Методичка по микробиологии для иностранных учащихся. Под редакцией профессора Л. П. Титова
 Скачать 0.93 Mb.
|
|
Бактериоскопический метод исследования: выявление хламидии, их морфологических структур и антигенов в пораженных клетках (клиническом материале). Материал для исследования: соскобные препараты с доступных исследованию слизистых оболочек мочеполового тракта ( уретра, шейка матки и т.п.) и других органов (конъюнктива, прямая кишка и пр.) при экстрагенитальных формах. Из материала готовят мазки, которые окрашивают по Романовскому-Гимзе. Цитоплазматические включения хламидии (тельца Гальберштедтера- Провачека) содержат крупные ретикулярные тельца или мелкие элементарные тельца. По цвету и внутренней структуре РТ и ЭТ отличаются от ядра клетки и цитоплазмы. Метод характеризуется сравнительно низкой чувствительностью, позволяет диагностировать 10-20% случаев урогенитальной инфекции; при хламидийной патологии глаз его чувствительность составляет 90-100%. Применение люминисцирующих поликлональных и моноклональных антител для выявления антигенов хламидии в цитоплазматических включениях в соскобных препаратах урогенитального тракта значительно увеличивает чувствительность и специфичность метода. Используется как прямой, так и непрямой иммунофлюоресцентный метод. При люминесцентной микроскопии антигены хламидии выявляют на красном или оранжевом фоне (при контрастировании синькой Эванса или родамином) цитоплазмы эпителиальных клеток в виде внутриклеточных включений ярко-зеленого цвета. По информативности и чувствительности уступает только бактериологическому методу. При диагностике орнитоза и других зоонозных хламидиозов бактериоскопический метод не применяется. Бактериологический метод исследования: выделение хламидии из инфекционного материала проводится заражением куриных эмбрионов, лабораторных животных или клеточных культур с последующей индикацией возбудителя. Материал для исследования: - тот же, что и при бактериоскопии. При орнитозе - кровь или мокрота. Кровь из вены (не менее 5 мл) исследуют в первые 7-10 дней заболевания, мокроту - до 14 дня заболевания. Для удаления сопутствующей микрофлоры добавляют антибиотики, не действующие на хламидии. (стрептомицин, нистатин, гентамицин). При заражении куриного эмбриона исследуемый материал вводят в желточный мешок 6-7-суточного развивающегося эмбриона. Индикацию хламидии проводят через 48-72 часа на основании обнаружения типичных цитоплазматических включений, содержащих элементарные и ретикулярные тельца (мазки-отпечатки из желточных мешков куриных эмбрионов и (или) оценка зараженных клеток - окраска по Маккиавелло, прямая и непрямая РИФ). При диагностике орнитоза кроме культур клеток можно заражать пибораторных животных (в мозг или внутрибрюшинно). Серологический метод исследования: антитела выявляют в сыворотке крови, которую исследуют 2-3 раза с интервалом 10-14 дней, и секретах половых органов. Для диагностики используют РСК, РПГА, РИФ, ИФА. При урогенитальных хламидиозах диагностически значимыми в РИФ являются титры 1:32-1:64. Наиболее достоверным является нарастание титра антител в четыре и более раза. Аллергологический метод исследования: постановка кожно-аллергических проб. Используется при диагностике орнитоза с орнитозным аллергеном. Внутрикожная проба становится положительной с первых дней заболевания у 87-95% больных, сохраняясь до года и более. 2.15. Микоплазмы, микоплазмозы Микоплазмы (М) - мельчайшие среди живущих прокариотических микроорганизмов, способные к самостоятельному метаболизму и репродукции. Относятся к отдельному классу Mollicutes ("мягкокожие") В настоящее время описано свыше 100 видов М., отнесенных к трем порядкам. Наибольшее значение в патологии человека имеют М. семейства Micoplasmataceae. В состав этого семейства входят два рода: 1. Mycoplasma (более 70 видов); 2. Ureoplasma (2 вида). Среди микоплазм имеются как свободноживущие (сапрофиты), так и поражающие млекопитающих, птиц, насекомых, а также растения. Размер М. 0,15 - 0,3 мкм. Микоплазмы полностью лишены клеточной стенки и ее дериватов. Однако, они способны размножаться на бесклеточных питательных средах, где образуют характерные колонии. Клетки М. полиморфные - шарообразные, мелкозернистые, звездчатые, нитевидные. Размножение - бинарное деление, возможна фрагментация нитей, почкование. Имеются микоплазмы, обладающие скользящей подвижностью (подобно амебе), некоторые обладают жгутиками. М. окружена трехслойной липопротеиновой мембраной, которая состоит из стериновых липидов, что отличает их от других прокариотов и сближает с эукариотами. Отсюда потребность микоплазм в стероле для роста и синтеза мембран. ЦПМ выполняет одновременно функции клеточной стенки и собственно мембраны и несет ряд важнейших физиологических функций: регулирует процессы метаболизма, энергетический обмен, рецепцию токсинов, обеспечивает адсорбцию эритроцитов, сперматозоидов, эпителиальных и других клеток. Отсутствие клеточной стенки определяет отличительные свойства микоплазм: чрезвычайную пластичность, полиморфизм, чувствительность к лизису под влиянием осмотического шока, алкоголя, детергентов, фильтруемость через мембранные фильтры, устойчивость к антибактериальным препаратам, действующим на клеточную стенку. На агаризованных питательных средах М. образуют небольшие колонии похожие на яичницу-глазунью (10-200 мкм) в зависимости от вида. Недостаток белков-ферментов ограничивает число метаболических путей, поэтому микоплазмы крайне чувствительны к питательным средам, в состав которых обязательно должны входить пуриновые и пиримидиновые основания, аминокислоты, витамины, липиды, в том числе стероиды. Паразитируя в организме хозяина, микоплазмы потребляют эти вещества непосредственно из тканей организма-хозяина. Заболевания, вызываемые микоплазмами, - микоплазмозы относятся к одним из наиболее часто встречающихся заболеваний. Это: ОРЗ - до 10% всех случаев (основные возбудители M.pneumoniae и M.hominis); пневмонии - около 20% всех пневмоний (M.pneumoniae, M.hominis); внереспираторные проявления респираторного микоплазмоза: миокардиты, перекардиты, неврологические проявления (неврит, менингоэнцефалит и др.), нефрит, отит, синусит. Урогенитальные микоплазмозы занимают значительное место среди болезней, передающихся половым путем. Основные возбудители: M.hominis, M.genitalium, M.fermentans. Микоплазменная инфекция у мужчин может быть причиной уретритов, простатитов, у женщин - вагинитов, цервицитов, осложнений беременности (самопроизвольные выкидыши, преждевременные роды, послеродовой сепсис). С микоплазменной инфекцией многие связывают нарушение репродуктивной функции мужчин и женщин. 3. Общая и частная вирусология 3.1. Методы культивирования вирусов Вирусы - это облигатные внутриклеточные паразиты, не способные размножаться ни в одной из бесклеточных сред. Для культивирования вирусов используются следующие живые объекты : 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные. I. Культуры клеток Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на первичные (первично трипсинизированные) и перевиваемые (штаммы клеток и линии). По происхождению они классифицируются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу - на фибробластные и эпителиальные. Первичные культуры клеток - это клетки различного типа. Получают их следующим образом: ткань (эмбриональную или из взрослых организмов) механически измельчают и обрабатывают протеолитическими ферментами (трипсином). После отмывки и подсчета клеток суспензию разбавляют питательной средой и дают возможность клеткам прикрепиться к плоской поверхности стеклянных или пластмассовых сосудов. В результате деления на поверхности сосудов образуется сплошной монослой клеток. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердой поверхностью, на которой они выращивались, что ведет их к гибели. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов широко используются как в лабораторных исследованиях, так и для производства вирусных вакцин. Перевиваемые штаммы клеток (диплоидные клетки) - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов, полученные из эмбрионов человека, широко используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин. Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий являются первичные клеточные культуры, отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными. Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака легкого в костный мозг; RH - из почки человека; ВНК-21 -из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки и ДР. Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток B уже сформированном монослое при размножении в клетке вируса Широкое применение находят синтетические стандартные среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные Среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. гНеотье1лемы компонент большинства ростовых сред - сыворотка крови животных (телячья бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживают, Сред сыворотка не входит. Культивирование вирусов на культурах клеток. При выделение, вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала предварительно обработанного антибиотиками. После 30-60 мин контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят по 1,0-1, g мл на пробирку поддерживающей среды и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса. Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток может служить: 1) развитие специфической дегенерации клеток - цитопатическое действие вируса (ЦПД) которое имеет три основных типа (кругло - или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток, клеток - симпластов; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих 3 нескольких слоев клеток); 2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и ядрах пораженных клеток; 3) положительная реакция гемагглютинации (ГА); 4) положительная реакция гемадсорбции; 5) феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного. При наличии вируса в клетках образуются бесцветные, зоны ("бляшки") на розовом фоне агара. 6) при отсутствии ЦПД или ГА можно поставить реакцию интерференции: исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдаем ЦПД. II. Куриные эмбрионы (7-12-дневного возраста). Используют для вирусологических исследований. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоскопировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка или место расположения эмбриона, или границы желточного мешка. Заражают куриные эмбрионы в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом. Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок. Выбор метода заражения зависит от биологических свойств изучаемого вируса. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям, ("бляшкам"), на хорион-аллантоисной оболочке. III. Лабораторные животные. Могут быть использованы для выделения вирусов из инфекционного материала, когда невозможно применить более удобные системы (культуры клеток или куриные эмбрионы). Берут преимущественно новорожденных белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражают животных по принципу цитотропизма вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные - интрацеребрально, дерматотропные - на кожу. Индикация вируса основана на появлении признаков заболевания у животных, их гибели, патоморфологических изменений в тканях и органах, а также на положительной реакции гемагглютинации с экстрактами из органов. 3.2. Принципы диагностики вирусных инфекций С целью лабораторной диагностики вирусных инфекций используют три группы методов: 1. Быстрые (экспресс) методы - прямое обнаружение возбудителя в клиническом материале (от больного). 2. Вирусологический метод - выделение вируса из клинического материала и его идентификация. 3. Серологический метод - определение прироста (динамики) антител к вирусу (за определенный период заболевания) в парных сыворотках больного. Выбор метода зависит от биологических свойств вируса, периода заболевания, а также технической оснащенности лаборатории. Быстрый (экспресс) метод. Основан на быстром обнаружении и идентификации вируса, его антигенов или включений в биосубстратах (мазках-отпечатках, биоптатах, эпителий осадка, лейкоцитах, гистологических срезах, секционном материале): а) серологический метод - определение вирусного антигена в исследуемом материале с помощью диагностических противовирусных сывороток в экспресс-реакциях: иммунофлюоресценция (ИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунный анализ (РИА), встречный мммуноэлектрофорез (ВИЭФ), иммунная электронная микроскопия (ИЭМ), реакция прямой и обратной пассивной гемагглютинации (РПГА, РОПГА), реакция торможения обратной пассивной гемагглютинации (РТОПГА); б) микроскопический метод - обнаружение элементарных частиц или включений вирусов с помощью световой, люминесцентной или электронной микроскопии: в) молекулярная гибридизация - гибридизация комплементарных нитей ДНК или РНК (вируса и зонда). Вирусологический метод. Основан на культивировании вирусов на чувствительных клеточных системах (культуре клеток, курином эмбрионе, лабораторных животных): 1. Забор исследуемого материала. 2. Выбор и получение чувствительной тест-системы, определение ее жизнеспособности. 3. Заражение ее по принципу цитотропизма. 4. Индикация (обнаружение) вируса. 5. Идентификация вируса проводится на основании: а) определения антигенов вируса в тест-системе с помощью серологических реакций (ИФ, ИФА, РПГА, РТГА, РСК, РН, ВИЭФ и др.); б) патогистологического исследования органов и тканей; в) клинических симптомов; г) биологических проб (кератоконъюнктивальная и др.). Оценка метода: относится к ранним высокочувствительным методам исследования. Недостатки: сложность интерпретации результатов при выделении персистирующих вирусов; техническая сложность. Серологический метод. Основан на нарастании титра (прироста) антител за определенный период заболевания в парных сыворотках больных или переболевших людей - с помощью набора вирусных диагностикумов. Парные сыворотки - две сыворотки, взятые от одного больного в начале заболевания и через 1-4 недели. Серологические реакции (РПГА, РСК, РТГА, РН, ИФА и др.) ставят одновременно с двумя сыворотками для определения и сравнения их титров. Для ранней диагностики заболевания определяют наличие IgM в сыворотке (в непрямой ИФ и ИФА). 3.3. Лабораторная диагностика вирусных гепатитов В настоящее время известны несколько типов вирусных гепатитов: гепатит А (гА) (синоним: инфекционный гепатит, эпидемический гепатит, болезнь Боткина); гепатит В (гВ) (синоним: сывороточный гепатит); гепатит ни А ни В (синоним гепатит С); гепатит дельта (синоним гепатит Д); гепатит Е. |