ГФ11-1. Общие методы анализа редакционная коллегия государственной фармакопеи ссср
 Скачать 1.83 Mb.
|
|
Испытуемый препарат может отличаться от стандартного как по наклону прямой (т.е. по значению коэффициента Ь), так и по ее положению (т.е. по значению постоянной у0). Если имеются основания предполагать, что наклоны обеих прямых одинаковы (Ь = Ь0) и, следовательно, различие между препаратами обусловлено лишь различными значениями параметра у0, то для установления эквивалентных доз достаточно определить активность одного из препаратов при двух различных дозах, а другого - при одной дозе. Разумеется, активность для каждой дозы должна определяться из нескольких измерений, так что речь идет здесь о средних активностях. Во всех случаях предполагается, что для каждой дозы использовано одно и то же число n тест - объектов и что все распределения случайных вариаций нормальны с дисперсией, не зависящей от самих активностей. Если нет достаточных оснований предполагать, что Ь = Ь0, то следует произвести для каждого препарата испытания по крайней мере 0 0 при двух дозах: D1, D2 и D1, D2; удобнее выбрать эти дозы так, 0 0 чтобы D2 / D1 = D2 / D1. Вообще же результаты испытания получаются тем точнее, чем больше доз использовано. Поэтому, помимо упомянутых выше испытаний, т. е. испытаний типов 1; 2 (или 2; 1) и 2; 2, в фармакопее предусматриваются также испытания других типов (см. табл. IV, приложения). По результатам испытаний вычисляют прежде всего средние эффекты при каждой из доз - отдельно для стандартного и испытуемого препаратов. Затем находят значения. _ "ФИ" = SUM "е "у / "z ", (II.3.1) ФИ ФИ где "ФИ" - общее обозначение для функций Е, F, G, Н (см. табл. IV, _ приложения), а через у обозначена вся совокупность средних _0 _0 _0 _0 _ _ _ значений у1, у2, у3, у4, у1, у2, у3, у4; множители "е ", и ФИ знаменатели "z " берутся из табл. IV приложения. Полученные ФИ величины характеризуют: Е - различие между эффектами вследствие различия доз; F - различие между эффектами вследствие различия между препаратами; G - параллельность дозовых зависимостей испытуемого и стандартного препарата; Н - линейность этих дозовых зависимостей. Для испытаний типов 2; 1,3; 1, 3; 2 и 4; 3 надо 0 _ переставить местами коэффициенты "е " для у и у, причем для F и ФИ G с изменением всех знаков на обратные, а для Е и Н - без изменения знаков; значения "z " и дисперсий остаются без ФИ _0 изменения. Значения Н должны вычисляться отдельно для набора у и _ отдельно для набора у, т.е. линейность дозовой зависимости проверяется отдельно для стандартного и отдельно для испытуемого препаратов. По результатам испытания вычисляется также величина: ┌ n _ 2 ┐ SUM │ SUM (у - у ) │ i └ j=1 ij i ┘ V = ----------------------- , (II.3.2) 0 (r + r)n(n - 1) _ где у - индивидуальные эффекты при i-й дозе, у , - средний ij 0 i эффект при этой дозе; r , r - соответственно число доз для стандартного и испытуемого препаратов; n - число испытаний при каждой дозе (оно должно быть одинаковым при всех дозах; нарушения этого исправляются так, как было описано в параграфе II.1). После этого по формулам в последнем столбце табл. IV приложения вычисляют величины А, В, V и V , необходимые для построения G H доверительных интервалов и проверки значимостей [при этом используется табличное значение t для числа степеней свободы f = 0 Р (r + r)(n - 1); I - разность логарифмов соседних доз]. Прежде всего проверяют (где это допускается числом использованных доз) линейность дозовых зависимостей и их параллельность, вычисляя H t = --------- ; (II.3.3) ---- / V \/ H G t = --------- . (II.3.4) ---- / V \/ G Полученные значения должны быть меньше t(95%, Р). Если нарушения линейности и параллельности дозовых зависимостей не обнаружено, то вычисляют: b = E / I (II.3.5) - наклон прямой дозовой зависимости (средний для обоих препаратов); M = F / b (II.3.6) - логарифм отношения эквивалентных доз, т. е. величину 0 М = lg (D / D); 0 D / D = antilg (2 + M) (II.3.7) - отношение эквивалентных доз (в процентах); t --------------- M P / 2 M = ----- +/- ---------- / A(1 - g) + BM (II.3.8) H;B 1 - g b(1 - g) \/ - Р-процентные доверительные границы для М, причем 2 2 g = Bt / b ; (II.3.9) P наконец, получают 0 (D / D) (II.3.10) H; B - Р-процентные доверительные границы для отношения эквивалентных доз (в процентах). Середины доверительных интервалов II.3.8 не совпадают со значениями М из II.3.6, особенно при больших значениях g. Величина g должна быть всегда меньше единицы, в противном случае весь опыт следует считать некорректным и нуждающимся в повторении. Если можно предположить, что активности испытуемого и стандартного препаратов отличаются незначительно, следует выбирать 1 0 0 дозы так, чтобы было соответственно lg D = --- (lg D1 + lg D2), 2 0 1 lg D = --- (lg D1 + lg D2) в испытаниях типа 2; 1 и 1; 2 либо 2 0 0 D1 = D1; D2 = D2 в испытании типа 2; 2 и т. д. При существенном отличии этих активностей такой выбор доз неоптимален и от него следует отказаться. В этом случае из значения М, полученного по 1 0 0 формуле II.3.6, следует вычесть величины lg D - - (lg D1 + lg D2), 2 0 1 0 lg D - --- (lg D1 + lg D2), lg D1 - lg D1 или др. в зависимости 2 от типа испытания. В формулы II.3.7 и II.3.8 должно войти уже скорректированное значение М. Пример II.4. В табл. II.3.1 приведены результаты испытания по стандартизации образца АКТГ; эффект характеризуется концентрацией (в мг%) аскорбиновой кислоты в надпочечнике. В данном случае мы имеем испытание типа 2; 3. По формуле II.3.1 получаем, используя _ значения "e " и "z " из табл. IV приложения, а значения у - из ФИ ФИ табл. II.3.1: _0 0 _ _ _ Е = [(-1)у1 + 1у2 + (-2)у1 + 0у2 + 2у3] / 5 = = (-351 + 269 - 2 х 336 + 2 х 189) / 5 = -75,2; F = (- 3 х 351 - 3 х 269 + 2 х 336 + + 2 х 256 + 2 х 189) / 6 = - 49,67; G = (2 х 351 - 2 х 269 - 336 + 189) / 2 = 8,5: Н = 336 - 2 х 256 + 189 = 13,0. Далее по данным из табл. II.3.1 находим: 2552 + 1660 + 1958 + 2802 + 1582 V = --------------------------------- = 70,36, (2 + 3) х 6 x (6 - 1) так что формулы последнего столбца табл. IV, приложения, дают значения: А = 5 х 70,36/6 = 58,63; B = 77,66; V = 175,90; V = 422,16. G H При вычислении B учтено, что I = lg 0,4 - lg 0,1 = 0,602. Проверка на линейность дозовой зависимости и на параллельность прямых дает: --- ------- H / /V = 13,0 / \/ 422,16 = 0,633; \/ Н --- ------- G / /V = 8,5 / \/ 175,90 = 0,641. \/ G Таблица II.3.1 Уровни факторов (дозы) ┌────────────────┬───────────┬───────────┬───────────┬───────────┬───────────┐ │ │ 0 │ 0 │ │ │ │ │ Эффекты │ 0 y1, │ 0 y2, │ y1, │ y2, │ y3, │ │ │D1 = 0,1 ЕД│D2 = 0,4 ЕД│D1 = 0,1 ЕД│D2 = 0,4 ЕД│D3 = 1,6 ЕД│ ├────────────────┼───────────┼───────────┼───────────┼───────────┼───────────┤ │ │ 370 │ 225 │ 310 │ 276 │ 187 │ │ │ 342 │ 268 │ 356 │ 228 │ 215 │ │ │ 335 │ 284 │ 345 │ 252 │ 200 │ │ y │ 369 │ 247 │ 313 │ 273 │ 168 │ │ ji │ 318 │ 296 │ 340 │ 279 │ 193 │ │ _ │ 372 │ 264 │ 352 │ 228 │ 171 │ │ y │ 351 │ 269 │ 336 │ 256 │ 189 │ │ i │ │ │ │ │ │ │ n _ 2│ │ │ │ │ │ │ SUM (y - y) │ 2552 │ 1660 │ 1958 │ 2802 │ 1582 │ │ j=1 ij │ │ │ │ │ │ └────────────────┴───────────┴───────────┴───────────┴───────────┴───────────┘ 0 Обе эти величины меньше, чем t(95%; f) = 2,060 [для f = (r + r) х (n - 1) = 25 степеней свободы], так что можно продолжать расчет. По формулам II.3.5 и II.3.6 получаем: Ь = - 75,2 / 0,602 = -124,9; M' = - 49,67 / (-124,9) = 0,3977. Поскольку в данном испытании средние дозы стандартного и испытуемого препаратов не совпадают, то надо из M' вычесть величину lg 0,l + lg 0,4 + lg l,6 lg 0,1 + lg 0,4 ------------------------ - --------------- = 3 2 = - 0,3980 + 0,6990 = 0,3010, так что 0 М = 0,3977 - 0,3010 = 0,0967; D /D = 124,9%. Далее вычисляем по формулам II.3.9 и II.3.8: 2 77,66 х 1,960 g = ------------- = 0,0191; 1 - g = 0,9809; 2 (- 124,9) 0,0967 1,96 M = ------- +/- ------------------ x H,B 0,9809 (- 124,9) х 0,9809 -------------------------------- x \/ 58,63 х 0,9809 + 77,66 х 0,0961 = [- 0,0235; 0,2207]. Окончательно получаем: 0 (D /D) = [94,7%; 166,2%]. H, B Доверительные интервалы во всех этих испытаниях могут быть сужены, если использовать в опыте сопряженные группы животных. Например, в испытании типа 2;2 целесообразно использовать n четверок животных, каждая из которых содержит животных из одного помета, одинакового пола и близкой массы тела; каждая четверка 0 0 животных используется для определения четверки значений: у1; у2, у1 и у2. При такой постановке опыта 2 2 SUM d - SUM "ДЕЛЬТА" V = ---------------------, (II.3.11) 3n(n - 1) 2 где d - числитель формулы II.3.2, а 2 0 0 _0 _0 _ _ 2 SUM "ДЕЛЬТА" = SUM [(у1 + у2 + у1 + у2) - (у1 + у2 + у1 + у2)] . (II.3.12) Число степеней свободы равно f = 3(n - 1). Доверительный интервал может быть также сужен, если методика испытания допускает выполнение повторных определений на каждом животном - с достаточным разрывом во времени, обеспечивающем восстановление исходного состояния после первого опыта. В повторном опыте те животные, на которых определялась активность 0 у , используются для определения у и наоборот. Кроме того, животные, получившие в первом опыте меньшую дозу, получают во втором опыте большую дозу и наоборот (метод двойного перекреста, см. табл. II.3.2). Таблица II.3.2 ┌────────┬────────────┬────────────┬─────────────────────────────┐ │ Группа │ Первый │ Второй │ Разность результатов │ │животных│ опыт │ опыт │ │ ├────────┼────────────┼────────────┼─────────────────────────────┤ │ │ 0 │ │ 0 │ │1 │ у1 │ у2 │ ДЕЛЬТА1 = у2 - у1 │ ├────────┼────────────┼────────────┼─────────────────────────────┤ │ │ 0 │ │ 0 │ │2 │ у2 │ у1 │ ДЕЛЬТА2 = у1 - у2 │ ├────────┼────────────┼────────────┼─────────────────────────────┤ │ │ │ 0 │ 0 │ │3 │ у1 │ у2 │ ДЕЛЬТА3 = у2 - у1 │ ├────────┼────────────┼────────────┼─────────────────────────────┤ │ │ │ 0 │ 0 │ │4 │ у2 │ у1 │ ДЕЛЬТА4 = у1 - у2 │ └────────┴────────────┴────────────┴─────────────────────────────┘ При таком построении испытания надо пользоваться формулами: ______ ______ ______ ______ E = (ДЕЛЬТА1 - ДЕЛЬТА2 + ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА4) / 4; (II.3.13) ______ ______ ______ ______ F = (ДЕЛЬТА1 + ДЕЛЬТА2 - ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА4) / 4; (II.3.14) ______ 2 ______ 2 SUM (ДЕЛЬТА1 - ДЕЛЬТА1) + SUM (ДЕЛЬТА2 - ДЕЛЬТА2) n n V = ------------------------------------------------------ + 8n(n - 1) (II.3.15) ______ 2 ______ 2 SUM (ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА3) + SUM (ДЕЛЬТА4 - ДЕЛЬТА4) n n + -----------------------------------------------------; 8n(n - 1) 2 А = V/2, B = V/(2I ). (II.3.16) Дальнейшие расчеты производят по формулам II.3.5 - II.3.10, причем t(P, f) берется из табл. II приложения для числа степеней свободы f = 4 (n - 1). Пример II.5. В табл. II.3.3. приведены результаты испытания (стандартизация образца АКТГ), построенного по методу двойного перекреста (в примере II.4 эти же данные были использованы в умышленно рандомизированном виде, чтобы не сказывался эффект сопряженности тест - объектов). По формулам II.3.13 - II.3.16 (получаем): Е = (-90 - 66 - 68 - 101)/4 = -81,25; F = (-90 + 66 + 68 - 101)/4 = -14,25; V = (1178 + 104 + 258 + 546)/(8 х 3 х 2) = 43,46; 2 А = 43,46/2 = 21,73; В = 43,46/(2 х 0,602 ) = 59,96 (I = lg 0,4 - lg 0,1 = 0,602); кроме того, f = 4 х 2 = 8, t (95%, 8) = 2,306. Теперь по формулам II.3.5-II.3.10 находим: Ь = -81,25/0,602 = -135,0; 0 M = -14,25 / (-135,0) = 0,1056; D /D = 127,6%; 2 2 g = 59,96 х 2,306 / (-135,0) = 0,0175; 1 - g = 0,9825; 0,1056 М = ------ +/- H,B 0,9825 -------------------------------- 2,306 / 2 +/- ---------------- \/ 21,73 х 0,9825 + 59,96 х 0,1056 = - 135,0 х 0,9825 = 0,1075 +/- 0,0816 = [0,0259; 0,01891]; 0 (D /D) = [106,1%; 154,6%]. H,B 0 Доверительный интервал для D /D получился более узким, чем без учета сопряженности тест - объектов (см. пример II.4), хотя использовано меньше результатов испытаний. Когда имеются результаты нескольких независимых определений эквивалентных доз, их можно объединить с целью получения более 0 точной оценки для D /D и более узкого доверительного интервала для этой величины. При этом пользуются приближенными формулами (точные формулы весьма громоздки): _ _ M M = ------ +/- t(P, f)S , (II.3.17) H,B 1 - g M _ M Mj ------ = SUM (Wj -----) / SUM Wj ; (II.3.18) 1 - g 1 - g j ------- S = 1 / \/ SUM Wj , (II.3.19) M 2 где весовыми коэффициентами Wj, служат обратные дисперсии 1 / s : Mj 2 2 b (1 - g ) 1 j j Wj = ---- = -------------------; (II.3.20) 2 2 s Аj(1 - g ) + BjMj Mj j j = 1, 2, ..., k есть номер испытания, a t(P, f) берется для числа степеней свободы, равного сумме чисел степеней свободы отдельных испытаний: f = SUM f . Доверительный интервал для усредненного 0 j отношения D /D находят по формуле: _ (D0/D) = antilg(2 + M ). (II.3.21) H,B H,B Законность указанного объединения (т. е. случайности различия между отдельными М) проверяют при помощи критерия "хи - квадрат": 2 ┌ ┐2 2 Mj │ Mj │ "хи" = SUM (Wj --------- ) - │SUM (Wj ------)│ / SUM Wj (II.3.22) 2 2 │ 1 - g │ (1 - g ) └ j ┘ j 2 2 2 должно быть "хи" < "хи" (95%, f), где "хи" (95%, f) берут из табл. II Таблица II.3.3 ┌──────┬───────────────┬───────────────┬──────┬───────────────┬────┐ │Группа│1-й день опыта │2-й день опыта │"ДЕЛЬ-│d = "ДЕЛЬТА" - │ 2 │ │ │ │ │ТА" │ ______ │d │ │ │ │ │ │- "ДЕЛЬТА" │ │ ├──────┼───────────────┼───────────────┼──────┼───────────────┼────┤ │1 │ 370│ 273│- 97 │- 7 │49 │ │ │ 0 │ │ │ │ │ │ │y1 342│y2 279│- 63 │ 27 │729 │ │ │ 0 │ │ │ │ │ │ │D1 = 0,1 ЕД 335│D2 = 0,4 ЕД 225│- 110 │- 20 │400 │ │ │ │Сумма │- 270 │ 0 │1178│ │ │ │Среднее │- 90 │ │ │ │2 │ 255│ 313│ 58 │- 8 │64 │ │ │ 0 │ │ │ │ │ │ │y2 268│y1 340│ 72 │ 6 │36 │ │ │ 0 │ │ │ │ │ │ │D2 = 0,4 ЕД 284│D = 0,1 ЕД 352│ 68 │ 2 │4 │ │ │ │Сумма │ 198 │ 0 │104 │ │ │ │Среднее │ 66 │ │ │ │3 │ 310│ 247│- 63 │ 5 │25 │ │ │ │ 0 │ │ │ │ │ │y1 356│y2 296│- 60 │ 8 │64 │ │ │ │ 0 │ │ │ │ │ │D1 = 0,1 ЕД 345│D2 = 0,4 ЕД 264│- 81 │- 13 │169 │ │ │ │Сумма │ 204 │ 0 │258 │ │ │ │Среднее │- 68 │ │ │ │4 │ 276│ 369│ 93 │- 8 │64 │ │ │ │ 0 │ │ │ │ │ │y2 228│y1 318│ 90 │- 11 │121 │ │ │ │ 0 │ │ │ │ │ │D2 = 0,4 ЕД 252│D1 = 0,1 ЕД 372│ 120 │ 19 │361 │ │ │ │Сумма │ 303 │ 0 │546 │ │ │ │Среднее │ 101 │ │ │ └──────┴───────────────┴───────────────┴──────┴───────────────┴────┘ приложения для числа степеней свободы f = k - 1 (k - число объединяемых испытаний). В частности, когда объединяются результаты двух испытаний, то ┌ M1 M2 ┐ W1W2│------ - ------ │ 2 └1 - g1 1 - g2 ┘ "хи" = ------------------------- (II.3.23) W1 + W2 2 при f = 1, так, что "хи" (95%, 1) = 3,84. II.4. ПРИМЕНЕНИЕ СХЕМЫ ЛАТИНСКОГО КВАДРАТА При биологическом испытании антибиотиков методом диффузии в агар на лотках наиболее употребительна схема латинского квадрата, позволяющая рандомизировать неоднородность бактериальной культуры по обоим направлениям поверхности питательной среды. Например, в случае испытания 2; 2 дозы могут располагаться следующим образом: 0 0 |