Диплом сд. Сахарный диабет одно из наиболее частых хронических заболеваний, остается важнейшей проблемой здравоохранения практически всех стран
 Скачать 0.76 Mb.
|
|
Таблица 1 Основные различия ИЗСД и ИНСД (Балаболкин М. И. и др., 1994)
Материалы и методы исследования Материалом исследования явилась кровь 34 больных сахарным диабетом, находящихся на стационарном лечении в ГБУЗ НО «Городская клиническая больница № 28». Все больные были разделены на 2 группы: 1 группа – больные ИЗСД (15 человек) и 2 группа – больные ИНСД (19 человек). Возраст составил 21 - 72 года. В качестве контроля использовалась стандартная сыворотка крови человека. Общий объем исследования составил 210 опытов. Исследование гомеостаза крови больных осуществлялось фотометрически на полуавтоматическом биохимическом анализаторе CIBA CORNING. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерных программ «Биостатистика» и «Excel». 2.1. Определение глюкозы в сыворотке крови ферментативным методом Принцип метода: ферментативный метод исследования сочетает в себе высокую точность и техническую простоту анализа, он основан на глюкозооксидазной реакции. Глюкозооксидаза катализирует окисление глюкозы кислородом воздуха с образованием эквимолярных количеств глюколактона и перекиси водорода. Пероксидаза катализирует окисление хромогенных субстратов перекисью водорода в присутствии фенола с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы в пробе и измеряется фотометрически при длине волны 500 (480-520) нм (Медицинская…, 2001). Состав набора Реагент: буферно - ферментный раствор, содержащий калий фосфорнокислый - 250 ммоль/л, фенол - 5 ммоль/л, 4-аминоантипирин - 0,5 ммоль/л, глюкозооксидазу - 10000 Е/л, пероксидазу- 1000 Е/л. Калибратор: калибровочный раствор глюкозы - 5,55 ммоль/л, в растворе азида натрия, 0,095%. Аналитическая характеристика Набор обеспечивает линейную область определения концентрации глюкозы в диапазоне от 1,0 ммоль/л до 22 ммоль/л, отклонение от линейности не превышает 5%. Чувствительность - не более 0,5 ммоль/л, коэффициент вариации результатов определений - не более 5%. Нормальные величины концентрации глюкозы в сыворотке или плазме крови человека составляют 3,8 -6,1 ммоль/л. Проведение анализа Компоненты реакционной смеси отбирали в количествах, указанных в таблице 2. Таблица 2 К
омпоненты реакционной смеси для определения глюкозы Соотношение сыворотки крови к реагенту составляет 1:100 Пробы перемешали и инкубировали при температуре + 37° С в течение 10 мин или при комнатной температуре (+ 18 - 25° С) в течение 20 мин. Измерили оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной (холостой) пробы при длине волны 500 (480-520) нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. При содержании глюкозы в сыворотке или плазме крови выше 22 ммоль/л анализируемую пробу следует развести физиологическим раствором и полученный результат умножали на разведение. 2.2. Определение мочевины в сыворотке крови ферментативным методом Принцип: Ферментативный тест для количественного определения мочевины в сыворотке и плазме крови или моче человека. Мочевина в присутствии уреазы гидролизуется с образованием аммиака и CO2. Образовавшийся аммиак в присутствии глутаматдегидрогеназы (ГЛДГ) реагирует с 2-оксоглютаратом и НАДН с образованием глютамата и НАД. Снижение абсорбции вследствие снижения концентрации НАДН в единицу времени пропорционально концентрации мочевины. Аммиак, который образуется в результате различных процессов распада, также определяется этим методом (Медицинская…, 2001). Реагенты:_Цветовой_реагент/_R_1'>Реагенты: Реагент/R1: TRIS буфер, pH 8, 0 80 ммоль/л 2-оксоглютарат 15 ммоль/л Реагент/R2: ГЛДГ 6000 Ед/л НАДН 0,32 ммоль/л Уреаза >100 Ед/мл Реагент/R4: Мочевина 50мг/дл (8,33 ммоль/л) TRIS – гидроксиметил-аминометан Разводили фермент/R2 в буфере/R1 путем осторожного перемешивания в течение 30 мин. Исследовали сыворотку, гепаринизированную или цитратную плазму. Ход работы: Смешивали 10 мкл исследуемой сыворотки, 10мкл Калибратор/R4, 1000мкл рабочего раствора. Измерение проводили при длине волны 340нм, Hg 334 нм температуре: +25˚С/+37˚С, в кювете с оптическим путем 1 см. 2.3. Определение содержания креатинина в сыворотке крови Принцип: Кинетический колориметрический тест in vitro с использованием бланка пробы и компенсации для количественного определения креатина в сыворотке и плазме крови и моче человека. Креатинин + пикриновая кислота → креатинин – пикриновокислый комплекс В щелочной среде креатинин образует с пикриновой кислотой комплекс желто-оранжевого цвета. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации креатинина и может быть измерена фотометрически. Реагенты: Реагент/R1: Пикриновая кислота 70 ммоль/л Реагент/R2: Гидроксид натрия 0,32 моль/л Реагент/R4: Креатинин 2 мг/дл Разводили 1 часть раствора пикриновой кислоты/R1 в 1 части раствора гидроксида натрия/R2. Ход работы: Смешивали 10 мкл сыворотки и 1000 мкл рабочего раствора. Измерение проводили при длине волны 492 нм, температуре : +25˚С/+37˚С, в кювете с оптическим путем 1 см. Смешали, сразу перенесли в кювету. Точно через 20 секунд считали А1 пробы и стандарта. Точно через 80 секунд после первого считывания считали А2 пробы и стандарта и вычислить Δ (Медицинская…, 2001). Определение содержания общего билирубина в сыворотке крови Принцип: Тест in vitro для количественного определения общего билирубина в сыворотке и плазме крови человека методом Ван Дер Берга и Мюллера. Интенсивность полученной окраски пропорциональна количеству билирубина, вступившего в реакцию. В присутствии кофеина и сурфактанов в качестве катализаторов реакции конъюгированный и свободный билирубин реагируют одинаково, поэтому определяется концентрация общего билирубина пробы. Реагенты: Цветовой реагент/R1: 3,5-дихлорфенил-диазо-тетрафторборат 0,2 ммоль/л Кофеин 50 ммоль/л Сурфактаны и стабилизаторы < 3,0 % Ход работы: Смешивали 10 мкл сыворотки, 1000 мкл реагента R1 и 1000мкл рабочего раствора. Измерение проводили при длине волны 500-550 нм, Hg 546 нм температуре: +25˚С/+37˚С, в кювете с оптическим путем 1 см. Смешали и инкубировали 10 минут при +25˚С или 5 минут при +37˚С. Считали абсорбцию пробы против реагент-бланка (Мазовецкий А. Г., Волков В. К., 1987). 2.5. Определение активности аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови Принцип теста: Тест in vitro для количественного определения аспартаминотрансферазы (АСТ) в сыворотке или плазме крови человека. УФ - тест согласно стандартной методике: 2 – оксоглутарат + L – аспартат АСТ L – глюкамат + оксалацетат АСТ – фермент, который катализирует эту реакцию равновесия. Увеличение оксалацетата измеряется в дополнительной индикаторной реакции, которая катализируется малатдегидрогеназой. Оксалацетат + НАДН + Н МДГ L – малат + НАД Во второй реакции НАДН окисляется до НАД. Скорость уменьшения НАДН (измеримая фотометрически) прямо пропорциональна скорости образования оксалацетата и, соответственно, активности АСТ. Реагенты: Реагент/R1: Трис буфер рН 7,8 100 ммоль/л L-аспартат 200 ммоль/л Лактатдегидрогеназа 800 Ед/л Малатдегидрогеназа 600 Ед/л Реагент/R2: НАДН2 0,18 ммоль/л 2-оксоглютарат 12 ммоль/л Ход работы: Смешали 5 частей реагента R1 с 1 реагента R2 Смешивали 100 мкл сыворотки и 1000 мкл рабочего раствора. Измерение проводили при длине волны 340 нм, Hg 334 нм, температуре: +25 / +30 / +37˚С, в кювете с оптическим путем 1 см. Смешали, инкубировали 1 мин. при температуре теста и одновременно запустили секундомер. Снова считали абсорбцию через 1, 2 и 3 минуты. 2.6. Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови Принцип теста: Тест in vitro для количественного определения аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке или плазме крови человека. УФ - тест согласно стандартной методике: 2 – оксоглутарат + L – аланин АЛТ L – глютамат + пируват АЛТ – фермент, который катализирует эту реакцию равновесия. Увеличение пирувата измеряется в дополнительной индикаторной реакции, которая катализируется лактатдегидрогеназой. Пируват + НАДН + Н ЛДГ L – лактат + НАД Во второй реакции НАДН окисляется до НАД. Скорость уменьшения НАДН (измеримая фотометрически) прямо пропорциональна скорости образования пирувата и, соответственно, активности АЛТ. Реагенты: Реагент/R1: Трис буфер рН 7,8 100 ммоль/л L-аланин 500 ммоль/л Лактатдегидрогеназа 1200 Ед/л Реагент/R2: НАДН2 0,18 ммоль/л 2-оксоглютарат 15 ммоль/л Ход работы: Смешали 5 частей реагента R1 с 1 частью реагента R2 Смешивали 100 мкл сыворотки и 1000 мкл рабочего раствора. Измерение проводили при длине волны 340 нм, Hg 334 нм, температуре: +25 / +30 / +37˚С, в кювете с оптическим путем 1 см. Смешали, инкубировали 1 мин. при температуре теста и одновременно запустили секундомер. Снова считали абсорбцию через 1, 2 и 3 минуты (Мазовецкий А. Г., Волков В. К., 1987). 2. 7. Определение амилазы в сыворотке крови Принцип теста: Ферментативный тест in vitro для количественного определения α-амилазы в сыворотке или плазме крови или моче человека. Ферментативный колориметрический тест Некоторые олигосахариды, такие как 4,6 – этилиден – (G7) p – нитрофенил (G1) – α D – мальтогептазид ( этилиден - G7PNP), разлагаются в результате каталитического влияния α –амилаз. Образующиеся фрагмента G2PNP, G3PNP и G4PNP полностью гидролизуются до р – нитрофенола и глюкозы под воздействием α – глюкозидазы. 5этилиден – G7PNP + H2O → 2этилиден – G5 + 2G2PNP + 2этилиден – G4 +2G3PNP + этилиден – G3 + G4PNP 2GPNP + 2G3PNP + G4PNP + H2O → 5PNP + 14G Интенсивность окраски р-нитрофенола прямо пропорциональна активности α – амилазы и может быть измерена фотометрически. Реагенты: Реагент/R1: Hepes буфер, рН 7,1 100ммоль/л NaCl 50 ммоль/л MgCl2 10ммоль/л Реагент/R2: α – глюкозидаза >23Ед/л 4,6 – этилиден – G7 – PNP 3 ммоль/л Hepes = 2[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]-этаносульфоновая кислота Ход работы: Смешали один флакон реагента R1 (фермент/субстрат) с соответствующим объемом реагента R2 (буфер). Смешивали 50 мкл сыворотки, 2500 мкл рабочего раствора. Измерение проводили при длине волны 400 нм, Hg 405 нм, температуре: +25˚С/+30˚С/+37˚С, в кювете с оптическим путем 1 см. Смешали и инкубировали 3 мин. при Т +25˚С - +30˚С, 2 мин. при Т +37˚С. Считали абсорбцию и запустили секундомер. Снова считали абсорбцию точно через 1, 2 и 3 минуты. Определили ΔА/мин и использовали его для вычисления. |