Диплом сд. Сахарный диабет одно из наиболее частых хронических заболеваний, остается важнейшей проблемой здравоохранения практически всех стран
 Скачать 0.76 Mb.
|
|
2.8. Определение уровня холестерина в сыворотке крови ферментативным методом Принцип: ферментативный тест in vitro для количественного определения холестерина в сыворотке крови человека. Холестерин определяется ферментативно с применением холестеринэстеразы и холестериноксидазы. Эфир холестерина + H2O → холестерин + жирные кислоты Эфир холестерина расщепляется под влиянием холинэстеразы, образуя свободный холестерин и жирные кислоты. Холестерин + О2 → холистен-3-он + H2O2 под хинониминовое 2H2O2 + фенол + 4-аминоантипирин → окрашивание + 4 H2O Холестерин превращается в ∆-холестенон и перекись водорода под влиянием кислорода в присутствии холестериноксидазы. Образовавшаяся перекись водорода дает красное окрашивание в реакции с 4- аминоантипирином и фенолом в результате каталитического воздействия пероксидазы (ПОД). Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации холестерина и может быть измерена фотометрически (Медицинская…, 2001). Реагенты: Реагент/R1: Pipes буфер, рН 6,9 90 ммоль/л Фенол 26 ммоль/л Холестериноксидаза (ХО) 200 Ед/л Холестеринэстераза (ХЭ) 300 Ед/л Пероксидаза (ПОД) 1250 Ед/л 4- аминоантипирин 0,4 ммоль/л Реагент/R4: Холестерин 5,17 ммоль/л Ход работы: Смешали 10 мкл сыворотки и 1000 мкл Реагент R1. Измерение проводили проводили при длине волны 500 нм, Hg 334 нм, температуре: +25 / +30 / +37˚С, в кювете с оптическим путем 1 см. Смешали, инкубировали 5 мин. при +37˚С или 10 мин. при +20˚С - +25˚С. В течение 60 мин. считали абсорбцию. 2.9. Определение уровня гликозилированного гемоглобина в крови ферментативным методом Принцип метода: гемолизат эритроцитов подвергают кислотному гидролизу с образованием 5-оксиметилфурфурола, который определяли спектрофотометрически по реакции с тиобарбитуровой кислотой. Это позволяет судить об уровне HbA1c в эритроцитах. Реактивы: 1. 0,3н. раствор щавелевой кислоты. 2. 40 % раствор трихлорусусной кислоты (ТХУ). 3. 0,05 М раствор тиобарбитуровой кислоты (ТБК) 4. Физиологический раствор. Забор крови: В центрифужную пробирку с гепарином или цитратом натрия отбирали 3 мл крови. Приготовление гемолизата эритроцитов: взятую кровь центрифугировали, плазму отбирали, эритроциты промывали 3 раза физиологическим раствором. Полученную эритроцитарную массу гемолизировали, добавляя бидистиллированную воду (1 объём эритроцитов: 9 объёмов бидистиллированной воды) и тщательно перемешивали. Ход работы: К 2 мл гемолизата добавляли 1 мл 0,3 % н. раствора щавелевой кислоты, помещали в центрифужную пробирку с притертой пробкой и инкубировали 1 час в кипящей водяной бане при 1000С. Охлаждали при комнатной температуре. Добавляют 1 мл 40 % раствора ТХУ и хорошо взбалтывали. Центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. К 2 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,5 мл 0,05 М раствора ТБК и перемешивают. Инкубировали при 400С 40 минут. Экстинкцию раствора измеряли на спектрофотометре при длине волны 443 нм в кювете 1 см. Расчет: Концентрацию гликозилированного гемоглобина рассчитывали, исходя из того, что 1 % гемоглобина равен оптической плотности 0,029, то есть: Х =(экстинкция раствора / 0,029) = % HbA1c 3. Результаты и их обсуждение 3.1. Уровень глюкозы Наиболее частым показателем углеводного обмена является содержание сахара в крови. С помощью данного анализа можно выявить сахарный диабет. Стойкое повышение сахара в крови наблюдается также при других заболеваниях эндокринных желез. Повышение уровня содержания глюкозы говорит о нарушении обмена углеводов и свидетельствует развитии сахарного диабета. Глюкоза — низкомолекулярный углевод, универсальный источник энергии для клеток, главное вещество, из которого любая клетка человеческого организма получает энергию для жизни. Потребность организма в энергии, а значит, в глюкозе, увеличивается параллельно физической и психологической нагрузке под действием гормона стресса — адреналина. Кратковременное повышение возникает при эмоциональном возбуждении, стрессовых реакциях, болевых приступах, после приема пищи. Для усвоения глюкозы клетками необходимо нормальное содержание инсулина — гормона поджелудочной железы. При его недостатке (сахарный диабет) глюкоза не может пройти в клетки, уровень ее содержания в крови повышен (Кохн К. Р.,1985). В зависимости от типа диабета выявляются следующие изменения: при диабете 1 типа (ИЗСД) гипергликемия выше 12-15 ммоль/л при диабете 2 типа (ИНСД) гипергликемия выше 6,2 ммоль/л Тяжесть течения сахарного диабета отражает уровень глюкозы натощак, составляющий: при легкой степени – 6,7-7,8 ммоль/л при средней тяжести – 7,8-14 ммоль/л при тяжелой степени – стойкая гипергликемия выше 14 ммоль/л Наиболее тяжелым проявлением СД являются диабетические комы: гиперкетонемическая – 16-18 ммоль/л и выше гиперосмолярная – 33-34 ммоль/л и выше гиперлактацидемическая – 13-15 ммоль/л или норма гипогликемическая – 2,5-3,5 или норма Исследовали уровень глюкозы в крови у больных СД 1 типа (15 человек) и 2 типа (19 человек) (табл. 3). Таблица 3 Уровень глюкозы в крови больных СД 1 и СД 2 типа (Ммоль/л, норма 3, 8 – 6, 1)
 Из полученных результатов следует, что уровень глюкозы в крови больных СД 1 типа превышает уровень глюкозы в крови больных СД 2 типа на фоне общего достоверного превышения по сравнению с нормой. Лишь у троих больных СД 1 типа уровень сахара в крови превышает норму в четыре раза (рис. 4.).Рис. 4. Уровень глюкозы у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов *- статистически значимые различия по сравнению с нормой (p< 0,05) ** - статистически значимые различия СД 1 типа по сравнению с СД 2 типа (p< 0,05) У больных сахарным диабетом 1 типа легкой степени течения заболевания не наблюдалось. У 4 человек отмечена средняя степень тяжести, у 9 - тяжелая степень течения заболевания. Результаты исследования представлены в таблице 4. Таблица 4 Уровень глюкозы в сыворотке крови больных сахарным диабетом при разной степени тяжести
Во второй группе у большинства больных (14 человек) выявлена средняя степень тяжести (уровень глюкозы в крови превышал норму почти в два раза), у 5 пациентов – легкая степень тяжести. В группе больных сахарным диабетом 2 типа пациентов с тяжелой степенью не обнаружено. Параллельно с измерением уровня глюкозы в крови определяли такие показатели, как содержание билирубина, холестерина, мочевины, креатинина, гликозилированного гемоглобина; активность ферментов: АСТ, АЛТ, амилазы. Результаты представлены в таблице 5. Таблица 5 Биохимические показатели крови больных сахарным диабетом
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||