Методичка по микробиологии для иностранных учащихся. Под редакцией профессора Л. П. Титова
 Скачать 0.93 Mb.
|
|
1.13. Методы генетического анализа микроорганизмов Современные знания об организации генома микроорганизмов основаны, главным образом, на генетическом анализе, а не на химическом анализе последовательности нуклеотидов в ДНК. Генетический анализ позволяет составить подробные карты генетической организации хромосом. Длительное время методы генетического анализа развивались применительно к генетике диплоидных эукариотических организмов, жизненный цикл которых включал мейоз. Однако, когда этот же подход был использован для анализа мутаций E.coli, возникло множество затруднений. Только после открытия класса генетических элементов, характерных для прокариотов (плазмид, транспозонов), появилась возможность применить методы генетического анализа к бактериям. Плазмидный профиль весьма полезен для типирования условнопатогенных микроорганизмов. Плазмиды являются внехромосомными факторами наследственности, представленными двунитчатой циклической ДНК, содержащей от 10 до 100 генов (гены резистентности и вирулентности). Развитие быстрых и недорогих методов экстракции плазмидной ДНК и разделения плазмид на основе их размера в агарозном геле позволило широко использовать эти методы как в генетическом анализе, так и в эпидемиологических исследованиях. Генетический анализ состоит в экспериментальном изучении отношений, существующих между бактериями (мутантами). Для определения этих отношений используют два основных приема: 1) рекомбинационный - определяет пространственное расположение генов (или мутаций) на генетической карте, т.е. картирование генома; 2) комплементационный - определяет функциональные отношения генов (или мутантов). Бактерии, способные к быстрому размножению, дают возможность затрачивать на эксперимент сравнительно небольшое время. Кроме того, методы отбора мутантов или рекомбинантов просты и доступны. Основной прием отбора - применение набора минимальных сред (например, с одной аминокислотой) в сочетании с посевом штампом-репликатором. Такой метод позволяет установить характер мутации (или рекомбинации) и расположение соответствующего гена на генетической карте. Наиболее часто применяются следующие методы картирования: 1) с помощью прерванной конъюгации (с посевом микробов на минимальные среды через определенные интервалы времени в процессе конъюгации); 2) с помощью трансдукции (т.е. с помощью фага); 3) с помощью трансформации (после искусственного разрушения бактерий-доноров изучают характер изменений бактерий-реципиентов). Генетический анализ может проводиться и с помощью ДНК-(РНК)-зондов в реакции гибридизации. Этот метод важен не только с теоретической точки зрения, но и с практической - как наиболее специфичный метод идентификации микробов и вирусов. ДНК-(РНК)-зонд - это одноцепочечный радиоактивномеченный (32Р и др.) фрагмент ДНК (РНК). Эти фрагменты нуклеиновых кислот получают: а) при рестрикции (расщеплении молекулы на две цепочки) участка ДНК (РНК) известных микроорганизмов, б) путем химического синтеза. Реакция гибридизации состоит из следующих этапов: 1) разрушение исследуемых микробов, денатурация и рестрикция ДНК (нужны одноцепочечные участки) и фиксация на полимерной пленке; 2) внесение ДНК-зонда. Если зонд комплементарен с ДНК исследуемых микробов, то произойдет связывание, т.е. гибридизация, несвязавшиеся зонды удаляют промыванием; 3) учет результатов - с помощью авторадиографии. Другой важной реакцией, основанной на методах генной инженерии является цепная полимеразная реакция (ЦПР), применяемая в медицинской микробиологии, вирусологии, иммунологии. Сущность метода заключается в получении из материала от больного не микроорганизма, а одноцепочечных фрагментов генома (ДНК), его биосинтезе с последующей идентификацией видоспецифических фрагментов молекулярно-генетическими методами. Биосинтез осуществляют в специальных физико-химических условиях. Реакционная смесь содержит матрицу (одноцепочечный фрагмент ДНК исследуемого возбудителя), нуклеотиды, праймеры (т.е. участки ДНК, с которых начинается биосинтез), фермент полимеразу. В результате ЦПР образуются копии ДНК исследуемых микроорганизмов, которые можно идентифицировать в реакции гибридизации. 1.14. Методы изучения нормальной микрофлоры Для изучения нормальной микрофлоры применяют два метода; бактериоскопический и бактериологический. Бактериоскопический метод. Имеет большое самостоятельное значение для тех биотопов организма человека, в которых обитает большое количество различных видов микроорганизмов (полость рта. кишечник, вагина). Он позволяет получить общее представление о составе микрофлоры (преобладание грам/+ или грам/- бактерий той или иной формы - кокки, диплококки, стрептококки, палочки, бациллы, стрептобациллы, фузиформные бактерии, наличие грибов и т.д.), а также выявить те микроорганизмы, которые не удается культивировать на питательных средах. Бактериологический метод. Применяют для биотопов с широким спектром микроорганизмов (полость рта, кишечник, вагина), выполняют с учетом данных бактериоскопии. Основные принципы бактериологического исследования: а) использование качественной (видовой состав) и количественной (количественное соотношение разных видов) оценки микрофлоры; 6) первичный посев материала без предварительного обогащения, так как обогащение нарушает количественные соотношения видов; в) использование большого набора различных питательных сред, подбор условий культивирования (аэробные, анаэробные, атмосфера СО2 и т.д.). Методы взятия материала для исследования: 1. Получение естественных экскретов {слюна, моча и т.д.). 2. Метод реплик; а) отпечатки на поверхности агаровой среды, б) отпечатки марлево-агаровыми пластинами. 3. Метод смывов увлажненным тампоном. 4. Аспирационный метод (из межзубных пространств, гингивальных карманов, из верхних и средних отделов дыхательных путей, аспирация на фильтры). 5. Введение зондов в кишечник. 6. Метод аппликаций - снятие микроорганизмов с помощью бумажных или тканевых пластинок определенной площади. 2. ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 2.1. Микробиологическая диагностика пневмококковых инфекций Пневмококк (Streptococcus pneumoniae) - грамположительный ланцетовидный диплококк, имеет полисахаридную капсулу. Культивируется на средах с белком при рН 7,6 (5% кровяной агар), образует мелкие (средние) уплощенные колонии с а-гемолизом. Лучше растет при насыщении воздуха СО . По типу К-антигена имеет 84 варианта. Чувствителен к химическим и физическим факторам, в частности, к солям желчи (лизис), оптохину, NaCI. К факторам патогенности пневмококка относят капсулу, гиалуронидазу, нейраминидазу, экзопротеазу IgA, О-пневмолизин, лейкоцидин. Патогенен для белых мышей. Пневмококк вызывает острые и хронические заболевания дыхательного тракта (гайморит, бронхит, пневмония), менингит, сепсис, гнойно-воспалительные заболевания, ползучую язву роговицы. Материал для диагностического исследования берут в зависимости от формы пневмококковой инфекции: например, при пневмонии- мокроту, при сепсисе -кровь, при гнойном заболевании-гной, при отите - отделяемое из слухового прохода и т.д. Материал важно забрать до начала этиотропного лечения. Для обнаружения антител исследуют сыворотку крови. С целью лабораторной диагностики применяют следующие методы. I. Экспресс-методы (обнаружение возбудителя в патологическом материале): 1. Микроскопическое исследование- мазок из патологического материала с окраской по Граму. Обнаружение грамположительных капсульных диплококков. 2. Определение антигена капсулы в реакции "Набухание капсулы" (по Нейфельду - феномен увеличения размеров капсулы в присутствии поливалентной противокапсульной сыворотки). Последняя наносится на мазок исследуемого материала; учет с помощью фазовоконтрастного микроскопа. 3. Обнаружение антигена в сыворотке или ликворе (РСК, латекс-агглютинация, встречный иммуноэлектрофорез). Экспресс-методы чаще являются ориентировочными, так как: а) не всегда обнаружение пневмококка свидетельствует о его этиологической роли (часто носительство); б) возбудитель не обнаруживается с началом этиотропного лечения. II. Культуральный (бактериологический) метод: 1 этап. Материал (не позднее 1-2 часов с момента забора) засевают на 5% -и кровяной агар, культивируют в эксикаторе со свечой (СО2) 20-24 часа при температуре 37°С; 2 этап. Отбирают подозрительные колонии, дающие а-гемолиз, микроскопируют (окраска по Граму, на капсулу), отсевают в сывороточный бульон; 3 этап. Определяют чистоту культуры (окраска по Граму). Идентификацию проводят по морфологическим, серологическим (р. агглютинации на стекле с поливалентной противокапсульной сывороткой), культуральным, биологическим свойствам. Последние проводят путем посева в среду с оптохином (нет роста), в 10%-й желчный бульон (лизис), внутрибрюшинного заражения мышей (гибель). При необходимости (например, при пневмонии) доказывают этиологическую значимость пневмококка (в частности, определяют КОЕ/мл). Определяют также чувствительность к антибиотикам. Культуральный метод является ведущим методом диагностики, так как он ранний, точный, чувствительный и позволяет выбрать адекватное этиотропное лечение. III. Серологический метод: определение противокапсульных антител и их динамики в сыворотке крови с помощью РНИФ (с ауто штамма ми), РСК и РИГА (с эталонными штаммами пневмококка). Чаще используют при хронических формах инфекции. Применение метода ограничивается более поздними сроками получения результата и отсутствием готовых диагностикумов. IV. Биологический метод: внутрибрюшинное заражение белых мышей исследуемым материалом (чаще мокротой). Погибших мышей вскрывают, делают мазки-отпечатки, посевы крови и органов на кровяной агар с последующей идентификацией возбудителя. Метод вспомогательный, ограничивается трудоемкостью, наличием в материале других видов микроорганизмов, патогенных для мышей, низкой чувствительностью мышей к некоторым сероварам пневмококка. 2.2. Общие принципы диагностики острых кишечных инфекций, вызываемых микробами семейства энтеробактерий К ним относятся: эшерихиозы, вызываемые условно-патогенными и патогенными (энтеропатогенными, энтерогеморрагическими, энтероинвазивными и энтеротоксигенными) кишечными палочками, брюшной тиф, паратифы А и Б, сальмонеллезы, дизентерия, кишечные клебсиеллезы и кишечные иерсиниозы. Методы их микробиологической диагностики включают следующие принципы: 1. Микроскопический метод диагностики, как правило, не приемлем, так как патогенные и непатогенные энтеробактерий имеют общие морфологические характеристики. 2. Для диагностики применяют бактериологический и серологический методы. Выбор метода диагностики зависит от клинических проявлений, места локализации возбудителя и фазы патогенеза болезни. Например, при брюшном тифе самым ранним методом диагностики является бактериологическое выделение возбудителя из крови - гемокультура, что соответствует этапу патогенеза -"бактериемия" (первая неделя клинических проявлений болезни). Начиная со второй недели, в организме человека формируется гуморальный иммунный ответ, поэтому в эти сроки возможна диагностика, основанная на обнаружении антител (постановка реакции агглютинации по Видалю, РПГА, латексагглютинации). Начиная с третьей недели заболевания, возбудитель вновь оказывается в кишечнике и может быть обнаружен бактериологически в испражнениях больного - "метод копрокультуры". На 6-8-й неделе болезни, а также в период реконвалесценции, для диагностики бактерионосительства следует использовать как бактериологическое, так и серологическое исследования (многократное исследование копрокультуры, холекультуры, иногда миелокультуры и обнаружение Ви-антител в сыворотке или копрофильтратах). Бактериологическая диагностика. 1. Забор материала. Характер материала зависит от первичной или вторичной локализации микроба-возбудителя. Если материалом служат испражнения, что чаще всего бывает, то их берут до начала или после суточного перерыва в антибактериальной терапии. Материал лучше забирать ректальной трубкой, тампоном со стерильной пеленки или стерильной пергаментной бумаги, специальным устройством для забора фекалий (ни в коем случае не допуская его контакта с дезинфектантами). Если материалом служит кровь, то забирают 10,0 мл крови из вены локтевого сгиба. 2. Транспортировка материала осуществляется медицинским работником в системе "стекло, металл" в течение не более трех часов после его забора или в консерванте с сопровождающими документами. 3. Питательные среды, используемые для бактериологического исследования, можно подразделить на три группы: а) среды обогащения, создающие условия преимущественного размножения выделяемого возбудителя и основанные либо на принципе наличия в среде факторов активации роста данного микроба, либо на принципе подавления роста сопутствующих микробов-антагонистов. Первой группе соответствует среда Рапопорт, второй - селенитовая, магниевая, Мюллера, с пенициллином и т.д.; б) средь/ дифференциально-диагностические - плотные питательные среды, содержащие дифференцирующий углевод - лактозу и индикатор. Кишечные палочки, разлагающие лактозу (лактозоположительные), растут в виде окрашенных колоний в зависимости от типа среды - в малиново-красный и розовый (среда Эндо, Плоскирева) или темно-синий (среда Левина) цвет. Клебсиеллы пневмонии разлагают лактозу в среде с индикатором бромтимоловым синим и образуют колонии желтого цвета, в то время как колонии лактозоотрицательных биоваров формируют колонии цвета среды. Сальмонеллы и шигеллы на средах Эндо, Левина, Плоскирева также не разлагают лактозу и дают бесцветные колонии; в) среды накопления чистой культуры. Чаще применяется среда Олькеницкого (трехсахарный агар). Она состоит из столбика, скошенной части и включает лактозу, глюкозу и сахарозу, индикатор, реагенты для определения сероводорода и уреазы. Посев производят уколом в столбик и штрихом по поверхности скошенной части. При росте микробов глюкоза лучше разлагается в столбике, лактоза - на скосе, в результате чего дифференцированно меняется цвет среды. При образовании газа - формируются пузырьки и разрывы в среде, при продукции сероводорода - наблюдается почернение по ходу укола, при продукции уреазы - изменение цвета среды на оранжевый. 4. Идентификация выделенных культур основана на определении:
Антигенную структуру определяют по предварительному установлению серогруппы, чаще с монорецепторными адсорбированными сыворотками, а затем серовара тоже с адсорбированными сыворотками. Серологическая диагностика: начинается с получения сывороток от больных. В них обнаруживаются антитела в реакции агглютинации, гемагглютинации, латекс-агглютинации или РСК. Диагноз основан на обнаружении антител в диагностическом титре или нарастании титра антител в динамике болезни. 2.3 Диагностика кишечных эшерихиозов (колиэнтеритов) Цель: выделение чистой культуры эшерихии и отличие ее от условнопатогенных представителей нормальной микрофлоры кишечника. Метод: бактериологический. Материал для исследования: фекальные массы. Схема работы: 1-й этап - посев на среду Эндо (Левина); 2-й этап: а) обнаружение окрашенных колоний, микроскопия их по Граму; б) предварительная дифференциация патогенных эшерихии от условнопатогенных (постановка РА на стекле со смесью сывороток к патогенным серогруппам); в) положительно реагирующая в РА колония отсевается на среду Олькеницкого; 3-й этап; а) учет изменения среды Олькеницкого (посинение и разрыв всей среды); б) определение чистоты выделенной культуры; в) определение серовара патогенной эшерихии (путем постановки РА с отдельными ОК-сыворотками на стекле и в пробирках с живой (определение К-антигена) и убитой кипячением (определение О-антигена)культурой; г) проба на индол, подвижность и чувствительность к антибиотикам. Серологический метод - постановка РА с сывороткой больного (на 2-ой неделе заболевания). 2.4. Диагностика брюшного тифа, паратифов А и В, сальмонеллезов Метод: бактериологический. Материал для исследования см. выше. Схема работы (выделение гемокультуры); 1-й этап - посев 10 мл венозной крови в среду Рапопорта; 2-й этап; а) учет среды Рапопорта (покраснение среды без газа в поплавке -возбудитель брюшного тифа, покраснение с газом в поплавке -возбудители паратифов или сальмонеллезов); б) микроскопия роста; в) пересев на среды Левина или Плоскирева; 3-й этап; а) обнаружение бесцветных колоний на этих средах; б) микроскопия колоний: в) пересев на среду Олькеницкого; 4-й этап: а) учет роста на среде Олькеницкого (см. выше); б) определение чистоты выделенной культуры; в) установление антигенной структуры. Сначала в РА на стекле с монорецепторными сыворотками к О-антигенам (для группы А - Q2, группы В - 04, 5; группы Д - Н-О9), затем в такой же реакции с сыворотками к специфическим антигенам (в пределах данной группы); г) определение дополнительных биохимических и морфологических свойств (разложение индола, подвижность); д) определение чувствительности к поливалентным видоспецифическим бактериофагам; е) определение чувствительности к антибиотикам. |