Биохимия. Предмет биохимии
 Скачать 0.58 Mb.
|
ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВ.Денатурацией белка называется изменение (разрушение) четвертичной, третичной., вторичной структуры белка. При этом первичная структура сохранена. Явление денатурации сопровождается изменением физико-химических свойств белка и нарушением его биологической активности. В зависимости от того, является ли белок олигомером, полностью ли утрачена нативная конформация, под термином (то-есть денатурацией) подразумевается разные процессы. И диссоциация олигомеров на мономеры (которые могут обладать и не обладать биологической активностью) и полное или неполное разворачивание цепи с полной или не полной потерей активности – все это определяется одним понятием – денатурация. Денатурированные белки менее растворимы в воде и часто из водного раствора выпадают в осадок. Это свойства широко используются в клинической лабораторной практике. Пробы крови или сыворотки, взятые для анализа на содержание в них малых молекул (глюкозы, мочевой кислоты, лекарственных препаратов) сначала обрабатывают трихлоруксусной кислотой или фосфомолибденовой кислтой или фосфовольфрамовой кислотой для осаждения белка. Осадок удаляют центрифугированием, а свободную от белка надосадочную жидкость анализируют.Факторы вызывающие денатурацию белка.1)Физические (резкое изменение температуры, ионизирующие излучение)2) Химические (резкое изменение pH, воздействие некоторых органических веществ в высоких концентрациях, воздействие солей тяжелых металлов, мочевины , поверхностно активных веществ – додецилсульфат натрия, меркаптоэтанол (на белки, содержащие – SH ) ) .3) Механические (интенсивное перемешивание или встряхивание).Признаки денатураци:1) помутнение раствора белка, 2) изменение вязкости, 3) изменение реаактивности функциональных групп. 4) изменение биологической активности, 5) выпадение в осадок. Различают денатурацию обратимую и необратимую. Если убрать факторы, вызывающие денатурацию, и молекула белка денатурирует, то-есть восстанавливает все уровни структурной организации( вторичную, третичную и четвертичную), соответственно обретая все свои утерянные при денатурации физико-химические свойства и биологическую активность, то такой вид денатурации называется обратимым. Если же после удаления денатурирующих факторов физико-химические свойства и биологическая активность белка не восстанавливается, то это – необратимая денатурацию. Явление денатурации широко используется в медицине и биологии. Оно используется для целого ряда лабораторных исследований; при стерилизации инструмента и спецодежды; при кварцевании палат и операционных (вызывается денатурация белков микроорганизмов); в лечении онкобольных (облучение ионизирующим излучением + локальная гипертермия опухолей). Общие принципы выделения белков. Для изучения белка (будь то определение его структуры или биологических функций) первым делом необходимо выделить белок в чистом виде. Поскольку белковые вещества весьма чувствительны к повышению температуры и действию большенства химических реагентов (органических растворителей, кислот, щелочей и т.д.), обычные методы органической химии, применяемые для выделения того или иного вещества из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, экстракция, кристаллизация и т.д.) оказались в случае белков неприемлимыми. Белки в этом случае подвергаются денатурации, теряя свою биологическую активность. Поэтому разработаны эффективные методы выделения белков в мягких условиях, при пониженной температуре (не более +4 по Цельсию) с применением щадящих нативную структуру химических реагентов. Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани), исследуемый материал тщательно измельчают, вплоть до разрушения клеточной структуры. Этот процесс называется гомогенизация. Для этого используются различного рода гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультрозвук, метод «азотной бомбы “ (клетки насыщаются азотом под давлением, затем резко сбрасывают давление, а выделяющийся газообразный азот как бы "взрывает“ клетки). На следующем этапе из полученного гомогената тканей белки экстрагируют. Для экстракции белков широко применяются различные буферные смеси с определенным значением рН, органические растворители (водные растворы глицерина, слабый раствор глюкозы), различные ферменты, расщепляющие белково-липидные и белково-белковые связи (додецилсульфат натрия, дезоксихалат натрия и т.д.). После достижения полной экстракции белков (то-есть перевода в растворенное состояние), приступают к фракционированию белков, то-есть разделению смеси белков на отдельные белки. Часто фракционирование сочетается с идентификацией. Для этого используются различные методы: 1) электрофорез (различные виды: на бумаге, на геле, высоковольтный и т.д.). 2) ультроцентрифугирование 3) иммуно-химический анализ (антиген+антитело) 4) различные виды хроматографии 5) гельфильтрация. Для последующей очистки белков от низкомолекулярных примесей используются методы диализа, гельфильтрации, кристаллизации, ультрафильтрации и т.д. Все эти методы основаны на разной растворимости, разной осаждаемости, величине (диализ, гельфильтрация), разности зарядов (электрофорез, ионообменная хроматография). Иногда используют разную биологическую активность (это при фракционировании и очистке ферментов). Но об этом легко говорить, однако осуществить трудно. В общем случае необходима многостадийная обработка исходного материала, на каждой из этих стадий удаляется большая часть постороннего материала, присутствующего в образце после предидущей стадии разделения до тех пор, пока искомый белок не будет получен в чистом виде, без примесей. Универсальной методики выделения для всех белков не существует. Хорошим считается результат, когда очистка проходит 5-6 стадий. Например, выделение галоктозосвязывающего белка из кишечной палочки (участвует в транспорте галактозы через мембрану) включает следующие стадии: 1) гомогенизирование 2) осаждение протамином (для удаления ДНК иРНК) 3) осаждение сульфатом аммония (высаливание – снижает растворимость белка). 4) хроматография на целлюлозе 5) хроматография на гидроксил-апатите 6) хроматография на сефадексе Для определения степени очистки расчитывают удельную активность белка или используют метод аналитического центрифугирования. Очень эффективные методы: 1) афинная хроматография (1968 год – Анфинсен и сотрудники) – основан на специфическом связывании антиген-антитело. 2) изоэлектрофокусировка – использует различие в изоэлектрической точке белков (обычно используют полиакриламидный гель или агарозу) – на гель наносят слой белка, который мигрирует через области с различными рН, до тех пор, пока не достигнет изоэлектрического состояния. ОТКРЫТИЕ БЕЛКОВ В РАСТВОРАХ. Для открытия белков в растворах используют цветные реакции или реакции осаждения. Цветные реакции различают двух типов: 1)универсальные, когда реагент реагирует с пептидной связью (биуретовая, нингидриновая) – эти реакции характерны для всех белков. 2)специфические – когда реагент дает окрашенные производные с какими-то определенными аминокислотами (реакция Фоля – на серусодержащие аминокислоты, реакция Миллона – на тирозин, ксантопротеиновая – азотная кислота взаимодействует с ароматическими аминокислотами, вызывая их нитрование – появляется желтое окрашивание). Реакции осаждения делятся на необратимые (по сути, это – необратимая денатурация) и обратимые (высаливание). О денатурации мы уже говорили. Для высаливания применяются большие концентрации нейтральных солей: NaCl; (NH4)2SO4; MgSO4. При этом происходит дегидротация и снятие заряда, что является необходимым условием высаливания. На процесс высаливания влияет ряд факторов: молекулярная масса белка, гидрофильность, заряд белка и т.д. МЕТОДЫ КОЛЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ. Для количественного определения белка в растворе широко используются методы, основанные на использовании оптических свойств белков. 1)Рефрактометрический метод ( прибор рефрактометр) – чем больше концентрация белка в растворе, тем на больший угол отклоняется луч света, пропущенный через раствор белка, что и фиксируется прибором. 2)Нефелометрический метод (прибор – нефелометр). Основан на свойстве белковых растворов рассеивать свет. Соответственно, чем выше концентрация белка в растворе, тем больше степень рассеивания света. 3)Спектрофотометрический метод (прибор – спектрофотометр). Основан на свойстве раствора белка поглощать свет в ультрофиолетовой части спектора. Чем больше белка в растворе, тем больше поглощение этим раствором ультрафиолетовых лучей, что и фиксируется прибором. 4)Поляриметрический метод (прибор – поляриметр). Основан на зависимости вращения плоскости поляризованного света, пропускаемого через белковый раствор, от концентрации белка. 5)Кроме методов, основанных на оптических свойствах белка, широко используется колориметрический метод. Суть метода: проводят цветную реакцию и через окрашенный раствор белка пропускают свет с определенной длинной волны. Часть света поглощается окрашенным раствором белка. Степень поглощения зависит от концентрации белка в растворе. 6)В тех случаях, когда невозможно прямое определение белка в растворе, используют азотометрический метод. То-есть определяют не белок, а азот в растворе. Зная, что среднее содержание азота в белке составляет примерно 16%, легко, определив количество азота, рассчитать, сколько в растворе содержалось белка. СТРУКТУРА БЕЛКА. Белки обладают сложной пространственной структурой. Обычно принято говорить о четырех уровнях структурной организации белковой молекулы. 1)Первичная структура определяется: а)природой входящих в молекулу аминокислот; б)относительным количеством входящих в молекулу аминокислот; в)строго определенной аминокислотной последовательностью полипептидной цепи (или цепей). Если имеются простетические группы , их состав и количество также влияют на первичную структуру. Впервые первичную структуру для одного из белков (инсулина) определил в 1951 году Сенджер (потребовалось несколько лет). Он показал, что аминокислотная последовательность инсулина включает 51 аминокислоту. В 1975 году была установлена первичная последовательность аспартатаминотрансферазы (412 остатков). К настоящему времени известна аминокислотная последовательность примерно в 1500 белков. За прошедшее с тех пор время, методы исследования были значительно усовершенствованы и теперь определение аминокислотной последовательности вызывает меньше затруднений. Используя, в частности, автоматические секвенаторы, работающие с очень малыми количествами образца (10 в –12 степени моль). Расшифрована аминокислотная последовательность молекулы антитела альфа-глобулиновой фракции крови – установленная аминокислотная последовательность включает 1320 аминокислотных остатков! Необходимо отметить, что последовательность аминокислот закодирована в генах, поэтому при синтезе белка формирование первичной структуры происходит не спонтанно, а согласно информации, закодированной в генах. Для первичной структуры характерна видовая специфичность, то-есть каждый вид животных организмов имеет свою, неповторимую первичную структуру у белков, выполняющих одну и ту же функцию у разных видов. Например, инсулин человека, свиньи, собаки, коровы и так далее для каждого вида имеет свою последовательность аминокислот, хотя и выполняет аналогичную функцию. Поэтому введение инсулина каких либо животных человеку не дает биологического эффекта. Высшие уровни структуры белков, в частности, общая конформация и биологическая активность белка тесно связаны и фактически определяется аминокислотной последовательностью. Это убедительно подтверждают синтез Меррифильдом фермента рибунуклеазы (124 аминокислотных остатка). Этот синтезированный фермент принял такую же конформацию, как и нативный фермент и обладал такой же биологической (ферментативной) активностью. Получено много подобных фактов и с другими синтетическими белками (пептидами). Свидетельства другого рода накоплены на основании изучения серповидно-клеточной анемии – наследственной болезни, при которой способность эритроцитов связывать кислород снижается. Интактная молекула гемоглобина состоит из двух бэтта- цепей и двух альфа-цепей. Бэтта- цепь нормального гемоглобина взрослого человека в шестом положении содержит глутаминовую кислоту. В серповидных клетках (характерно измененной формы) – бэтта-цепь в шестом положении содержит валин. Все остальные аминокислоты в составе бэтта-цепи и альфа-цепи совершенно одинаковые. Несмотря на столь малое различие (при общем числе аминокислотных остатков равном 574), молекула гемоглобина S имеет сниженную спсобность связывать кислород, видимо из-за того, что молекулы гемоглобина S имеют тенденцию слипаться, образуя агрегаты большого размера, что и вызывает изменение формы эритроцитов и превращение их в серповидные. Деформированные эритриоциты могут задерживаться в узких кровяных сосудах, что еще больше снижает доставку кислорода в ткани. Они легко разрушаются, что вызывает анемию, Но было бы неправильно считать, что каждый аминокислотный остаток в каждом белке необходим для сохранения нормальной структуры и функции белка. Это не так. Например, были выявлены многие варианты аминокислотных последовательностей гемоглобина, функционирующие нормально. Вероятно, можно употреблять понятие о «необходимых» (существенных) и «допустимых замещениях» (малосущественных) остатках аминокислот в полипептидной цепочке белка. Исходя из изложенного, можно отметить важное значение первичной структуры белковых молекул: 1) определяет общую конформацию и биологическую активность белка, 2) Определяет видовую специфичность, 3) позволяет определять молекулярные патологии, 4)дает возможность синтезировать белок с заданными биологическим свойствами (впервые был синтезирован инсулин Сэнджером в 1964 году). Как же определить первичную структуру. Прежде чем приступить к секвенироированию, обычно проводят некоторые важные предварительные исследования, для чего необходимо иметь очищенный препарат белка. Определяют: 1)Молярную массу и оценивают чистоту препарта, а) колончатая хроматография (гельфильтрация – используется агароза или декстран); б) электрофорез в полиакриламидном геле (применяется для разделения, очистки, оценки чистоты и для определения молекулярной массы ); в) аналитическое ультроцентрифугирование. 2) Определяет тип и число простетических групп. При секвенировании иногда их отделяют от белковой части. 3) Определяются внутри- и межмолекулярные дисульфидные связи и однвременно определяется число сульфгидрильных групп цистеина. 4)Белки, имеющие чтвертичную структуру, разделяют на отдельные полипептидные цепи (изменяют pH, обрабатывают поверхностноактивными веществами и так далее). Природу и количество аминокислот, составляющих белок, определяют, проводя расщепление белка до отдельных аминокислот и затем анализируют эту смесь. Обычным методом расщепления служит кислотный гидролиз, или вместо соляной кислоты добавляют метансульфоновую кислоту. (12 –36 часов при температуре 100 – 110 градусов, чаще в атмосфере азота). Более мягкий метод – с использованием протеолитических ферментов (пептидаз), но здесь возможно «загрязнение» (кроме расщепления полипептида, они могут катализировать собственное расщепление). Качественно и количественно определяются аминокислоты с помощью хроматографии. Определение последовательности аминокислотных остатков в полипептидной цепи обычно начинается с определения концевых остатков. С-концевую аминокислоту можно определить обработав полипетид гидразином (NH2 – NH2 ), который реагирует с гидроксильными группировками в составе пептидной связи, но не образует соединения с концевой карбоксильной группой. Вследствие этого концевую (С - концевую) аминокислоту можно выделить и идентифицировать, используя хроматографические методы. Другой метод – обработка полипептида карбоксипептидазой (выделяется из желудочного сока). Она довольно специфично отщепляет С- концевые остатки полипептида. Необходимо контролировать только скорость отщепления аминокислотных остатков Аминопептидаза – атакует полипептидную цепь с другого конца. И карбоксипептидаза и аминопептидаза являются экзопептидазами, то-есть катализируют отщепление концевых аминокислотных остатков. Для идентификации N-концевой амино кислоты используют: реактив Сэнджера (2,4-динитрофторбензол), или реактив Эдмана (фенилизотиоционат) или дансилхлорид. Но именно при использовании реактива Эдмана расщепляется первая (а не несколько) пептидная связь. NO2        _NO2 |