбільших обертах) осідають ве- ликі макромолекулярні комплекси (рибосоми тощо). Після кожного циклу обертання осад відбирають і далі центрифугують лише надосадову рідину. Модифікацією описаного методу є центрифугування у градієнті щільно- сті. У цьому випадку в центрифужну пробірку наносять шари сахарози або іншого гель-утворювального агента з різною щільністю (від найбільш до 44 найменш щільного). Після однократного центрифугування описані фракції опускаються у пробірці на різну глибину, що дає змогу одразу їх розділити. Використання фото, кіно- й відеотехніки та комп'ютерних техно- логій. Фото, кіно- й відеотехніку застосовують у цитології в першу чергу для фіксації отриманого зображення. У деяких випадках (наприклад, при ультрафіолетовій і електронній мікроскопії) це є чине єдиний метод уза- галі отримати зображення досліджуваного об'єкта. При вивченні живих об'єктів підвищується роль кіно- та відеотехніки, за допомогою якої фік- сують рух живих клітин, процеси поділу тощо. Особливо важливою в цьому разі є сповільнена кінозйомка, яка дає можливість потім побачи- ти рух клітин у прискореному темпі. Цифрова обробка зображення підвищує якість зображення і навіть дозволяє виявити структури, які на оригінальних фотографіях вигляда- ють малоконтрастними, розмитими. Оцифровані зображення використо- вуються також для морфометричних вимірювань (площі, периметра, діа- метра досліджуваних структур. ЗАПИТАННЯ ДЛЯ САМОПЕРЕВІРКИ 1. Назвіть особливості розвитку цитології в кінці ХІХ століття. 2. З якими методами досліджень пов'язаний бурхливий розвиток ци- тології та гістології у ХХ століття? 3. Які етапи можна виділити в історії вивчення клітин? 4. Внесок у розвиток цитології Т. Шванна. 5. Внесок у розвиток цитології М. Шлейдена. 6. Внесок у розвиток цитології Р. Вірхова. 7. Внесок у розвиток цитології Р. Броуна. 8. Внесок у розвиток цитології Р. Гука. 9. Внесок у розвиток цитології А. Левенгука. 10. Походження поняття "клітина". 11. Коли були описані основні органели клітини? 12. Назвіть елементи оптичної частини мікроскопа. Яке їхнє призначення? 13. Хід променів у світловому мікроскопі. 14. Яка різниця між роздільною здатністю та кратністю збільшення мікроскопа? 15. Чому не є доцільним створення світлового мікроскопа з дуже великою кратністю збільшення (наприклад, близько х 16. Що таке вітальні барвники? Які ви знаєте вітальні барвники? 17. Перерахуйте основні етапи приготування постійного препарату 18. Як зафіксувати матеріал для цитологічних досліджень? 19. Що таке фіксація? Які речовини можуть застосовуватися як фіксатори? 20. Які типи мікротомів вам відомі? З якою метою їх використовують? 45 21. Що таке кріотом? З якою метою його застосовують? 22. Що таке ультрамікротом? Для чого його застосовують? 23. Як отримати зрізи тканин для світлової мікроскопії, не заливаючи ці тканини в парафін або інші пластичні речовини? 24. Чим відрізняється процес виготовлення препаратів для світлової та електронної трансмісійної мікроскопії? 25. Які структури в клітині називаються базофільними й оксифільними? 26. До якої групи барвників відносять гематоксилін і еозин? Які структу- ри в клітині вони забарвлюють? 27. Які існують методи забарвлення клітин? 28. Порівняйте методи цитохімії та імуноцитохімії. 29. Клітини відрізняються одна від одної різним складом білків (антиге- нів). Якими методами можна визначити ці відмінності? 30. Які кількісні методи визначення речовин у клітині вам відомі? 31. Назвіть методи одержання ізольованих органел. 32. Для чого застосовують мікрохірургію? 33. З якою метою послуговуються кіно-, фото- та відеотехнікою в цито- логічних дослідженнях. 34. Які методи прижиттєвого дослідження клітин вам відомі? 35. До складу клітин входять різні органічні речовини. Якими відомими вам методами можна виявити їхній якісний склад 36. До складу клітин входять різні органічні речовини. Якими відомими вам методами можна виявити їхній кількісний склад 37. Необхідно дослідити структури, розміри яких менше ніж 0,2 мкм, але більше ніж 0,1 мкм. Який метод світлової мікроскопії можна викорис- тати для дослідження? 38. Які методи світлової мікроскопії дозволяють побачити структури, дещо менші за роздільну здатність звичайного світлового мікроскопа? 39. Перед дослідником поставлено завдання – виявити структури, що містять ДНК і РНК. Які методи він повинен використати? Якими методами можна визначити кількість цих речовин? 40. Яким мікроскопом слід користуватися, щоб вивчити структуру клі- тинної мембрани товщиною 7–10 нм Чому? 41. Охарактеризуйте можливості сканувальної електронної мікроскопії при дослідженні клітини. 42. Деякі речовини в клітині мають здатність флуоресціювати під дією ультрафіолетових променів. Який мікроскоп можна використати для їхніх досліджень? Чи можливе кількісне дослідження? Що можна зробити, як- що у самоїа речовини відсутня первинна люмінесценція? 43. За допомогою якого методу можна визначити шляхи транспорту речовин у клітині? Відповідь обґрунтуйте. 46 44. Відомо, що до складу нуклеїнових кислот входять азотисті основи. Які азотисті основи слід позначити для вибіркового виявлення у клітині ДНК і РНК за методом авторадіографії. 45. Принцип дії поляризаційного мікроскопа. 46. Чи впливає на роздільну здатність мікроскопа метод фазового контрасту Відповідь поясніть. 47. Чи впливає на роздільну здатність мікроскопа метод ультрафіоле- тової мікроскопії? Відповідь поясніть. 48. Що дозволяє визначити цитофотометрія? Принцип методу. 49. Що таке числова апертура мікроскопа? 50. Які імерсійні рідини ви знаєте? Для чого вони використовуються? 51. Як розрахувати роздільну здатність мікроскопа? 52. Для чого використовують мікроскоп порівняння? 53. Дайте характеристику фазово-контрастній мікроскопії. 54. Дайте характеристику конфокальній мікроскопії. 47 Розділ 3 СТРУКТУРА Й ФУНКЦІЇ БІОЛОГІЧНИХ МЕМБРАН Мембранні системи клітини тривалий час залишалися невідомими. Більш того, навіть після їхнього відкриття принципи структурно- функціональної організації цих систем викликали дискусії у багатьох до- слідників. Уперше ідею про існування специфічної перетинки, яка оточує кожну клітину, висунув у середині ХІХ століття К. Бернар. Вивчаючи про- никнення барвників у клітини, у 1855 р. К. Негеллі також прийшов до ви- сновку, що зовнішня частина протоплазми має бути вкрита особливою оболонкою, що відіграє роль бар'єра проникності. Три десятиліття потому, повторюючи досліди К. Негеллі, В. Пфеффер показав, що ступінь набухання клітини залежить від концентрації оточуючого розчину. Урна основі досліджень К. Бернара, К. Негеллі, В. Пфеффер сформулював поняття клітинної, або плазматичної мембрани як утво- рення, що регулює надходження у клітину й вихід з неї різних речовин. Перші дослідження хімічного складу та молекулярної організації пов'яза- ні з іменем Е. Овертона, який у 1902 р, вивчаючи закономірності проник- нення у клітину різних за природою речовин і виявивши, що найшвидше надходять ліпорозчинні речовини, припустив, що мембрана повністю або частково складається з ліпідів. Ух рр. ХХ століття Е. Гортер і Ф. Грендел висунули припущення, що плазматична мембрана склада- ється з подвійного шару ліпідів, який має бути пов'язаний з білками. Урна основі проведеного аналізу поверхневого натягнення на ме- жі поділу ліпідів з іншими речовинами, Л. Даніеллі й Г. Даусон висунули гіпотезу стосовно будови біологічних мембран, за якою останні склада- ються з подвійного ліпідного бішару, вкритого із зовнішнього та внутріш- нього боків моношарами білків (так звана унітарна модель будови мем- брани. Ґрунтуючись на ній, у 60-ті роки Дж. Робертсон стверджував, що всі мембрани є однаковими і побудованими саме за таким принципом. Протягом досить тривалого часу ця думка лишалась непохитною, але й вона не встояла під тиском нових наукових доказів. Пошук спільних зако- номірностей і відмінностей в організації "родинних" мембран привів до ро- зуміння того, що мембрани різних клітин і органел різняться за хімічним складом і за функціями, чому відповідає і певна структура мембрани. Крім того, було доведено, що припущення, висунуте свого часу В. Освальдом, про те, що плазматична мембрана клітин завдяки своїм властивостям на- півпроникності є тією структурою, яка генерує різницю потенціалів – вірне. 48 Нині найприйнятнішою є рідинно-мозаїчна модель структури мембра- ни, висунута С. Сенгером і Дж. Нікольсоном у 1972 р. й удосконалена С. Сенгером у 1981 р. За цією моделлю певна частина ліпідів, що входить до складу плазматичної мембрани (близько 30 %) повязана з внут- рішніми білками, а інші перебувають у рідкому стані, формуючи "ліпідне озеро, в якому "вільно плавають" внутрішні білки (рис. 3.1). Ліпідний бішар Молекула білку Ліпідний бішар Молекула білка |