Методичка по микробиологии для иностранных учащихся. Под редакцией профессора Л. П. Титова
 Скачать 0.93 Mb.
|
|
Заключение. По совокупности признаков в сравнении со свойствами эталонных (типовых) штаммов указывается вид выделенного из материала микроорганизма. Оценка метода: достоинства: относительно высокая чувствительность и точность, возможность определить численность микробов в исследуемом материале, а также чувствительность к антибиотикам; недостатки: относительная длительность, метод дорогостоящий. 1.5. Методы выделения чистых культур микроорганизмов 1. Метод механического разобщения микроорганизмов: а) посев материала на чашки Петри шпателем или петлей (см. Практикум); б) посев пластинчатыми разводками - готовят десятикратные разведения материала в расплавленном и остуженном до 45°С МПА, а затем выливают содержимое пробирок в стерильные чашки Петри, дают агару застыть и инкубируют чашки в термостате; в) разобщение на основе подвижности микробов. Материал засевают в каплю конденсационной жидкости скошенного МПА. При этом подвижные микробы как бы "мигрируют" вверх по агаровому скосу и располагаются в верхней части агара. При 2-3-кратном пассировании этих колоний в конденсационную жидкость скошенного агара удается получить чистую культуру подвижного микроба (например, протея); г) разобщение на основе различий в размерах микроорганизмов. Для этого смесь микроорганизмов фильтруют через микро- и миллипористые фильтры. Чистые культуры получают, как правило, в фильтратах. Этот метод используют для получения чистых культур вирусов и микоплазм. 2. Метод заражения чувствительных лабораторных животных (биологический): основан на избирательной чувствительности организма животного к микробам различных видов, что выражается в быстрой скорости размножения определенного вида при попадании его в кровь и внутренние органы, откуда его и выделяют. В то же время другие виды микробов погибают под действием защитных факторов организма. Таким образом выделяют, например, чистую культуру пневмококков из организма белой мыши, палочки туляремии из организма морской свинки. 3. Методы, основанные на избирательной чувствительности микроорганизмов к воздействию внешних факторов: а) температура - спорообразующие микробы выживают при нагревании смеси микробов, в то время как неспорообразующие – гибнут б) кислоты - при обработке смесей кислотоустойчивых и неустойчивых к кислотам микробов последние гибнут, а кислотоустойчивые остаются, как правило, в чистой культуре. Так выделяют возбудителя туберкулеза; в) антибиотики - при посеве смеси микробов на среду с добавлением антибиотика вырастают нечувствительные к нему микробы; г) анаэробные условия - позволяют отделить группу анаэробных микроорганизмов от облигатных аэробов. 1.6. Определение биохимических свойств микробов Этот метод предусматривает изучение ферментативной деградации различных субстратов (углеводов, аминокислот и белков, мочевины, перекиси водорода и др.) с образованием промежуточных и конечных продуктов. Карбогидразы - ферменты, разлагающие углеводы. Определяя карбогидразы, выявляют т.н. сахаролитические свойства микробов. С этой целью используют следующие среды: а) среды Гисса (жидкие и полужидкие с индикаторами). В качестве последних используют реактив Андреде, бромтимоловый синий или ВР О ферментативной активности бактерий судят по изменению цвета среды и образованию газа; б) дифференциально-диагностические среды с лактозой (Эндо, Левина. Плоскирева и др.); в) полиуглеводные среды (типа Олькеницкого, Клиглера и др.). Протеазы -ферменты, разлагающие белки: а) исследуемая культура может расщеплять белки субстрата с образованием пептона, альбумоз, аминокислот. Этот процесс идет за счет ферментов-протеиназ и пептидаз. Для выявления указанных ферментов исследуемую культуру засевают на ряд сред: свернутая сыворотка, столбик желатина (разжижение в положительных случаях), молочный агар в чашке Петри (в положительных случаях вокруг колоний появляются зоны помутнения); б)расщепление аминокислот микробами может идти путем декарбоксилирования, либо путем дезаминирования. В первом случае из той или иной аминокислоты образуются амины, которые выявляются либо методом элекрофореза. либо по подщелачиванию среды. О наличии дезаминаз у микроба судят по образованию аммиака в среде как результат процесса дезаминирования аминокислоты; в) расщепление аминокислоты триптафана за счет действия фермента триптафаназы сопровождается образованием индола. Последний выявляется с помощью бумажки, смоченной щавелевой кислотой и укрепленной под пробкой над питательной средой. В положительныхслучаях бумажка краснеет; г) для выявления ферментов расщепления серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) ставят пробы на H2S, как Продукт расщепления этих аминокислот десульфуразами. Наличие H2S выявляется и в среде Олькеницкого; д) для выявления уреазы - фермента, расщепляющего мочевину, в питательную среду нейтральной рН добавляют мочевину и индикатор. В положительных случаях среда изменяет цвет за счет сдвига рН в щелочную сторону в связи с образованием аммиака. Липазы - ферменты разложения липидов и липоидов. Чаще всего определяют лецитиназу посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид. В этих случаях при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность. Ферменты-токсины: Гемолизины - ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают b-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний, а-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как д-гемолиз. Цитотоксины - ферменты, оказывающие токсический эффект на клетки мишени. Например, цитотоксичность токсина анаэробных микрорганизмов определяют на культуре клеток. С этой целью 1 г материала (испражнения или др.) разводят в фосфатном буфере 1:10 масса/объем, центрифугируют ЗО мин при 4ООО об/мин. Супернатант фильтруют на фильтре 2О нм, вносят в монослой культуры клеток МакКоя и инкубируют при 37°С 24-48 часов до достижения токсического эффекта. Иммунохимическое определение продукции токсинов: используется, как правило, иммуноферментный метод определения многих экзотоксинов -дифтерийного, холерного, стафилококкового и др. Для этого применяются тест-системы на основе моноклональных антител к определенному экзотоксину. Ппазмокоагулаза - фермент, свертывающий плазму крови животных. Определяют в пробирочной реакции. В1 мл цитратной плазмы кролика или человека (цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором) размешивают петлю суточной агаровой культуры микроба. Смесь инкубируют в термостате при 37°С. В положительных случаях через 2-4 часа плазма свертывается (появляется сгусток). Лецитиназа - см. выше. Оксидо-редуктазы: 1. Определение оксидаз. На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 мин). 2. Определение каталазы. Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки кислорода. 3. Определение дегидраз. О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки). К столбику сахарного агара (донатор водорода) добавляют краситель (акцептор водорода) и засевают микробную культуру уколом. В положительных случаях растущий на такой среде микроб ее обесцвечивает. 4. Определение спектра короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), Анаэробные микроорганизмы продуцируют промежуточные продукты, включающие короткоцепочечные жирные кислоты и спирты, спектр (профиль) которых различен у разных видов микроорганизмов и позволяет проводить идентификацию микроорганизмов до уровня рода. Наиболее часто исследуют уксусную, пропионовую, бутиловую, изобутиловую, валериановую, изовалериановую, капроновую и изокапроновую кислоты. Для определения КЦЖК используют метод газожидкостной хроматографии. Идентифицируют такие микроорганизмы как актиномицеты, пролионибактерии, эубактерии, бифидобактерии, клостридии. В последние годы а бактериологических лабораториях применяются коммерческие тест-системы для быстрой биохимической идентификации (определение биохимической активности разных групп микроорганизмов): например, 2О тестов для энтеробактэрий и ЗО тестов для анаэробов. Схема идентификации включает следующие этапы: Колонии ---- Приготовление ---- Внесение ----- Инкубация ---- Учет(+ -) ---- Интер- суспензии суспензии 4 часа 37°С претация в среду В качестве материала для идентификации используют хорошо изолированную колонию на чашке или чистую культуру в пробирке, из которой готовят суспензию в концентрации стандарта оптической плотности N4, затем по 55 мкл суспензии вносят в лунки со средами данной тест-системы. Планшета со стрипами инкубируется при 37°С 4 часа. Учет может осуществляться автоматически (используя прибор "АТВ") или визуально Результат биохимической реакции оценивают в виде "+" или "-" и вносят о референс-таблицу, в которой положительному результату соответствует численное выражение, в результате чего получается определенный числовой профиль, соответствующий специапьно разработанному индексу аналитического профиля, позволяющему быстро идентифицировать тот ипи иной микроорганизм.    1.11. Биологический (экспериментальный) метод исследования Биологический метод исследования - совокупность способов искусственного воспроизведения клинической картины инфекционных болезней или их синдромов на лабораторных животных. Этот метод преследует также ряд других целей:
2. Выделение и идентификация чистой культуры. 3. Определение вирулентности. 4. Выделение и идентификация экзотоксинов. 5. Культивирование вирусов. 6. Получение иммунопрепаратов. 7. Проверка безвредности и эффективности лечебных препаратов (в т.ч. химиопрепаратов, иммунопрепаратов) и другие. Этапы метода: 1. Забор материала (виды материала см. Бактериоскопический метод), 2. Обработка материала. 3. Выбор лабораторного животного, исходя из его чувствительности к предполагаемому возбудителю, его стандартизация и маркировка. 4. Заражение животных одним из способов (подкожный, внутрикожный, внутрибрюшинный, внутримышечный, интрацеребральный, внутривенный, в желудок, интраназальный и др.) в зависимости от тропизма микроба. 5. Регистрация признаков болезни зараженного животного или его смерти. 6. Прижизненный забор материала от животного и проведение бактериологического и серологического исследования, постановка аллергической пробы. 7. Вскрытие, изучение патологоанатомической и патоморфологической картины, протокольный посев органов павших или убитых животных (для выявления обсемененности и выделения чистой культуры). Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов. 8. Идентификация выделенной культуры. 9. Заключение по результатам исследования. Оценка метода: Метод высокочувствителен, может быть использован на ранних этапах болезни, но не всегда доступен, дорог, длителен, небезопасен. 1.12. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам применяют три метода: диффузии препарата в агар из бумажных дисков, серийных разведении в бульоне и в плотной питательной среде. Имеются также ускоренные методы. 8 качестве критерия чувствительности микробов к антибиотикам избирают их терапевтические концентрации в крови и других биотопах животного организма после введения определенных доз препарата. Мерой чувствительности микробов является минимальная концентрация препарата(мкг/ед/мл), которая подавляет рост микробов на питательных средах в стандартных условиях постановки опыта (минимальная подавляющая концентрация - МПК). Метод бумажных дисков. Для его проведения нужны стандартные заводские диски, пропитанные антибиотиками в определенной концентрации, и стандартная питательная среда. Из суточной микробной культуры готовят взвесь на физрастворе (густота 1 млрд микробных тел в 1 мл), которую затем разводят в 10 раз. На поверхность плотной среды наливают 1 -2 мл указанной культуры и покачиванием чашки равномерно распределяют ее по всей поверхности среды. Остаток удаляют пипеткой. Среду подсушивают 10-15 мин при комнатной температуре, после чего на поверхность газона стерильным пинцетом накладывают диски (не более 6 на чашку) на расстоянии 2 см друг от друга и от краев чашки. Инкубируют в термостате при 37°С - 24 часа. Учет: в падающем свете на фоне темной поверхности измеряют диаметр (с учетом диаметра диска) задержки роста. Оценку результатов проводят по специальной таблице путем сопоставления диаметра зон задержки роста испытанной культуры с пограничными значениями диаметра зоны в таблице. Культуру относят к одной из трех категорий: чувствительная, умеренно-чувствительная и устойчивая. Указанные категории предложены клинической химиотерапией, исходя из отношения между МПК и концентрацией препарата в крови при введении терапевтических доз. К чувствительным относят культуры, рост которых подавляется концентрациями препарата, создаваемыми в сыворотке крови больного в процессе назначения обычных доз антибиотика. Умеренно-устойчивыми считаются культуры, подавляемые концентрациями, которые могут быть достигнуты при введении максимальных доз препарата. Устойчивые - культуры, рост которых не подавляется при введении даже максимально допустимых доз препарата. Указанный метод является полуколичественным. Для получения количественных результатов используют методы серийных разведении. Метод серийного разведения антибиотика в бульоне. Готовят ряд убывающих разведении антибиотика в пробирках с бульоном (кратные 2) и добавляют испытуемую культуру. Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотика. Через сутки инкубации в термостате определяют МПК, которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста. Для определения бактерицидного действия из нескольких пробирок с задержкой роста делают высев петлей на сектора чашки Петри с МПА. За бактерицидную концентрацию принимают концентрацию препарата в последней пробирке, высев из которой не дал роста. Метод серийных разведении в плотной питательной среде. Этот метод более чувствителен и точен. Каждый антибиотик испытывают в трех концентрациях (исходя из уровней чувствительности микроорганизмов), которые добавляют к расплавленному и охлажденному агару. Агар с антибиотиками разливают в три чашки Петри (по одной чашке на каждую концентрацию). Контролем служит чашка с агаром без антибиотика. Посев производят петлей или лучше штампом-репликатором, который позволяет одновременно определить чувствительность к трем концентрациям антибиотика 25-50 культур (в зависимости от числа лунок в штампе). Учет роста о термостате осуществляют спустя сутки. Культура считается чувствительной, если на месте посева нет ни одной колонии. Микроорганизмы, рост которых подавлен всеми 3 концентрациями, рассматривают как чувствительные (в этом случае можно применять антибиотик в терапевтической дозе); 2-й и 3-й концентрациями как среднечувствительные (антибиотик можно применять только в увеличенной дозе); 3-й как умеренно-устойчивые микроорганизмы (антибиотик можно применять только местно); растущие на всех трех концентрациях относят к устойчивым (антибиотик нельзя применять). Схема определения чувствительности культуры к пенициллину.
Ускоренные методы. Позволяют получить результат через 3-4 часа. Чаще всего пользуются методом, основанным на изменении окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) среды в процессе роста микроба в присутствии антибиотика. Ход работы: при использовании метода бумажных дисков или серийных разведении антибиотика в агаре через 4-6 часов роста культуры поверхность чашки обрабатывают индикатором, реагирующим на ОВП среды (тетразолий хлорид). В местах роста микроба среда окрашивается в красный цвет, при отсутствии роста микроба цвет среды не меняется. Учет и критерии оценки, как и при обычных методах. В последние годы разработана специальная тест-система ускоренного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (посев тест-микроба в жидкую среду с антибиотиком, инкубация 4-6 часов с последующим определением прироста мутности раствора опытных образцов в сравнении с контрольными). | |||||||||||||||||||||||||||||||||||