ГФ11-1. Общие методы анализа редакционная коллегия государственной фармакопеи ссср
 Скачать 1.83 Mb.
|
|
графика: m SUM х _ 1 i х = --------; (I.6.14) m m SUM у _ 1 i у = -------. (I.6.15) m Наименьшие отклонения значений у от значений Yi наблюдаются i в окрестностях центра графика. Стандартные отклонения s и s у x величины у и х, рассчитанных соответственно по уравнениям I.6.1 и I.6.2 исходя из известных значений х и у, определяются с учетом удаления последних от координат центра графика: -------------------------------- / _ 2 / 2┌ 1 m(x - x) ┐ s = / s │--- + ----------------------│ ; (I.6.16) y / 0└ m m 2 m 2 ┘ \ / mSUM х - (SUM х ) \/ 1 i 1 i ------------------------------------------ / ┌ _ _ 2 ┐ / │ m(у - у) │ / 2 │ 1 1 j │ s = / s0 │--- + --- + ---------------------------│(I.6.17) x / --- │ n m 2┌ m 2 m 2 ┐ │ \ / 2 │ j b │ mSUM х - (SUM х ) │ │ \/ b └ └ 1 i 1 i ┘ ┘ _ где у - среднее значение; n - число вариант, использованных j _ j при определении у . j _ _ _ При х = х и у = у: j ----- / 2 / s0 s = \ / ----- ; у \/ m (I.6.16а) ---------------- / 2 ┌ ┐ / sa │ 1 1 │ s = / --- │--- + --- │. x / 2 │ n m │ \ / b │ j │ \/ └ ┘ С учетом значений s и s могут быть найдены значения величин у x "ДЕЛЬТА"у и "ДЕЛЬТА"x . "ДЕЛЬТА"у = s t(P; F); (I.6.18) у "ДЕЛЬТА"x = s t(P; F). (I.6.19) x Значения s и "ДЕЛЬТА"x, найденные при n = 1, являются x j характеристиками воспроизводимости аналитического метода, если х - концентрация, а у - функция х. Обычно результаты статистической обработки по методу наименьших квадратов сводят в таблицу (табл. I.6.2). Таблица I.6.2 Результаты статистической обработки экспериментальных данных, полученных при изучении линейной зависимости вида y = bх + а ┌─┬─┬─┬─┬─┬───────┬──────┬──────┬──┬──┬───────┬──────┬────────────┐ │f│_│_│b│а│t(P, f)│"ДЕЛЬ-│"ДЕЛЬ-│ 2│r │ s │"ДЕЛЬ-│"ДЕЛЬТАх"100│ │ │x│у│ │ │ при │ТА"b │ТА"a │s0│ │ x │ТА"x │------------│ │ │ │ │ │ │Р = 95%│ │ │ │ │при │ │ _ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │n = 1,│ │ x │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ j _ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │у = у │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ j │ │ │ ├─┼─┼─┼─┼─┼───────┼──────┼──────┼──┼──┼───────┼──────┼────────────┤ │1│2│3│4│5│ 6 │ 7 │ 8 │ 9│10│ 11 │ 12 │ 13 │ └─┴─┴─┴─┴─┴───────┴──────┴──────┴──┴──┴───────┴──────┴────────────┘ Примечание I.6.1. Если целью экспериментальной работы являлось определение констант b и a, графы 11, 12 и 13 табл. I.6.2 не заполняются. Примечание I.6.2. Если у = Ьlg x + a, вычисления, описанные в разделе I.6, выполняют с учетом примечаний I.1.2 и I.2.2. 2 Примечание I.6.3. Сравнение дисперсий s0, полученных в разных условиях для двух линейных зависимостей, может быть проведено, как указано в разделе I.3 (см. выражения I.3.4, I.3.5 и I.3.5а). II. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ БИОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ II.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА БИОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ Во многих случаях установление свойств препаратов при помощи физических и химических анализов достаточно для полной характеристики свойств этих препаратов, включая и их биологическую активность. Однако физические и химические свойства препарата не всегда могут быть стандартизованы. Нередки случаи, когда связь между этими свойствами препарата и его биологической активностью установлена недостаточно определенно и однозначно. В подобных случаях биологическая активность фармакологического агента может быть определена только при помощи непосредственного биологического исследования. Чаще всего показатель, характеризующий биологическую активность препарата, учитывается в количественной форме: например, масса аскорбиновой кислоты на 100 г ткани надпочечника при действии кортикотропина, время свертывания крови при действии гепарина и т. д. В этом случае конечным результатом испытания следует считать среднее значение показателя у, а точнее - доверительный интервал для у. О вычислении этих величин см. разд. I.1 и I.2. Пример II.1. При введении 7 мышам внутрибрюшинно раствора гексенала в дозе 100 мг/кг получены следующие величины продолжительности наркоза у (в минутах): 35; 83; 53; 60; 71; 62; 39. i Расчет проводят по уравнениям: I.1.2; I.1; I.2.2 при Р = 95%. _ 2 у = 57,60 мин; s = 287,64; s = 16,96; s_ = 6,41. у _ f = 6; t(95%, 6) = 2,45; "ДЕЛЬТА"у = 15,70. _ _ у +/- "ДЕЛЬТА"у = 57,6 +/- 15,7; у = 41,9 мин; у = 73,3 мин. min max Одной из важнейших задач биологических испытаний фармакологических веществ является сравнение испытуемого препарата со стандартным, для чего испытанию подвергаются одновременно две или большее число (если испытания производятся при некотором наборе доз) групп животных или других тест - объектов. При составлении этих групп следует обеспечивать однородность тест - объектов (в отношении пола, возраста, массы тела, условий содержания и т. д.) внутри групп, а также распределение тест - объектов по группам при помощи методов рандомизации. Кроме того, следует стремиться к тому, чтобы число тест - объектов во всех группах было одинаково. Это является условием применимости ряда процедур статистического анализа, описываемых ниже, и всегда упрощает вычисление во всех остальных случаях. Если по какой-либо причине (ошибка в эксперименте, гибель животного, не связанная с испытанием) в некоторых из групп выпало по одному результату, можно выровнять численности групп одним из двух способов: а) исключить из больших групп по одному результату, но обязательно с применением рандомизации; б) прибавить к каждой из меньших групп один результат, равный среднему из оставшихся в этой группе результатов, но в дальнейших расчетах число степеней свободы, относящихся к данной группе, должно считаться на единицу меньшим. Выбор того или другого способа выравнивания численностей в группах зависит главным образом от числа групп, в которых образовались пробелы. В принципе эти процедуры можно применять и при различии в численностях групп на две-три и большее число единиц, но это всегда менее желательно, так как снижает точность и надежность окончательных выводов по результатам испытания. Сравнение стандартного и испытуемого препаратов, т.е. проверка того, одинаковы ли их биологические активности, производится при помощи критерия Стьюдента (см. раздел I.4). Пример II.2. Опыт, описанный в примере II.1, был повторен на другой группе из 7 мышей, но за 15 мин до введения гексенала вводили (также внутрибрюшинно) акрихин в дозе 150 мг/кг. Длительность наркоза у оказалась (в минутах): 75; 78; 114; 110; i 93; 100; 87. Требуется выяснить, влияет ли предварительное введение акрихина на действие гексенала. _ Расчет по уравнениям I.1.2 - I.1.6 дает: у = 93,9 мин; 1 2 s = 226,48; s1 = 15,05; f1 = 6. 1 Далее с использованием уравнений I.1.8; I.1.4, I.4.1 и I.4.2 получают fобщ = 12, t = 4,24. По табл. II приложения находим t (95%; 12) = 2,18. Сравнивая с этим табличным значением полученное выше фактическое значение t = 4,24, можно заключить, что вероятность того, что акрихин влияет на действие гексенала, превышает 95%. Используя более полную таблицу критических значений t, имеющуюся во всех руководствах по биометрии и математической статистике, можно убедиться, что данная вероятность превышает даже 99%, так как t (99%; 12) = 3,05, но эта вероятность несколько меньше 99,9%, ибо t (99,9%, 12) = 4,32. При сравнении целенаправленных биологических активностей вероятность различия 95% может считаться приемлемой. Но если, например, решается вопрос об отсутствии вредных побочных действий, то требования к вероятности значительно возрастают. При подозрении особо опасного побочного действия "степень риска" (100 - Р) = "альфа" (эту величину называют уровнем значимости) следует снижать -4 до значений 10 или даже меньших; соответствующие критические значения t(P, f) можно найти в специальных математико - статистических таблицах. Если выбран определенный уровень значимости "альфа", то при t > t(P) различие считается значимым. В этом случае по уравнению I.4.6 вычисляют доверительный интервал разности сравниваемых показателей. Чувствительность указанного метода сравнения двух препаратов значительно возрастает, если можно организовать испытание их на ряде достаточно однородных (сопряженных) пар тест - объектов. Сопряженную пару могут составить, например, животные из одного помета, одинакового пола и близкой массы тела или, если это допускается методикой испытания, два повторных определения на одном животном с достаточным разрывом во времени, обеспечивающим восстановление исходного состояния после первого опыта. В первом случае каждая из групп должна состоять наполовину из "более тяжелых" членов пар и наполовину из "более легких". Во втором случае в один день половина группы подвергается одному воздействию и другая половина - другому, а в другой день подгруппы меняются местами; это делается, чтобы исключить возможный дополнительный источник различий. При использовании n сопряженных пар составляется ряд разностей ______ "ДЕЛЬТА" "ДЕЛЬТА" = у2 - у1 и вычисляется величина t = -------- , где s ______ "ДЕЛЬТА" ______ "ДЕЛЬТА" = SUM "ДЕЛЬТА" / n, --------------------------- / ______ 2 / SUM ("ДЕЛЬТА" - "ДЕЛЬТА") / n s = / ----------------------. 2 \/ n(n - 1) "ДЕЛЬТА" Полученная величина t (без учета знака) сравнивается с табличным значением t (P,f) для принятого уровня значимости "альфа" и числа степеней свободы f = n - 1. Пример II.3. Пусть тест - объекты N 1, 2, ... 7 из примера II.1 были сопряжены с тест - объектами N 3, 1, 5, 2, 6, 4, 7 из примера II.2 (в каждой паре были мыши из одного помета примерно с ______ одинаковой массой тела). Тогда получается: "ДЕЛЬТА" = 254/7 = 36,3, S = 3,65, t=9,94, в то время как t (95%,7) = 2,36 и ______ "дельта" t(99%, 7) = 3,50; t (99,9%, 7) = 5,4 (последнее значение взято из более полной таблицы значений t (P,f). Значит, при учете сопряженности пар (т.е. при исключении вариаций между пометами) различие констатируется с большей вероятностью (Р > 99,9%), чем без учета этой сопряженности. II.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОЗОВОЙ ЗАВИСИМОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ Биологическая активность препарата зависит от примененной дозы, и выяснение характера этой зависимости - одна из важных задач испытания препарата. Многочисленные наблюдения показывают, что в интервале обычно применяемых доз фармакологический эффект (когда он выражается количественно) в первом приближении связан линейно с логарифмом дозы lg D. у = у0 + blg D, (II.2.1) где y0 и b - некоторые константы. Задачей испытания является проверка линейности связи между y и lg D, а затем негоризонтальности линии связи, т. е. наличия зависимости эффекта от дозы. Лишь после этого можно перейти к оценке констант у0 и b. Для проверки линейности связи требуется измерить активности у1, у2, у3 по крайней мере для трех разных доз D1, D2, D3. Расчет существенно упрощается, если численности групп тест - объектов n, на которых исследуется действие доз D1, D2, D3, одинаковы, а сами дозы выбраны так, что lg D3 - lg D2 = lg D2 - lg D1, т. е. D3/D2 = D2/D1 . Иными словами D 2 должно быть средним геометрическим из D1 . и D3, так что lg D2 находится посередине интервала lg D1 - lg D3. . В этом случае критерием линейности может служить отношение: _ _ _ у1 + у3 - 2у2 t = ------------------------- , (II.2.2) ------------------- / 2 / 2 SUM d / n(n - 1), \/ n 2 _ 2 _ 2 _ 2 где SUM d = SUM (у1 - у1) + SUM (у2 - у2) + SUM (у3 - у3) . n n n n Когда численности групп неодинаковы, для n = n1 + n2+ n3 производится замена: 2 2 SUM d SUM d n n 1 1 1 ---------- -> ----------------- (--- + --- + ---). (II.2.3) n(n - 1) n1 + n2 + n3 - 3 n1 n2 n3 Если значение t, вычисленное по II.2.2, окажется больше критического значения t (P, f) для числа степеней свободы <*> f = 3 x (n - 1), то гипотезу о линейности связи между у и lg D можно отвергнуть с вероятностью, большей Р. -------------------------------- <*> f = n1 + n2 + n3 - 3 при неравных численностях групп. Если гипотеза о линейности связи не опровергается, то переходят к проверке значимости наклона прямой, выражающей зависимость эффекта от дозы. Для этого вычисляют величину: ------------- / 3n(n - 1) _ _ t = / ----------- (у3 - у1). (II.2.4) / 2 \ / 2 SUM d \/ n Если эта величина окажется меньше, чем t(95%, f) при f = 3(n - 1), то можно считать, что эффект не зависит от дозы; если же t > t(95%, f), то эффект зависит от дозы <*>. -------------------------------- <*> Может показаться, что если эффект не зависит от дозы, то теряет смысл проверка линейности связи между у и lg D, и анализ надо начинать с применения критерия II.2.4, а не II.2.2. Но это не так. Если зависимость нелинейна, то критерий II.2.4 относится к среднему наклону, который может оказаться равным нулю, хотя активность при разных дозах различна. Когда линейный характер зависимости у от lg D известен для препарата данного состава из предыдущих исследований и требуется лишь проверить значимость наклона прямой, выражающей эту зависимость, то можно обойтись испытаниями только для двух доз D1 и D2. В этом случае вместо II.2.4 для вычисления t применяют формулу: ----------- / n(n - 1) _ _ t = / ---------- (у2 - у1). (II.2.5) / 2 \ / SUM d \/ n ┌ 2 _ 2 _ 2┐ │f = 2(n - 1), причем SUM d = SUM (у1 - у1) + SUM (у2 - у2) │. └ n n n ┘ При различных численностях групп в II.2.5 производят замену, аналогичную II.2.3. Если по критерию II.2.4 или II.2.5 установлено, что эффект зависит от дозы, то оценку констант Ь и у0 проводят по формулам: _ _ у3 - у1 b = -------------; (II.2.6) lg D3 - lg D1 _ _ _ у0 = (у1 + у2 + у3) / 3 - b(lg D1 + lg D3) / 2 (II.2.7) при использовании трех доз и _ _ у2 - у1 b = -------------; (II.2.8) lg D2 - lg D1 ┌ _ _ ┐ y0 = │(у1 + у2) - b(lg D1 + lg D2)│ / 2 (II.2.9) └ ┘ при использовании двух доз. Доверительные интервалы для этих параметров строятся с использованием их стандартных ошибок, равных при трех дозах: ------------------- ---------- / 2 / 2 /2 SUM d / n(n - 1) / SUM d \/ n / n s = ------------------------ ; s = / --------------- , b lg D3 - lg D1 у0 \/ 2n(n - 1) (II.2.10) а при двух дозах ------------------- ----------- / 2 / 2 /2 SUM d / n(n - 1) / SUM d \/ n / n s = ------------------------ ; s = / --------------- , b lg D2 - lg D1 у0 \/ 2n(n - 1) (II.2.11) Оценки параметров Ь и у0 получаются более точными, если испытания проведены при большем числе доз. В этом случае вычисления должны производиться по общим формулам регрессионного анализа. В частности (см. раздел I.6), SUM (xу) - SUM x SUM у/n n n n b = ------------------------, (II.2.12) 2 2 SUM x - (SUM x) / n n n у0 = (SUM у - bSUM x) / n, (II.2.13) n n где x = lg D, a n - общее число экспериментальных точек для всех доз. Достаточно хорошее приближение получается, если в эти формулы _ вместо индивидуальных значений у подставить значения у для каждой из доз; в этом случае n будет означать число доз, а значения х и 2 х будут входить в соответствующие суммы по одному разу. II.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭКВИВАЛЕНТНЫХ ДОЗ Одной из основных задач биологического испытания является 0 установление эквивалентной дозы, т.е. той дозы D стандартного препарата, которой соответствует по своей биологической активности доза D испытуемого препарата. Биологическая активность последнего может очень сильно зависеть от особенностей выбранной группы тест - объектов, их физиологического состояния, времени года, деталей лабораторной методики и многих других факторов. Поэтому определение эквивалентных доз требует одновременного применения испытуемого и стандартного препаратов к двум подгруппам однородной группы тест - объектов. Определение эквивалентных доз требует также знания того, как биологическая активность зависит от дозы. Описанные ниже методы относятся к тому наиболее частому случаю, когда биологическая активность у связана линейно с логарифмом дозы D по уравнению II.2.1; проверка такой линейности производится при помощи критерия II.2.2. |