Методичка по микробиологии для иностранных учащихся. Под редакцией профессора Л. П. Титова
 Скачать 0.93 Mb.
|
|
I. Гепатит А (гА). Лабораторная диагностика гА основывается либо на выявлении самого возбудителя (метод иммунной электронной микроскопии - ИЭМ), его антигенов (радиоиммунный, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный метод - РИА, ИФА, ИФ), или антител к вирусу гА (РИА, ИФА). Для ранней диагностики заболевания, а также выявления источников инфекции, используется определение антигена вируса гА в фекалиях больных, где он появляется за 7-10 дней до клинических симптомов и в первые дни заболевания. Из определяемых в настоящее время специфических маркеров гА важнейшими являются антитела класса Ig M к вирусу гА, которые появляются в сыворотке крови и слюне уже в начале заболевания и сохраняются в течение 3-6 месяцев. Обнаружение антител класса Ig M к вирусу гА однозначно свидетельствует о гепатите А и используется для диагностики заболевания, в том числе и бессимптомных случаев инфекции и выявления источников инфекции в очагах. Антитела к вирусу гА класса Ig G выявляются с 3-4-й недели заболевания и сохраняются длительно, что позволяет оценить состояние иммунитета населения, динамику специфического гуморального иммунитета. Вирус гепатита А в материале от больного можно выявить методом иммунной электронной микроскопии. В основе метода лежит смешивание суспензии вируса с антисывороткой, отделение иммунных комплексов и исследование их в электронном микроскопе. II. Гепатит В (гВ). В организме людей, зараженных вирусом гВ, с разной частотой и на разных этапах могут выявляться серологические маркеры: поверхностный HBs Ag и сердцевинный НВс Ад и НВе Ад, а также антитела к ним (anti-HBc, anti-HBe, anti-HBs). Динамика их появления представлена на рис. 1.  Рис. 1. Динамика появления серологических маркеров гВ Все антигены и соответствующие им антитела могут служить индикаторами инфекционного процесса. Наличие HBs Ag, НВс Ag и anti-HBc класса Ig M свидетельствует об остром периоде инфекции. В период реконвалесценции - это НВс-антитела класса Ig G и выявляются они совместно с Hbs-антителами. Длительное присутствие НВе Ад и HBs Ад в крови - неблагоприятный признак, свидетельствующий о формировании хронического процесса. При формировании длительного носительства постоянно определяется HBs Ag. Для обнаружения антигенов и антител используют РПГА, РИА и ИФА. Для обнаружения Hbs Ag широко используется РОПГА - реакция обратной пассивной гемагглютинации с обязательным положительным контролем на HBs Ag. III. Гепатит С (гС). Вызывается РНК-содержащим вирусом, который относится к Flaviviridae. Диаметр вирионов 30-60 нм, чувствительны к обработке хлороформом. Позитивная одноцепочечная РНК кодирует синтез трех структурных и пяти неструктурных белков. Гепатит С по клинико-биохимическим признакам сходен с гепатитом В. У 50% инфицированных лиц заболевание переходит в хроническую форму, а у 20% хронических больных развивается цирроз печени. Механизм передачи вируса гепатита С в основном парентеральный. Лабораторная диагностика гС основана на определении антител к вирусу гС методами ИФА или РИА. VI. Возбудитель гепатита дельта (гепатит Д). РНК-содержащий, дефектный вирус, способный реплицироваться в организме хозяина лишь при обязательном участии вируса-помощника, роль которого выполняет вирус гВ. Оболочку вируса-дельта формирует HBs Ag. Присоединение дельта-инфекции к гВ ведет к развитию тяжелых злокачественных форм болезни, хронических форм заболевания с ранним формированием цирроза печени. Лабораторная диагностика гепатита Д проводится путем обнаружения маркеров вируса гВ и дельта-вирусной инфекции, HBs Ag, anti-HBc (Ig M) и дельта Ag. Последние тестируются при помощи ИФА и РИА. Наибольшее диагностическое значение имеют антидельта IgM, которые обнаруживаются в течение всего заболевания. V. Гепатит Е. Широко распространен в тропических и субтропических странах, распространение заболевания проходит водным путем. Вирион диаметром 27-32 нм содержит однонитчатую РНК, по физико-химическим свойствам схож с вирусами семейства Caliciviridae. Лабораторная диагностика основана на определении AT в сыворотке крови ИФА. 3.4. Лабораторная диагностика СПИДа При диагностике ВИЧ-инфекции необходимо: 1. Определение наличия вируса или его антигенов в материале от больного (вирусологическими методами или ИФА). 2. Серологическая диагностика. Выявление специфических антител к поверхностным (gp.120;gp.41) и внутренним (р.24;р.17) антигенам ВИЧ. 3. Выявление патогномоничных (специфических) для ВИЧ-инфекции изменений в иммунной системе. 4. Определение возбудителей СПИД-ассоциированных заболеваний. Вирусологическая диагностика. Материал для выделения ВИЧ: Т-лимфоциты крови, лейкоциты костного мозга, лимфотические узлы, ткани мозга, слюна, сперма, спинномозговая жидкость. Полученным материалом заражают перевиваемую культуру Т-лимфоцитов (Н9). Индикацию ВИЧ в культуре клеток проводят по ЦПД (образование симпластов), а также методами иммунофлюоресценции, электронной микроскопии, по выраженной активности обратной транскриптазы. Современные методы исследования позволяют обнаружить один инфицированный лимфоцит на 1000 клеток. Точными и достоверными являются методы гибридизации нуклеиновых кислот. Они основаны на способности одноцепочечных комплементарных нитей нуклеиновых кислот, меченых радиоизотопом или ферментом (зондов), образовывать с вирусспецифическими нуклеиновыми кислотами из исследуемого материала двунитчатые структуры. Эти методы дают возможность идентифицировать одну вирусную частицу в 10 мл. крови, содержащей ВИЧ. Выявление вирусных антигенов в инфицированных Т-лимфоцитах осуществляют с помощью моноклональных антител. Однако это можно выполнить только в крупных лабораториях. Серологическая диагностика. В настоящее время получила наибольшее распространение. Материал для исследования: 5 мл. гепаринизированной крови, которую до доставки в лабораторию можно хранить 6-8 часов в охлажденном, но не в замороженном состоянии. С целью серологической диагностики СПИДа используют прежде всего методы иммуноферментного анализа со стандартными иммуноферментными системами (ИФА). Это скрининговый метод. Принцип работы основан на классическом принципе прямого ИФА. Иммуносорбентом являются полистироловые планшеты с иммобилизированным инактивированным вирусспецифическим антигеном, полученным из ВИЧ, либо синтетическим путем. Затем вносят испытуемую сыворотку в разведении. Проводят инкубацию в лунках с антигеном. После связывания АГ с AT следует трехкратное отмывание несвязавшихся белков, а после этого в лунки вносят коньюгат антител к иммуноглобулинам человека с ферментной меткой. Образование специфического комплекса АГ+АТ выявляют внесением субстрата для фермента (раствор ортофенилендиамина и перекиси водорода). В результате окраска среды меняется пропорционально количеству антител. Результаты исследования учитывают на спектрофотометре. Сыворотки крови, имеющие вирусспецифические антитела по данным ИФА, в дальнейшем необходимо исследовать методом иммунного блотинга. Иммунный блотинг является подтверждающим тестом. Он основан на предварительном фракционировании по молекулярной массе (разделении) белков ВИЧ электрофорезом в полиакриламидном геле с последующим перенесением антигенов на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем на мембрану наносится испытуемая сыворотка. При этом специфические антитела образуют комплекс с конкретным АГ(др.120, др.41, р.24, р.18). Заключительный этап исследования - выявление антител к различным белкам ВИЧ. Для этого в систему добавляют антитела против белков человека, меченые ферментом или радиоизотопной меткой. Таким образом, в сыворотке пациента выявляют (либо не выявляют) вирусспецифические антитела ко всем или большинству антигенов ВИЧ. Исследования иммунного статуса. Направлены на выявление: 1) уменьшения CD4/CD8 (в N 2 и >, при СПИДе - 0,5 и <); 2) снижения CD4 клеток (<200 клеток/мл.); 3) наличия одного из лабораторных признаков, включающих анемию, лейкопению, тромбоцитопению, лимфопению; 4) повышения концентрации Ig А и Ig G в сыворотке крови; 5) снижения реакции бласттрансформации лимфоцитов на митогены; в) отсутствия кожной реакции ГЗТ на несколько антигенов; 7) повышения уровня циркулирующих иммунных комплексов. 4. Другие инфекции 4.1. Классификация грибов. Методы диагностики микозов Классификация грибов. 1. Ботаническая - за основу берется строение органов полового воспроизводства и внешний вид гриба. Номенклатура - бинарная. Имеет 6 классов: 1 Оомицеты - непатогенные для человека, низшие грибы. 2 Хитридиомицеты - непатогенные для человека грибы, с несептированным мицелием. 3 Зигомицеты - грибы с несептированным мицелием. Среди них есть возбудители заболеваний человека и животных. 4 Аскомицеты (аско - сумка) - грибы с септированным мицелием, есть патогенные для человека и животных. 5. Базидомицеты - шляпочные грибы. Могут быть причиной пищевых отравлений - микотоксикозов. 6. Дейтеромицеты - несовершенные грибы, у которых не выявлен половой путь размножения. Среди них есть большинство возбудителей заболеваний человека и животных. II. Клиническая (в скобках названы роды возбудителей): 1. Кератомикозы (Trichophyton, Trichosporon). 2. Дерматомикозы (Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton). 3. Кандидозы (Candida). 4. Глубокие микозы (Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces, Criptococcus, Sporotrichum, Mucor, Penicillium, Aspergillus). 5. Псевдомикозы (возбудителями являются бактерии, но клинические проявления заболеваний, как при микозах). Методы диагностики микозов Материал для исследования: свежие развившиеся поражения, где больше элементов гриба. Пораженные волосы берут эпиляционным пинцетом, элементы гладкой кожи, чешуйки - скальпелем. При поражении ногтей производят соскоб скальпелем или отрезают кусочек ногтя маникюрными ножницами. Соскобы со слизистой оболочки выполняются шпателем. Все остальные материалы - как обычно (при бактериологическом исследовании). Микроскопическое исследование (неокрашенные (нативные) препараты; окрашенные препараты): предварительно материал просветляют -обрабатывают 10-30%-м раствором щелочи в течение 20 минут или разводят в физрастворе. Чтобы сконцентрировать материал, его центрифугируют. Нативные препараты: каплю материала наносят на предметное стекло, добавляют раствор Люголя или спиртовой раствор глицерина (по 50% каждого), накрывают покровным стеклом и исследуют в фазовоконтрастном или световом микроскопе. Окрашенные препараты: готовят обычным способом; фиксация - только жидким фиксатором; окрашивают по Граму, Циль-Нильсену, Романовскому-Гимзе и специальными методами. Микологическое исследование: включает все этапы культурального метода (выделение чистой культуры и идентификацию). Для удаления бактериальной флоры материал предварительно обрабатывают антибиотиками широкого спектра действия. Засевают на специальные среды с кислой рН и культивируют при пониженной температуре (26-30°С). Колонии вырастают через несколько дней. Их изучают под малым и большим увеличением микроскопа. Идентификация - на основании морфологических признаков. Большинство питательных сред для грибов готовят на основе среды Сабуро (водопроводная вода + агар-агар + пептон + мальтоза). Экспериментальное исследование: применяют для оценки патогенное выделенного гриба-возбудителя. При заражении используют чистые культуры или патологический материал. Подбор животных, техника введения материала, этапы работы - такие же, как в бактериологии. Иммунологические исследования (серологический и аллергологический методы): такие же, как в бактериологии. Гистологическое исследование: такое же, как в бактериологии (мазки-отпечатки, срезы), однако изучают не только морфологию гриба, но и реакцию ткани на возбудителя, глубину поражения. Лабораторная диагностика поверхностных микозов (кератомикозов, дерматомикозов) 1. Микроскопия патологического материала. 2. Выделение чистой культуры гриба и идентификация по морфологии. Лабораторная диагностика кандидомикоза 1. Микроскопия патологического материала. 2. Выделение чистой культуры: количественный посев материала несколько раз с промежутками в 5-7 дней. Если кандиды обнаруживаются многократно в количестве 103 на г. исследуемого материала и более, то диагноз кандидомикоза подтверждается. 3. Серологический метод: используется РСК и РА (диагностический титр антител 1:160) и РПГА (1:1600). Ставят также РП с белковыми и полисахаридными антигенами кандид. 4. Аллергологический метод (внутрикожные пробы по типу реакции Манту). 5. Выделенную культуру проверяют на вирулентность на белых мышах. Если доза до 1 млн клеток кандид вызывает гибель мыши, культура считается вирулентной. Лабораторная диагностика глубоких микозов, I. Криптококкоз: 1. Микроскопия патологического материала. 2. Выделение чистой культуры. 3. Серологическая диагностика (РА, РП, РСК, РПГА). Эти реакции редко бывают положительными. 4. Выявление капсульного криптококкозового антигена в крови и ликворе Сольных с помощью РП. б Заражение белых мышей. II. Кокцидиоидоз:
если через 24-48 часов эритема больше 0,5 см. III. Гистоплазмоз: 1. Микроскопия патологического материала. 2. Выделение чистой культуры. 3. Серологическая диагностика: первые три месяца в РСК и РП выявляются анти-h-антитела (это острый процесс). Позже трех месяцев в РСК и РА выявляют анти-m-антитела (хронический процесс). 4. Кожная проба с гистоплазмином. 4.2. Возбудители мадуромикоза Мадуромикоз (мадурская стопа) - хроническое гранулематозное заболевание, вызываемое актиномицетами (Actinomyces, Nocardia) или грибами (Pseudoallescheria boydii, Aspergillus, Madurella). Встречается преимущественно в тропических и субтропических странах. Возбудители проникают в организм из почвы через микротравмы кожи. Процесс локализуется в стопе, реже - в кисти. Болезнь начинается с появления мелких плотных узелков (гранулем), которые в последующем сливаются в один очаг с вовлечением в воспаление кожи, подкожной клетчатки, сухожилий, костей. Гранулематозный очаг распадается с образованием гноя, который через многочисленные свищи вытекает наружу. Наряду с распадом ткани происходит разрастание фиброзной ткани. Пораженная стопа увеличивается в размерах, деформируется, приобретая вид "медвежьей лапы". Болезнь нередко осложняется присоединением гноеродной инфекции. Самостоятельное выздоровление наблюдается редко. Материалом для микробиологического исследования является гной, кусочки биопсированной ткани. В материале отыскивают друзы - бесцветные или пигментированные зерна, из них готовят мазки, как при актиномикозе. Мицелий грибов по сравнению с мицелием актиномицетов толстый (2-5 мкм), ветвистый, септированный, содержит много хламидоспор, друзы пигментированы. Мицелий актиномицетов тонкий (0,5-2,0 мкм), несептированный, ветвящийся. Центр друзы состоит из поли- и мононуклеарных клеток и войлокообразного скопления мицелия, от которого на периферию отходят гифы с реактивно-утолщенными концами ("дубинки"). Выделение и идентификация возбудителя проводится, как при актиномикозах и грибковых поражениях кожи. Чистые культуры грибов выделяют на среде Сабуро, пивном сусло-агаре. Выращивают в аэробных и анаэробных условиях при температурах 20-25°С и 37°С. Одновременно материал исследуют на гноеродные бактерии. 4.3. Возбудитель пневмоцистоза Пневмоцистоз - заболевание, вызываемое пневмоцистами (Pneumocystis carinii). Одноядерные трофозоиты имеют форму неправильной дольки и варьируют в размерах от 1 до 5 мкм; содержат митохондрии, эндоплазматический ретикулум, различные гранулы и вакуоли. Размножаются бинарным делением. Более крупные трофозоиты окружены толстой стенкой, в результате чего формируется циста. В последней происходит деление ядра и цитоплазмы трофозоита с образованием от 2 до 8 клеток (спорозоитов). Диаметр цисты около 10 мкм. После разрыва ее стенки выходят спорозоиты, и начинается новый цикл размножения трофозоитов. Пневмоцисты обитают в альвеолах легких здоровых людей (1-10%), прикрепляясь к альвеолярному эпителию. При пневмоцистозе поражаются межальвеолярные перегородки с развитием хронической интерстициальнои пневмонии. Альвеолы и бронхиолы заполняются пенистой массой, в результате чего нарушается газообмен и наступает кислородная недостаточность. Развивается картина хронической пневмонии. Заболевание связано с недостаточностью иммунной системы, что объясняет наиболее частое поражение грудных, особенно недоношенных и ослабленных детей (чаще в закрытых детских коллективах). Возможно длительное носительство. Пневмоцистоз у взрослых осложняет иммунодефицитные состояния (туберкулез, опухоли, СПИД). Пневмоцистоз - инфекция дыхательных путей с воздушно-капельным механизмом передачи. Материал для исследования: слизь, полученная методом ларингоскопии, либо катетером, либо при глубоком откашливаний (после предварительной инголяции водяного пара). Материал берут не ранее второй недели болезни. При летальном исходе изучают гистологические среды и мазки-отпечатки легких. Микроскопический метод исследования (основной метод диагностики): препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе. Наиболее типично обнаружение восьмиядерных цист паразита. Пневмоцисты приобретают фиолетовый цвет, ядра - темно-синий. Препараты можно обрабатывать также люминесцентной сывороткой. |