Методичка по микробиологии для иностранных учащихся. Под редакцией профессора Л. П. Титова
 Скачать 0.93 Mb.
|
|
2.5. Лабораторная диагностика кишечного иерсиниоза Для заболеваний, вызываемых Yersinia enterocolitica, характерно клиническое разнообразие. Наиболее часто встречается кишечная форма, значительно реже - заболевания с симптомами аппендицита, еще реже - септическая форма. Кишечная форма протекает в виде энтеритов, энтероколитов и гастроэнтероколитов. Специфические симптомы часто отсутствуют, поэтому по клинической картине без выделения возбудителя ее трудно отличить от сальмонеллеза, дизентерии, энтероколитов другого происхождения. Метод: бактериологический. Материал для исследования: при кишечной форме возбудитель выделяют из испражнений; при аппендикулярной - из мезентериальных лимфатических узлов и крови; при септической - из испражнений и крови. Схема работы. 1-й этап: материал засевают петлей или тампоном на одну из плотных элективных сред (Эндо, Плоскирева, висмут-сульфитагар). Посевы инкубируют в течение 24 часов при 37°С, а затем дополнительно 24 часа при 20-22°С. Одновременно испражнения засевают в одну из сред накопления (МПБ или пептоннуюводу). Кровь засевают в соотношении 1:10тольков среды накопления. Посевы помещают при 4-5°С и выдерживают до 30 суток, периодически высевая через каждые 3-5 дней на плотные элективные среды. Y.enterocolitica при низкой температуре размножаются в этих средах, в то время как сальмонеллы, шигеллы, кишечная палочка, протей не размножаются. 2-й этап: просматривают посевы на плотных средах и отбирают подозрительные колонии (округлые, величиной от 0,5 до 2 мм в диаметре, сероватого цвета на Эндо и Плоскирева и коричневого на висмут-сульфитагаре), Из колоний делают мазки по Граму и при наличии грам/- палочек отсевают на среду Ресселя. 3-й этап: при изменении цвета столбика на среде Ресселя из роста на ней делают мазок по Граму на чистоту культуры и изучают следующие тесты:
4-й этап: учет результатов и выдача окончательного ответа. При серологическом методе исследования кровь берут в конце первой и начале третьей недели. Ставят развернутую реакцию агглютинации с аутоштаммами и парными сыворотками больного. При положительном результате отмечается значительное нарастание титра антител. 2.6. Клебсиеллы. Лабораторная диагоностика склеромы и озены Бактерии рода Klebsiella включают в семейство Enterobacteriaceae. K.scleromatis является возбудителем склеромы, K.ozaenae - возбудитель озены, K.pneumoniae способна при определенных условиях вызывать у человека сепсис, воспаление легких, острые кишечные заболевания, пиелонефрит, цистит, перитонит, менингит и др. Клебсиеллы - это палочки длиной 1-5 мкм, эллипсоидные, неподвижные, без спор, капсула является у них постоянной структурой. Они растут на плотных средах в виде блестящих, влажных, серовато-белых колоний с перламутровым оттенком, слизистой консистенции. В бульоне - диффузное помутнение, иногда слизистое кольцо на поверхности. У клебсиелл слабо выражены протеолитические свойства и относительно хорошо гликолитические. Дифференциация клебсиелл.
Клебсиеллы содержат К - капсульный, О - соматический, СА - общий для энтеробактерий антиген. Род разделяется на 80 серологических вариантов. У клебсиелл склеромы обнаружен только один КЗ-антиген, идентичный с К-антигеном клебсиеллы пневмонии 3-го типа. У К.озены - К4, К5, либо К6-антигены. Клебсиеллы пневмонии - К-антигены 1-3 и 7-80. Известно 5 О-антигенов. К.склеромы имеют антиген О2А, К.озены - О2В, К.пневмонии - О-антигены 1, 3, 4, 5. Питательные среды: 1. Дифференциально-диагностическая среда - ЛБТА (лактозобромтимоловый агар с пенициллином). Содержит МПА+ лактоза+бромтимоловый синий. К.склеромы, не разлагающая лактозу, дает колонии цвета среды, К.пневмонии - желтые, К.озены - либо желтые, либо цвета среды. 2. Модифицированная среда Ресселя кроме глюкозы (в столбике) и лактозы (в скосе) содержит индикатор бромтимоловый синий, соль Мора и гипосульфит (на H2S). К. склеромы дает пожелтение только столбика, К. пневмонии - пожелтение и разрыв всей среды, К. озены - различные варианты. 3. Среда Симмонса для утилизации цитрата натрия (индикатор бромтимоловый синий). В положительных случаях появляется рост и среда синеет, в отрицательных случаях роста нет и среда не изменяется. 4. Среда с малонатом натрия (индикатор бромтимоловый синий). При утилизации малоната - среда интенсивно синего цвета, отрицательная реакция - среда желтая. Лабораторная диагностика проводится двумя методами: бактериологический и серологический. Бактериологическая диагностика. Материал для исследования: содержимое носа, глотки, носоглотки. Схема исследования: 1-й этап - посев материала петлей или тампоном на ЛБТА, или на пенициллиновый агар; 2-й этап: а) учет роста на чашках. Колонии клебсиелл - крупные, выпуклые, влажные, блестящие. На ЛБТА цвет колоний зависит от вида клебсиелл; б) посев колоний на модифицированную среду Ресселя или косой агар; 3-й этап - идентификация выделенной культуры: а) мазок по Граму; б) препарат по Гинса-Бурри; в) определение биохимических свойств (см. таблицу); г) определение антигенной формулы с помощью клебсиеллезных сывороток О и К (р. агглютинации на стекле, РА в пробирках, РИФ). Серологическая диагностика: используют РСК и РПГА со склеромным и озенозным диагностикумами. 2.7. Лабораторная диагностика холеры Обследованию подлежат не только больные, но обязательно все люди в очаге для выявления скрытых форм и бактерионосителей. Забор материала проводится в условиях, обеспечивающих полную безопасность персонала и внешней среды, обязательно медицинским работником. Материал от больного берется индивидуально, от подозреваемых лиц - можно объединять по несколько проб. Материал для исследования: испражнения, кусочки кишечника от трупов, пищевые продукты, вода, объекты внешней среды. Пересылка материала осуществляется медицинским работником в течение не более 3,5 часов в системе стекло-впитывающий материал-металл с приложением сопроводительного письма, в котором указаны паспортные данные больного, предполагаемый диагноз, время взятия материала, и пометкой "бактериологическое загрязнение". Используют два метода: главный - бактериологический, дополнительный - серологический. Бактериологическая диагностика: проводят в специальных лабораториях с соблюдением строгого противоэпидемического режима. Методы диагностики: классический и ускоренный. Классическое исследование: проводят поэтапно, через каждые 6 часов. 1-й этап: а) посев материала для обогащения на 1% пептонную воду; б) микроскопия материала (окраска по Граму и фуксином); в) посев материала на щелочной агар и среду TCBS (тиосульфатцитрат- бромтимоловый синий, сахароза). Посевы помещают в термостат; 2-й этап (через 6 часов): а) вырастает пленка на пептонной воде, делают пересев на вторую пептонную воду для дальнейшего обогащения; б) пересев из первой пептонной воды на щелочной агар и среду TCBS; 3-й этап (через 12 часов): а) исследование роста на второй пептонной воде (аналогично первой); б) изучение чашек первичного посева: - описание колоний (желтые на TCBS, прозрачные голубоватые на щелочном агаре; - микроскопия; -определение подвижности; - постановка РА на стекле с 0-1, Инаба и Огава сыворотками; - просмотр колоний в стереоскопическом микроскопе (голубоватый цвет); - пересев на двухсахарную лактозо-сахарозную среду. На этом этапе может быть дан предварительный ответ; 4-й этап (через 18 часов) - изучение выросшей культуры: а) учет изменения лактозо-сахарозной среды (разложение сахарозы в столбике без газа); б) мазок по Граму; в) идентификация по ряду признаков: - для постановки окончательного диагноза и отличия выделенных вибрионов от нехоленых: РА с сывороткой 0-1 (в пробирках); посев на триаду Сахаров Хейберга: сахарозу (+), маннозу (+) и арабинозу (-); определение чувствительности к холерным фагам С4 и Эльтор-2. - для определения серовара: РА с сыворотками Огава и Инаба (в пробирках). - для определения биовара холерного вибриона: чувствительность к бактериофагам (классический вибрион - к фагу С4, Эльтор - к фагу Эльтор-2; рост на среде с полимиксином; агглютинация куриных эритроцитов; лизис бараньих эритроцитов. Три последних теста положительны для вибриона Эль-Тор. Длительность исследования: 36-48 часов в зависимости от скорости обогащения. Ускоренное исследование подразделяется на ускоренный метод индикации микроба, антигена и ускоренную идентификацию. 1. Ускоренная индикация - поиск микроба непосредственно в материале или после подращивания в пептонной воде следующими методами: а) микроскопия (по Граму и фуксином и на подвижность); б) прямая РИФ; в) р. иммобилизации под действием сыворотки 0-1; г) РА растущих культур (материал засевается в 2 пробирки с пептонной водой, в одну из них добавляют диагностическую сыворотку, отмечается рост и одновременно склеивание микробов в пробирке с сывороткой); д) проба с бактериофагами. 2. Поиск антигена в материале серологическими методами: а) ИФА; б) РОПГА; в) РТПГА. 3. Ускоренная идентификация осуществляется на 3-м этапе бактериологического исследования путем изучения свойств выросших колоний (мазок по Граму, р. агглютинации с сывороткой 0-1, посев в малые объемы трех углеводов по Хейбергу, проба с бактериофагом). Серологическая диагностика: чаще носит ретроспективный характер, помогает в неясных случаях, для выявления переболевших и вибриононосителей. Используют РА, РПГА, а также определение вибриоцидных антител. Рекомендуют использовать парные сыворотки. Положительный ответ получают при наличии высокого титра (в РА-1:180-1:3200) или при нарастании его в парных сыворотках. 2.8. Кампилобактерии. Методы диагностики кампилобактериоза Кампилобактерии - род Campylobacter семейства Spirillaceae - это тонкие изогнутые грам- палочки, образующие один или несколько завитков, могут быть S-образными или похожими на "крылья чайки". Толщина клеток - 0,2-0,5 мкм, длина - 0,5-8 мкм. Спор и капсул не образуют, подвижны, имеют полярно расположенный жгутик на одном конце или по жгутику на обоих концах клетки. Для них характерны быстрые винтообразные движения. Хемоорганотрофы, микроаэрофилы (растут при пониженном парциальном давлении кислорода). Род включает более 10 видов. Некоторые виды патогенны для человека и вызывают кишечный кампилобактериоз. Патогенные виды отличаются от непатогенных продукцией каталазы. Каталаза-отрицательные кампилобактерии входят в состав нормальной микрофлоры полости рта и кишечника человека и различных животных. Наибольшее значение в развитии заболеваний у людей имеет C.jejuni (95%), реже - C.coli, еще реже - С.fetus и C.laridis. Заболеваемость кампилобактериозом носит спорадический характер, возникает при употреблении в пищу инфицированного мяса птицы, телят, свиней, могут быть вспышки молочного или водного характера. Болеют дети и взрослые, в наибольшей степени заболеванию подвержены дети в возрасте до 4 лет ( в 90% случаев). Кампилобактерии поражают тонкий кишечник. Они прикрепляются к поверхности энтероцитов, оказывают цитотоксическое действие (выделяют энтеротоксин), обладают высокой инвазивностью, что приводит к бактериемии (у ослабленных лиц может быть сепсис). Клинически заболевание проявляется острым гастроэнтеритом, который по тяжести варьирует от кратковременной диареи до тяжелого кровавого поноса с высокой температурой и явлениями интоксикации. Летальность невелика. Иммунитет изучен плохо. Диагностика кампилобактериоза: может проводиться по короткой или полной схеме. Материал: испражнения, рвотные массы, ПВЖ (промывные воды желудка). Короткая схема: включает широкое бактериоскопическое исследование: а) фазовоконтрастную микроскопию для выявления подвижности (клетка сжимается в кольцо и разжимается как пружина); б) простую окраску препаратов (окрашиваются анилиновыми красителями за 20 секунд, энтеробактерии - за 2-3 мин); в) окраску по Граму (выявление характерной морфологии). На практике при наличии характерной клиники (диареи) достаточно короткой схемы исследования. Полная схема (бактериологический метод): проводится только с материалами, в которых при микроскопии обнаружены кампилобактерии. При этом, во многих случаях достаточно идентификации до группы С.jejuni-coli. При проведении исследования необходимы условия: 1. Наличие высококачественных питательных сред, содержащих редуцирующие вещества (активированный уголь), витамины, 5% лизированной крови (источник гемина), 5% свежей крови (эритроциты -дополнительный сорбент метаболитов), антибиотики (амфотерицин и др.) для подавления сопутствующей микрофлоры. 2. Культивирование в присутствии СО2 или специальных газовых смесей (5% кислорода, 10% СО2, любой инертный газ). Можно использовать эксикаторы со свечей или надувать двойные полиэтиленовые пакеты выдыхаемым воздухом. 3. Культивирование при различных температурах (25°, 30°, 37°, 42°С) и дифференциация по чувствительности к налидиксовой кислоте и цефалотину. При наличии роста нежных полупрозрачных колоний грам- подвижных палочек при 42°С, чувствительных к налидиксовой кислоте и устойчивых к цефалотину, выдается ответ: C.jejuni-coli. В начале 80-х годов были выделены так называемые "желудочные" кампилобактерии, обозначенные как C.pyloridis. В дальнейшем они были исключены из рода Campylobacter и получили название Helicobacter pylori. Отличаются от кампилобактерии внутриклеточным паразитизмом и продукцией уреазы (кампилобактерии уреазу не продуцируют). Обладают цитотропизмом к клеткам эпителия желудка и кишечника, являются возбудителями язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. По современным представлениям, язвенная болезнь в 99% случаев - это хеликобактериоз. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||