ГФ11-1. Общие методы анализа редакционная коллегия государственной фармакопеи ссср
 Скачать 1.83 Mb.
|
|
ТЕХНИКА МИКРОСКОПИЧЕСКОГО И МИКРОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ Техника приготовления микроскопических препаратов из лекарственного растительного сырья разнообразна и зависит от морфологической группы исследуемого объекта, а также от состояния сырья - цельного, дробленого, резаного или порошкообразного. Листья, травы, цветки Цельное и резаное сырье. При исследовании цельного сырья берут кусочки пластинки листа с краем и жилкой; у трав берут лист, иногда также кусочек стебля и цветок, у цветков - чашечку и венчик. При исследовании резаного сырья берут по нескольку различных кусочков. Просветление можно проводить двумя способами. I. Несколько кусочков сырья помещают в колбу или пробирку, прибавляют 5% раствор едкого натра, разведенный водой (1:1), и кипятят в течение 1-2 мин. Затем содержимое выливают в чашку Петри (или фарфоровую), жидкость сливают и сырье тщательно промывают водой. Из воды кусочки сырья вынимают скальпелем или лопаточкой и помещают на предметное стекло в каплю раствора хлоралгидрата или глицерина. II. Кусочки кипятят в растворе хлоралгидрата, разведенного водой (1:1), в течение 5-10 мин (до просветления). Просветленный кусочек сырья помещают на предметное стекло в каплю раствора хлоралгидрата или глицерина, разделяют скальпелем или препаровальной иглой на две части, одну из них осторожно переворачивают. Объект накрывают покровным стеклом, слегка подогревают до удаления пузырьков воздуха и после охлаждения рассматривают лист c oбеиx сторон под микроскопом сначала при малом, затем при большом увеличении. При приготовлении микропрепаратов из толстых листьев их предварительно раздавливают скальпелем. Для исследования стеблей их отрезки кипятят в 5% растворе едкого натра, тщательно промывают водой, снимают эпидермис скальпелем или препаровальными иглами и рассматривают его с поверхности; из остальных тканей готовят препарат, раздавливая объект скальпелем на предметном стекле в растворе хлоралгидрата или глицерина. При необходимости приготовления поперечных срезов листьев и стеблей их кипятят в растворе хлоралгидрата в течение 10 мин и делают срезы, зажимая кусочки листа в пробку или сердцевину бузины. Готовые срезы помещают в воду и далее используют для приготовления микропрепаратов, рассматривая их в растворе хлоралгидрата. Порошок. На предметное стекло наносят 1-2 капли раствора хлоралгидрата и небольшое количество исследуемого порошка. Порошок берут кончиком препаровальной иглы, смоченной хлоралгидратом, тщательно размешивают, закрывают покровным стеклом и нагревают до удаления пузырьков воздуха. Затем стекло слегка придавливают ручкой препаровальной иглы, выступившую по краям жидкость удаляют полоской фильтровальной бумаги. Порошки кожистых листьев просветляют кипячением в 5% растворе едкого натра. Плоды, семена Цельное сырье. Готовят препараты кожуры семени и околоплодника с поверхности или поперечные срезы. Препараты кожуры и околоплодника с поверхности. 2-3 семени или плода кипятят в пробирке в растворе 5% едкого натра в течение 2-3 мин и тщательно промывают водой. Объект помещают на предметное стекло, препаровальными иглами отделяют кожуру семени или ткани околоплодника и рассматривают их в растворе хлоралгидрата или глицерина. Срезы. Для приготовления срезов сухие плоды и семена предварительно размягчают, поместив их на сутки во влажную камеру (влажной камерой служит эксикатор с водой, в которую добавлено несколько капель хлороформа) или водяным паром в течение 15-30 мин или более в зависимости от твердости объекта. Мелкие плоды и семена запаивают в парафиновый блок размером 0,5 Х 0,5 Х 1,5 см. Кончиком нагретой препаровальной иглы расплавляют парафин и в образовавшуюся ямку быстро погружают объект. Поверхность объекта должна быть сухой. Срезы объекта делают вместе с парафином; срезы выбирают из парафина препаровальной иглой, смоченной жидкостью, и готовят микропрепараты в растворе глицерина или хлоралгидрата. Порошок. Готовят несколько микропрепаратов для выявления диагностических элементов кожуры семени и околоплодника и содержимого эндосперма или зародыша. Препарат готовят так же, как указано в разделе "Листья, травы, цветки". В качестве просветляющей жидкости используют раствор хлоралгидрата или 50% раствор едкого натра. Крахмал. Готовят два препарата - в растворе йода (раствор Люголя) и в воде; от йода крахмальные зерна окрашиваются в синий цвет. В воде определяют их форму, строение, размеры крахмальных зерен измеряют окулярным микрометром. Жирное и эфирное масло. Для обнаружения жирного и эфирного масла готовят препарат в растворе судана III и подогревают; капли жирного или эфирного масла окрашиваются в оранжево - розовый цвет. Слизь. Для обнаружения слизи готовят препарат порошка в растворе черной туши и тотчас рассматривают под микроскопом (малое увеличение); слизь заметна в виде бесцветных масс на черном фоне. При исследовании строения клеток кожуры и околоплодника в порошке из плодов и семян, содержащих крахмал или незначительное количество жирного масла, препарат готовят в растворе хлоралгидрата при легком подогревании. При необходимости порошок обезжиривают и просветляют. Для обезжиривания порошок сырья помещают в пробирку с притертой пробкой и заливают 2-3 раза смесью спирта с эфиром (1:3) и после настаивания каждый раз в течение 20 мин растворитель сливают. Вместо смеси спирта с эфиром для обезжиривания можно использовать ксилол или эфир. Для просветления 0,5-1 г порошка насыпают в фарфоровую чашку, прибавляют 5-10 мл разведенной азотной кислоты и кипятят в течение 1 мин, затем жидкость процеживают через ткань и порошок промывают горячей водой. Остаток на ткани собирают лопаточкой обратно в фарфоровую чашку, обливают 5-10 мл 5% раствора едкого натра, кипятят в течение 1 мин, снова процеживают через ту же ткань и промывают горячей водой. После этого порошок рассматривают в растворе глицерина под микроскопом. Кора Цельное сырье. Готовят поперечные или продольные срезы коры. Кусочки коры размером 2-3 Х 0,5-1 см кипятят в колбе или пробирке с водой в течение 5 мин. Размягченные куски выравнивают скальпелем так, чтобы они имели строго поперечное или продольное сечение. Делают срезы и готовят микропрепараты в растворе хлоралгидрата или глицерина. При необходимости готовят препараты в соответствующих реактивах для выявления различных структур или веществ. Одревесневшие (лигнифицированные) элементы. К срезу на предметном стекле прибавляют несколько капель раствора флороглюцина и 1 каплю 25% раствора серной кислоты. Через минуту жидкость отсасывают полоской фильтровальной бумаги, срез заключают в раствор хлоралгидрата или глицерина и закрывают покровным стеклом (рассматривают без подогревания); одревесневшие механические элементы окрашиваются в малиново - красный цвет. Для окраски одревесневших элементов можно использовать также раствор сафранина. Срезы помещают в 1% раствор сафранина в 50% спирте на 30 мин (в закрытом бюксе или на часовом стекле), промывают сначала 50% спиртом, затем подкисленным спиртом (на 100 мл спирта прибавляют 2 капли концентрированной хлористоводородной кислоты) и заключают на предметном стекле в глицерин. Одревесневшие оболочки окрашиваются в красный цвет. Крахмал. Для обнаружения крахмала делают соскоб с сухой коры и рассматривают его в растворе Люголя. Крахмальные зерна окрашиваются в синий цвет. Дубильные вещества. Наличие дубильных веществ устанавливают, нанося 1 каплю раствора железоаммониевых квасцов или хлорида окисного железа на внутреннюю поверхность сухой коры; появляется черно - синее или черно - зеленое окрашивание. Производные антрацена. Наличие производных антрацена определяют, нанося 1-2 капли раствора едкого натра на внутреннюю поверхность коры (кроваво - красное окрашивание), или проводят микросублимацию описанным ниже способом. Резаное сырье. Соскоб коры или мелкие кусочки кипятят в течение 3-5 мин в 5% растворе едкого натра, промывают водой и готовят микропрепараты, раздавливая объект скальпелем в растворе глицерина или хлоралгидрата. Одревесневшие элементы определяют по реакции, описанной для цельного сырья. Наличие крахмала, дубильных веществ, производных антрацена определяют в соскобе сухой коры. Порошок. Готовят несколько микропрепаратов для выявления диагностических элементов коры (в растворе хлоралгидрата) и содержащихся в ней веществ. Одревесневшие (лигнифицированные) элементы. На предметное стекло помещают около 0,1 г порошка, прибавляют 1-2 капли раствора флороглюцина, 1 каплю 25% раствора серной кислоты и закрывают покровным стеклом. Затем с одной стороны наносят 1-2 капли раствора хлоралгидрата, а с противоположной - отсасывают жидкость фильтровальной бумагой. Одревесневшие механические элементы окрашиваются в малиново - красный цвет. Производные антрацена (реакция микросублимации). На предметное стекло ставят трубку диаметром 1,5 см и высотой 2 см. Внутрь стеклянной трубки помещают небольшое количество испытуемого порошка (или соскоба), сверху накрывают другим предметным стеклом, ставят на асбестовую сетку, закрепленную в штативе, и подогревают. Пламя горелки следует держать от предметного стекла на расстоянии 5-7 см. На поверхность стекла, которое служит для улавливания сублимата, помещают кусочки фильтровальной бумаги и смачивают время от времени холодной водой. Через некоторое время на нижней стороне стекла появляется налет. Под микроскопом в сублимате видны тонкие желтые иголочки, которые в ультрафиолетовом свете (люминесцентный микроскоп) имеют яркое желтое или оранжево - красное свечение. В 5% спиртовом растворе едкого кали сублимат растворяется с красным окрашиванием. Корни, корневища, клубни, луковицы, клубнелуковицы Цельное сырье. Готовят поперечные и продольные срезы. Небольшие куски подземных органов помещают в холодную воду и выдерживают около суток, затем помещают в смесь 95% спирта и глицерина (1:1) на 3 сут. Размоченные объекты выравнивают скальпелем так, чтобы они имели строго поперечное или продольное сечение. Делают срезы и готовят микропрепараты в растворе хлоралгидрата или глицерина и рассматривают диагностические признаки сначала при малом, затем при большом увеличении. С соскобом сухих подземных органов или порошком проводят необходимые микрохимические реакции. Наличие одревесневших элементов, крахмала, слизи, жирного и эфирного масла, дубильных веществ, производных антрацена определяют, как указано в разделах "Плоды и семена" и "Кора". Инулин. Для обнаружения инулина на предметное стекло помещают около 0,1 г порошка, 1-2 капли раствора альфа - нафтола (резорцина или тимола) и 1 каплю концентрированной серной кислоты; появляется красновато - фиолетовое окрашивание (от резорцина и тимола - оранжево - красное). О наличии инулина можно делать выводы только при отсутствии крахмала. Резаное или дробленое сырье. Кусочки подземных органов кипятят в течение 3-5 мин в 5% растворе едкого натра, тщательно промывают водой и готовят микропрепараты, раздавливая кусочки в растворе глицерина или хлоралгидрата. С соскобом или порошком подземных органов проводят микрохимические реакции, как указано в разделе "Кора". Порошок. Готовят несколько препаратов для выявления диагностических элементов подземных органов (в растворе хлоралгидрата) и содержащихся в них веществ. Наличие одревесневших элементов, крахмала, слизи, жирного и эфирного масла, дубильных веществ и производных антрацена определяют, как указано в разделах "Плоды и семена" и "Кора". ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ Метод люминесцентной микроскопии применяется (где это целесообразно) для определения подлинности лекарственного растительного сырья. Преимуществом метода является возможность его применения для изучения сухого растительного материала, из которого готовят толстые срезы или препараты порошка, и рассматривают их в падающем свете, при освещении препарата сверху, через опак - иллюминатор или объектив. Люминесцентная микроскопия выполняется с помощью люминесцентных микроскопов или обычных биологических микроскопов, снабженных специальными люминесцентными осветителями. Приготовление микропрепаратов. Для приготовления микропрепаратов используют сухое лекарственное растительное сырье или его порошок. Предварительное размачивание сырья исключается, так как это приводит к вымыванию веществ из клеток; допускается лишь непродолжительное размягчение во влажной камере. Листья. Готовят обычно препараты из порошка листьев, которые рассматривают без включающей жидкости. Наиболее яркая люминесценция характерна для одревесневших элементов - сосудов жилки, механических волокон, а также для кутикулы и кутинизированных оболочек различных эпидермальных образований (волосков, железок и др.). В эпидермальных клетках часто содержатся флавоноиды, обусловливающие коричневую, желтую или зеленовато - желтую люминесценцию. Клетки мезофила содержат различные включения - желтые, голубые, зеленовато - желтые, коричневые - в зависимости от их химического состава. Хлорофилл в высушенном растительном материале не люминесцирует. Кристаллы оксалата кальция также не обладают люминесценцией. При необходимости приготовления среза лист предварительно размягчают во влажной камере и с помощью бритвы делают толстый срез (2-3 мм), который закрепляют на предметном стекле пластилином. Более тонкие срезы помещают во включающую жидкость и накрывают покровным стеклом. В качестве включающей жидкости используют воду, глицерин, 5% раствор поливинилового спирта, нефлюоресцирующее вазелиновое масло. Включающая жидкость не должна растворять содержащиеся в препарате люминесцирующие вещества. Травы. При анализе трав готовят микропрепараты листьев. При необходимости приготовления препарата стебля его размягчают во влажной камере и готовят срезы. Толстые срезы (2-3 мм) закрепляют на предметном стекле с помощью пластилина и рассматривают без включающей жидкости, тонкие - помещают в подходящую жидкость и накрывают покровным стеклом. Наиболее яркую люминесценцию имеют одревесневшие элементы проводящих пучков - сосуды и механические волокна, склеренхимные клетки, встречающиеся в коре и сердцевине стебля. В клетках эпидермиса и коры часто встречаются флавоноиды; у некоторых видов сырья в клетках обкладки, вокруг проводящих пучков содержатся алкалоиды, которые обладают разнообразным свечением: синим, голубым, зеленым, зеленовато - желтым, золотисто - желтым, оранжево - красным в зависимости от состава. Цветки. Чаще готовят препараты из порошка цветков или отдельных частей цветка (соцветия), которые рассматривают обычно без включающей жидкости. В цветках часто содержатся флавоноиды, каротиноиды и другие вещества, обладающие флюоресценцией. Отчетливо видны пыльцевые зерна, имеющие желтое, зеленовато - желтое или голубоватое свечение. Плоды. Готовят обычно поперечные срезы плода после предварительного размягчения во влажной камере и рассматривают во включающей жидкости или без нее в зависимости от толщины среза. Для плодов характерна люминесценция тканей околоплодника (экзокарпия, механических клеток мезокарпия, проводящих пучков). Отчетливо видны секреторные каналы - ярко светится их содержимое; клетки выстилающего слоя обычно имеют желтовато - коричневую люминесценцию. В содержимом каналов нередко видны ярко люминесцирующие кристаллические включения, чаще всего желтого или желто - зеленого цвета. Семена. Готовят обычно поперечные срезы семени после предварительного размягчения во влажной камере и рассматривают их во включающей жидкости или без нее в зависимости от толщины среза. Обращают внимание на характер люминесценции семенной кожуры, в которой отчетливо выделяются склеренхимные слои. Клетки эпидермиса, содержащие слизь, обычно имеют сине - голубое свечение. Эндосперм и ткани зародыша, богатые жирным маслом, характеризуются голубой люминесценцией. Кора. Кору предварительно размягчают во влажной камере, готовят толстые поперечные срезы (до 3-5 мм), которые закрепляют на предметном стекле пластилином, и рассматривают без включающей жидкости; тонкие срезы заключают в жидкость. Для некоторых видов сырья характерна люминесценция пробкового слоя коры: оболочки клеток пробки светятся интенсивно - синим, их содержимое - темно - красным (антоцианы). Яркое и разнообразное свечение имеют механические элементы (лубяные волокна и каменистые клетки): голубое, зеленовато - голубое, желтовато - зеленое. Люминесценция паренхимы коры зависит от химического состава. Антраценпроизводные обусловливают яркое оранжевое или огненно - оранжевое свечение. Дубильные вещества обладают свойством "тушить" люминесценцию, поэтому ткани, содержащие дубильные вещества, темно - коричневого, почти черного, цвета. Препарат, приготовленный из порошка коры или соскоба, рассматривают без включающей жидкости. В нем наиболее ярко видны механические элементы. Корни, корневища, луковицы, клубни, клубнелуковицы. Готовят поперечные срезы, распилы, препараты порошка или соскоба. Срезы готовят из материала, предварительно размягченного во влажной камере, распилы (из толстых корней и корневищ) - из сухого материала с помощью тонкой пилы или фрезы. С помощью бритвы с поверхности распила снимают тонкий слой для удаления слоя клеток, покрытых пылью. Толстые срезы и распилы (до 3- 5 мм) закрепляют на предметном стекле пластилином и рассматривают без включающей жидкости. Слой пробки у подземных органов обычно тусклый, почти черный. Ярко люминесцируют древесина (у корней и корневищ) и проводящие пучки, а также склеренхимные элементы. Их свечение очень разнообразно: от буровато - зеленого, желто - зеленого до светло - голубого и интенсивно - синего в зависимости от вида сырья. Еще более разнообразна люминесценция паренхимы тканей и различных секреторных образований (вместилищ, каналов, ходов, млечников, различных идиобластов), что определяется их химическим составом. В секреторных образованиях встречаются кристаллические включения кумаринов, алкалоидов, флавоноидов, обладающие яркой люминесценцией. В препаратах порошка видны отдельные сосуды, группы механических волокон, каменистые клетки, отдельные секреторные образования или их обрывки, ярко люминесцирующие клетки паренхимы, содержащие те или иные вещества. |