Методичка по микробиологии для иностранных учащихся. Под редакцией профессора Л. П. Титова
 Скачать 0.93 Mb.
|
|
Диагностика хеликобактериоза: несколько отличается от кампилобактериоза: Материал: биоптаты. Гомогенизация материала. Почти не применяется бактериологический метод. Для диагностики используется комплексная микроскопия и определение уреазы в исследуемом материале. Хеликобактеры плохо красятся по Граму и не красятся простыми методами, поэтому используют специальные методы окраски. Исследования проводят также в фазово-контрастном и люминесцентном микроскопе. 2.9. Диагностика пищевых отравлений бактериальной природы Пищевые отравления - острые системные заболевания, возникающие в результате приема в пищу продуктов, массивно обсемененных микроорганизмами или содержащих микробные экзотоксины. Пищевые отравления бактериальной природы подразделяются на пищевые токсикоинфекции и пищевые токсикозы (интоксикации), а также отравления смешанной этиологии. Пищевые токсикоинфекции (ПТИ): острые кишечные заболевания с инфекционным воспалением кишечника, возникающие в результате употребления в пищу массивно обсемененных некоторыми бактериями продуктов. Возбудителями могут быть условнопатогенные представители семейства Enterobacteriaceae - E.coli, Proteus (P.vulgaris, P.mirabilis, Morganella morganii), Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella pneumoniae; семейства Vibrionaceae - V.parahaemolyticus; семейства Bacillaceae - B.cereus, C.perfringens серотипа А; семейства Streptococcaceae - S.faecalis; семейства Pseudomonadaceae - P.aeruginosa и др. После приема пищи возбудитель бурно размножается в тонком кишечнике, проникает в лимфоидный аппарат, где происходит его массовая гибель с выделением эндотоксина. Последний вызывает поражение интрамурального нервного аппарата кишечника и клеток ЦНС, сосудов, а бактерии вызывают воспалительный процесс в кишечной стенке. Заболевание начинается внезапно с тошноты, рвоты, поноса, болей в животе и общих симптомов (головная боль, падение сердечной деятельности, вплоть до коллапса). По типу ПТИ могут протекать заболевания, вызываемые энтеропатогенными эшерихиями, сальмонеллами, шигеллами (S.sonnei) и иерсиниями (Y.enterocolitica). При этих инфекциях клинический диагноз ставится соответственно их нозологической форме: колиэнтерит, сальмонеллез, дизентерия, иерсиниоз. Диагноз устанавливается после выделения из исследуемого материала (испражнения, моча, рвотные массы, остатки пищи) соответствующего возбудителя. Пищевые микробные токсикозы (интоксикации): острые заболевания, возникающие при употреблении в пищу продуктов, в которых в результате массивного размножения микробов содержится большое количество экзотоксина. К ним относят ботулизм, токсикозы, вызванные стафилококковым энтеротоксином и токсинами микроскопических грибов. Патогенез заболевания и его клинические проявления обусловлены действием микробного экзотоксина, который не разрушается при кипячении, пищеварительным ферментам и кислому содержимому желудка. отравления часто носят групповой характер. Каждый случай подлежит обязательному санитарно-эпидемиологическому расследованию с целью установления причин заболевания и разработки мер ликвидации вспышки и профилактики. Расследование пищевых отравлений производится немедленно с участием санитарного врача по гигиене питания или главврача СЭС и врача-бактериолога. Для исследования от больных забирают рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, мочу, кровь, а также секционный материал (в случае летального исхода). Одновременно производят отбор остатков подозреваемой пищи (употребленной заболевшим), исходных продуктов и полуфабрикатов, которые использовались при её приготовлении, суточных проб пищи, а также смывов и соскобов с кухонного инвентаря. Для постановки этиологического диагноза бактериологическое исследование одновременно ведут в нескольких направлениях: на облигатнопатогенные и условнопатогенные энтеробактерии и вибрионы, стафилококки, стрептококки, бациллы, а также (по показаниям) - на обнаружение возбудителей и токсинов ботулизма. При бактериологической диагностике ПТИ, вызванной условнопатогенными микробами, применяют количественный метод. Готовят разведения материала (1Q/2, Ю-4,1Q-6) и засевают по 0,1 мл на чашки с дифференциально-диагностическими средами: Плоскирева, Эндо (Левина) - на энтеробактерии; ЖСА с полимиксином и 2,3,5-триметилтетразолий хлоридом - на B.cereus; МПА с фурагином - на псевдомонады; щелочной агар - на вибрионы. При стафилококковом токсикозе производят посев на ЖСА. При наличии роста колоний, подозрительных на патогенные энтеробактерии, дальнейшие исследования ведут по их выделению и идентификации. При отсутствии роста облигатнопатогенных микробов изучают характер колоний УПМ на указанных средах. Определяют количество бактерий в 1 г материала. Выделяют чистые культуры и подвергают их идентификации и внутривидовому типированию. Оценка результатов: выделение из материалов сальмонелл, шигелл, энтеропатогенных кишечных палочек, иерсиний или других облигатнопатогенных микробов, независимо от количества, подтверждает соответствующее заболевание или носительство. Для оценки этиологической роли УПМ главным критерием является количественный. Этиологически значимо присутствие в материалах от больных и пищевых продуктах микробов в большом количестве (105-106 и более КОЕ в 1 г). При пищевых отравлениях диагноз становится более достоверным при одновременном обнаружении тех же микробов в больших количествах в пищевых продуктах, явившихся причиной' заболевания. Этиологическую роль микроба подтверждает его повторное выделение из материала больного, идентичность штаммов возбудителя (по фаго- и сероварам) у большого числа больных при групповом пищевом отравлении, а также нарастание титра антител в динамике болезни. Для диагностики пищевых токсикозов используют методы обнаружения в материалах от больных (рвотных массах, промывных водах) и в пищевых продуктах экзотоксинов микробов. При ботулизме с этой целью применяют биологическую пробу нейтрализации на белых мышах с антисыворотками к ботулотоксинам различных типов. При стафилококковом токсикозе используют РПГА с эритроцитами, обработанными содержащими экзотоксин материалами и типовыми стафилококковыми антисыворотками. 2.10. Лабораторная диагностика газовой гангрены Газовая гангрена - полиэтиологическая травматическая раневая инфекция, которая проявляется омертвением тканей и газообразованием в них, интенсивным отеком и выраженной токсемией. Возбудители: грам/+ спороносные палочки рода Clostridium. Основные возбудители: CL.perfringens (серовар A), CL.novyi (серовар A), CL.septicum, CL.histolyticum, CL.sordelli. Ведущий возбудитель - CL.perfringens. Материал для исследования: раневое отделяемое, некротизированная ткань, кровь. Микроскопический метод исследования: материал плотный измельчают, центрифугируют и из осадка готовят препараты с окраской по Граму и по Гинса-Бурри. Можно поставить пробу на подвижность (придавленная капля). Возбудители газовой гангрены подвижные (кроме Cl.perfringens), не имеют капсулы (кроме Cl.perfringens), спорообразования в животном организме не происходит. Бактериологический метод исследования: 1-й этап: обработанный материал е нативном состоянии и после 10-20-минутного прогревания при 80°С засевают на питательные среды (Китт-Тароцци, обезжиренное молоко, Вильсон-Блера, агар Цейсслера). Жидкие среды регенерируют (кипятят) и заливают вазелиновым маслом. Чашки выращивают в анаэростате. Посевы просматривают ежедневно в течение 7 дней. 2-й этап - изучение роста на средах: наиболее характерны изменения сред при росте Cl.perfringens. Помутнение и образование пузырьков газа на среде Китт-Тароцци наступает через 6 часов, молоко свертывается через 2-3 часа. К этому же времени наступает почернение с разрывами среды Вильсон-Блера. Другие возбудители указанные среды изменяют позже и менее типично. На среде Цейсслера (через 24-48 часов) Cl.perfringens образуют серые крупные дисковидные колонии с зоной гемолиза. На среде Вильсон-Блера - колонии черного цвета. Из отдельных колоний делают мазки по Граму и их отсевают на среду Китт-Тароцци (для накопления чистой культуры). Можно выделять культуру и другими методами (метод Фортнера, Вейнберга, трубочки Вейона). 3-й этап - изучение выделенной культуры: а) мазок по Граму; б) мазок по Ожешко; в) проба на подвижность; г) определение ферментативных свойств (в том числе лецитиназной активности); д) реакция нейтрализации на белых мышах для определения типа токсина; е) антибиотикограмма. Биологический метод исследования: заражают подкожно морских свинок суспензией материала. Животные погибают при картине экспериментальной газовой гангрены (местный отек с газообразованием, расплавление подкожно-жировой клетчатки). Посевом органов можно выделить культуру. Экспресс-метод диагностики проводится с использованием: а) данных микроскопии препаратов; б) реакции иммунофлюоресценции; в) учета роста на средах с посевом нативного материала через 3-6 часов (для определения Cl.perfringens); г) определения антигена в материале методом встречного иммуноэлектрофореза или иммуноферментным методом. Бактерии рода Clostridium (главным образом CL. perfringens типа А) могут вызывать клостридиальные гастроэнтериты и некротические энтериты. Микробиологический диагноз устанавливают изоляцией культуры клостридий из испражнений, рвотных масс, остатков пищевых продуктов по такой же схеме, что и при анаэробной газовой инфекции с учетом массивности содержания бактерий в материале. В фильтрате материала определяют (пробой нейтрализации) экзотоксин, при септической форме возбудитель выделяют из крови. 2.11. Лабораторная диагностика столбняка Возбудитель: Cl.tetani - крупная тонкая палочка с круглой спорой на конце (барабанная палочка), грам+, подвижная, без капсулы. Обладает слабыми протеолитическими свойствами. Диагностика проводится по той же схеме, что и газовой гангрены. Наибольшее значение имеет биопроба на мышах и опыт нейтрализации. Картина экспериментального столбняка: хвост мыши становится ригидным, задняя конечность вытягивается, туловище искривляется (восходящий столбняк), животное погибает. Для ускоренного выделения палочек столбняка используют засев материала (или смешанной культуры со среды Китт-Тароцци) в конденсационную воду скошенной свернутой сыворотки (метод Филдса). Благодаря активной подвижности клостридий столбняка за 24 часа вырастают на верхней части косяка. Культура исследуется микроскопически и ею заражают белых мышей. 2.12. Лабораторная диагностика ботулизма Возбудитель: Cl.botulinum - крупная палочка с субтерминальной овальной спорой ("теннисная ракетка"), грам+, подвижная, без капсулы, обладает выраженными протеолитическими свойствами. Основную роль играют серовары А, В, Е. Материал для исследования: кровь, рвотные массы, промывные воды желудка, моча, испражнения, подозрительные на заражение пищевые продукты. Микробиологическая диагностика проводится аналогично для других клостридиозов. Наиболее информативный метод диагностики - реакция нейтрализации на белых мышах с использованием противоботулинических сывороток. Ставят ее непосредственно с исследуемым материалом, либо с выделенной культурой. Животные, не защищенные сыворотками, погибают при явлениях общей слабости, одышки, порезов и параличей конечностей, западения мышц живота ("осиная талия"). 2.13. Серологическая диагностика сифилиса Для серо- и ликвородиагностики сифилиса, а также для отборочных исследований на сифилис применяется следующий комплекс серологических ^реакций (КСР): 1. Микрореакция преципитации типа VDRL с кардиолипиновым АГ (КЛАГ) с плазмой крови или инактивированной сывороткой крови (экспресс-метод). 2. РСК с трепонемным и кардиолипиновым АГ (реакция Вассермана). 3. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ). 4. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). 5. Иммуноферментный анализ. Профилактическое обследование населения на сифилис должно проводиться экспресс-методом или КСР. С помощью микрореакции преципитации обследуются лица, подлежащие периодическим медицинским осмотрам на венболезни, а также лица, помещенные в медицинские вытрезвители, спецприемники, изоляторы для временного содержания под стражей и др. Эта реакция является не диагностическим, а отборочным тестом, в связи с чем на основании ее позитивности диагноз сифилиса не устанавливается, а обследуемые направляются к дерматовенерологу, который должен подвергнуть их клиническому обследованию и организовать исследование их крови в КСР, РИТ, РИФ. Одной из основных серологических реакций при сифилисе является реакция Вассермана (РВ). Реакция Вассермана ставится в трех рядах пробирок с использованием двух антигенов: КЛАГ - неспецифического и трепонемного антигена - специфического. Принцип реакции: реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с КЛАГ. Специфические антитрепонемные AT вступают в соединение со специфическим АГ (ультраозвученный трепонемный АГ). Образовавшиеся комплексы АГ+АТ сорбируют комплемент. Индикация достигается введением гемсистемы. Испытуемую сыворотку крови, разведенную 1:5, разливают в три пробирки: в первую добавляют специфический трепонемный АГ; во вторую - неспецифический кардиолипиновый АГ; в третью - физиологический раствор. В качестве контроля используют заведомо положительную (++++), слабо положительную (++) и отрицательную (+) сыворотки. Оценка результатов. Используют систему четырех плюсов: полная задержка гемолиза - ++++ (резко положительная реакция); значительная задержка гемолиза - +++ (положительная реакция); частичная задержка гемолиза - ++ (слабо положительная реакция); незначительная задержка гемолиза - +; сомнительная - +. 2.14. Лабораторная диагностика хламидиозов Хламидиозы - разнообразные по патогенезу и клиническим проявлениям распространенные заболевания человека и животных. Хламидии - грамотрицательные бактерии с облигатным внутриклеточным паразитизмом. Биологическое своеобразие хламидий, выражающееся в энергозависимом паразитизме и уникальном цикле развития, определяет самостоятельное положение этих микроорганизмов в системе прокариотов. Хламидии выделены в отдельный порядок Chlamydiales, включающий одно семейство Chlamydiaceae, содержащее один род Chlamydia, состоящий из 3 видов: C.trachomatis, C.psittaci, С. pneumoniae. Хламидии имеют две стадии жизненного цикла: одна - инфекционная стадия элементарного тельца (ЭТ), она приспособлена к внеклеточному существованию; другая - ретикулярное тельце (РТ) - внутриклеточная практически неинфекционная стадия, лабильна, обладает выраженной метаболической активностью. ЭТ имеют размеры 0,3 мкм, содержат нуклеоид, в клеточной стенке имеется длой - аналог пептидогликана грам-бактерий. Форма проникает в клетку при фагоцитозе. Из поверхностных мембран клетки хозяина вокруг ЭТ образуется вакуоль и ЭТ превращается в крупное ретикулярное тельце (РТ) - диаметр 0,5-1 мкм. Внутри образованной вакуоли РТ многократно делится. В конечном счете, вакуоль через 8-12 циклов деления заполняется этими частицами и превращается во включение (микроколонию). На последней генерации РТ образуются ЭТ нового поколения. Затем мембрана, ограничивающая микроколонию, повреждается и хламидий выходят в цитоплазму и далее за пределы клетки. Помимо ЭТ и РТ имеются промежуточные или переходные формы хламидий, которые образуются на двух стадиях цикла развития, на ранней при преобразовании ЭТ в РТ и на поздней - РТ в ЭТ, а также аномальные формы. Хламидии чувствительны к антибиотикам тетрациклинового ряда, макролидам (эритромицин, рифампицин). Хламидии имеют сложную антигенную структуру. Выделяют три основных антигенных комплекса. Родоспецифический термостабильный, липополисахаридный комплекс, характерный для представителей рода, видоспецифические и типоспецифические термолабильные белковые фракции. Видоспецифический антиген определяет принадлежность штаммов к соответствующему виду. Типоспецифические антигены позволяют дифференцировать различные серовары (серотипы) хламидии внутри вида. Вид C.psittacci Объединяет возбудителей болезней птиц: орнитоз и пситаккоз (инфицировано до 140 видов птиц) и некоторых млекопитающих (экзогенные аборты, пневмонии и др.). Возбудитель передается человеку от птиц и животных, вызывает разнообразную форму патологии (поражения легких, заболевания нервной системы, гепатолиенальный синдром). Среди генерализованных форм летальность достигает 20%. Вид C.trachomatis. Имеет наибольшую социально-медицинскую значимость. Он весьма неоднороден и представлен 15 серотипами, относящимися к 3 биоварам. Вызывает антропонозные хламидиозы. Биовар1 - возбудитель трахомы, известной с древности. Это хронический кератоконьюнктивит, протекающий с воспалением коньюнктивы и роговицы, образованием рубцов и слепотой. До настоящего времени в ряде стран трахома интенсивно распространена. На территории бывшего СССР ликвидирована в 60-е годы. В мире поражено трахомой 400 млн человек. Биовар 2 - возбудитель венерической лимфогранулемы. Заболевание передается половым путем. Развивается гнойный паховый лимфаденит. Активно циркулирует в Юго-Восточной Азии. Выделяется и у нас (завозные случаи). Биовар 3 - возбудитель урогенитальных и экстрагенитальных хламидиозов: пневмоний новорожденных и младенцев, коньюнктивитов у новорожденных, коньюнктивитов у взрослых (так называемых "бассейновых"). Проблема заболеваний мочеполовых органов, вызываемых C.trachomatis, за последние десятилетия приобрела чрезвычайно важное значение, что связано с широким распространением данного вида инфекции и значительным числом развивающихся после нее осложнений. Вид C.pneumoniae. Еще недостаточно изучен. Вызывает острую инфекцию верхних и нижних отделов дыхательного тракта, передающуюся от человека к человеку. |