Микробиология. билеты все (копия). Строение бактериальной клетки. Споры и капсулы структура, расположение в клетке. Значение для бактериальной клетки. Методы обнаружения спор и капсул. Методы обеззараживания спороносной культуры
 Скачать 382.85 Kb.
|
|
РТГА-Реакция торможения гемагглютинации Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т. е. тормозят реакцию гемагглютинации. Высокая специфичность реакции торможения гемагглютинации (РТГА) позволяет с ее помощью определить вид и даже тип вирусов, обнаруженных при постановке РГА. Учет результатов производят после повторной инкубации в термостате в течение 30 или 45 мин при комнатной температуре. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться «пуговка» - нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется «зонтик»-внрус вызвал агглютинацию эритроцитов. В опыте, если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется «пуговка» - сыворотка нейтрализовала вирус. Титр сыворотки – это ее максимальное разведение, в котором происходит задержка гемагглютинации. РНГА- реакция непрямой гемагглютинации Принцип Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену. Учёт по 4-крестной системе Контроли: взвесь эритроцитарного диагностикума с заведомо иммунной сывороткой, взвесь диагностикума с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем ее не должно быть. ++++ полная геагглютинация, эритроциты равномерно устилают днот лунки (зонтик) +++ почти все эритроциты агглютинировались, равномерно покрывают дно лунки. ++ половина агглютинированы , на дне осадок в виде колечка из неагглютинированных эритроцитов. + большинство эритроцитов осело на дно лунки в виде пуговки. Титр реакции - последнее разведение, которое даёт положительную реакцию АГ эритроцитов не менее чем на +++. Реакция преципитации – это реакция, основанная на взаимном соосаждении коллоидных растворов АГ и АТ иммунной сыворотки при их применении. Результат: + наличие "кольца"; - отсутствие "кольца Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле). Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.). Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) – это реакция, основанная на способности специфически адсорбировать на своей поверхности специфические микробные АГ. Сенсибилизированные таким образом эритроциты агглютинируются в присутствии гомологичной для АГ сыворотки, образуя на дне гемагглютинат. Эритроциты адсорбировавшие на своей поверхности АГ, становятся «чувствительными» (сенсибилизированными) к соответствующей иммунной сыворотке. Результат: ++++ полная гемагглютинация, эритроциты равномерно устилают дно лунки (напоминая зонтик) +++ почти все эритроциты агглютинированы и равномерно покрывают дно лунки ++ наряду с равномерным агглютинатом на дне лунки имеется осадок в виде колечка или пуговки из неагглютинированных эритроцитов + большинство эритроцитов осело в центре дна лунки в виде компактного колечка или «пуговки» и лишь незначительная часть агглютинированные эритроциты. РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА (ИММУННЫЙ ЦИТОЛИЗ) Механизм;Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Учет результатов. При правильно поставленной реакции в 1-й пробирке произойдет гемолиз — содержимое ее станет прозрачным. В контролях жидкость остается мутной: во 2-й пробирке для наступления гемолиза не достанет комплемента, в 3-й - нет гемолизина, в 4-й - нет ни гемолизина, ни комплемента, в 5-й -антиген не соответствует антителу Реакция иммунофлюоресценции. В реакции иммунофлюоресценции (РИФ) используют люминесцентную микроскопию для серологических исследований. Реакция основана на том, что иммунные сыворотки, к которым химическим путем присоединены флюорохромы, при взаимодействии с соответствующими антигенами образуют специфический светящийся комплекс, видимый в люминесцентном микроскопе.РИФ широко применяют при экспресс (ускоренной)-диагностике ряда инфекций. Реакция связывания комплемента (РСК) – это реакция основана на том, что при взаимодействии опытной системы АГ и АТ образуется специфический комплекс, который связывает комплемент. Процесс взаимодействия АТ и АГ является невидимым поэтому на 2 этапе в реакцию вводят вторую заведомо специфическую индикаторную систему (гемолитическую), которая свидетельствует о результате РСК. Результат: ++++ полная задержка гемолиза. Эритроциты образуют равномерную муть или оседают на дно. В этом случае жидкость в пробирке становится бесцветной; +++ лизировано примерно 25% эритроцитов. Осадок меньше, жидкость над ним слегка розовая. Результат РСК также оценивают как резко положительный; ++ лизировано примерно 50% эритроцитов. Осадок небольшой, жидкость розовая. Положительный результат РСК; + лизировано примерно 75% эритроцитов. Незначительный осадок, над ним интенсивно окрашенная жидкость. Сомнительный результат РСК; - лизированы все эритроциты. Жидкость интенсивно окрашена и совершенно прозрачна. Отрицательный результат РСК. РСК Принцип- основан на том, что при взаимодействии в опытной системе АГ и АТ образуется специфический комплекс АГ+АТ, который связывает комплемент. Ингредиенты: Сыворотка- полученная на кануне постановки р-ии подогревается на водяной бане при t-56° в течении 30 мин для инактивации ее собственного комплекса. Эритроциты барана- готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов. Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные количества разведенной сыворотки и взвеси эр, перемешивают и инкубируют 30 мин при t-37° Комплемент-смесь сывороток, полученных от 3-5 морских свинок, перед употреблением сыворотку разводят изотоническим раствором NаCl в соотношении 1:10 получая основной раствор. АГ- обычно получают готовым с указанием его титра, т.е. того количества, которое после разведения АГ должно содержаться в 1мл. АТ-сыворотка больного. Перед опытом сыворотку инактивируют чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30мин при 56°С на водяной бане. Техника постановки: 1 фаза: в пробирки разливают изотонический р-р NaCl и сыворотку, и рабочие дозы АГ и комплемента. Пробирки встряхивают и инкубируют при 37°С 45 мин, за это время при наличии специфического комплекса происходит склеивание комплемента. 2фаза: по окончанию инкубации во все пробирки (7) добавляют по 1мл гемолитической системы, которую предварительно выдерживают в термостате 30 мин. Пробирки встряхивают и ставят в термостат. Проводят учет: ++++ полная задержка гемолиза. Эр образуют равномерную муть или оседают на дно. +++ лизировано 25% эр. Осадок меньше, жидкость над ним слегка розовая. Резко положительная реакция РСК ++ лизировано 56% эр. Осадок небольшой, жидкость розовая. Положительная реакция РСК. + лизировано 75% эр. Незначительный осадок, над ним интенсивно окрашенная жидкость. Сомнительный результат РСК. -лизированы все эр. Жидкость интенсивно окрашена и прозрачна. Отрицательный результат РСК. 2. Возбудители вирусных инфекций. Вирусы – возбудители ОРВИ. Вирус гриппа – характеристика биологических свойств. Методы вирусологической диагностики гриппа. Острые респираторные вирусные инфекции являются большой и разнообразной группой заболеваний, с общим механизмом передачи, которые проявляются катаральным воспалением верхних дыхательных путей и протекают с лихорадкой, ринитом, чиханием, кашлем, болью в горле, нарушением общего состояния разной выраженности. Наиболее часто возбудителями ОРВИ являются РНК-содержащие вирусы, представители семейств: – Orthomyxoviridae – Coronaviridae – респираторные коронавирусы; – Paramyxoviridae – Picornaviridae – пикорнавирусы – Reoviridae – респираторные реовирусы. Из ДНК-содержащих вирусов наибольшее значение имеют представители семейств Parvoviridae и Adenoviridae. Грипп - распространенное острое инфекционное заболевание дыхательных путей, имеющее эпидемический характер и поражающее большие массы людей. Возбудители гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae (от лат. myxomatosis - слизистый). Они обладают выраженным тропизмом к слизистым оболочкам верхних дыхательных путей. Это семейство включает вирусы, вызывающие заболевания у человека, животных и птиц. Морфологическая структура. Структура вирионов гриппа сложна. В ее составе имеются однонитчатая РНК, нуклеокапсид спиральной формы и защитная липидоуглеводопротеиновая оболочка. Количество капсомеров точно не установлено. Вирионы имеют в основном сферическую форму, но встречаются и вирионы нитевидной формы. Оболочка имеет выступы (шипы) - пепломеры. РНК синтезируется в ядре клетки хозяина. Вирусные белки синтезируются в цитоплазме. Формирование вирионов происходит вблизи оболочки клетки. Культивирование. Вирус гриппа хорошо размножается в курином эмбрионе (в клетках амниотической или аллантоисной полостей). Культивировать его можно также в культуре клеток почек обезьян, эмбриона человека и др. Антигенная структура. Вирусы гриппа имеют S-антиген, по которому в реакции связывания комплемента они подразделяются на типы А, В, С. У вируса А обнаружены еще два антигена: гемагглютинин и нейраминидаза. Гемагглютинин имеет четыре подтипа (Н0, Н1, Н2, Н3), а нейраминидаза - два (N1 и N2). По сочетанию этих антигенов определяют подтип вируса, который меняется при разных эпидемиях. Вариабельность сочетания этих антигенов определяет изменчивость вируса А. Вирус типа В более устойчив. Самый устойчивый тип С. Типы и подтипы вирусов не дают перекрестного иммунитета. Вирусы гриппа обладают общим антигеном с изоантигенами эритроцитов человека. Устойчивость к факторам окружающей среды. Температура 65° С губит вирусы гриппа через 5-10 мин. При 50°С он утрачивает свои инфекционные свойства через несколько минут. При комнатной температуре вирус инактивируется через несколько часов. В кислой, щелочной среде, под влиянием эфира и дезинфицирующих растворов он погибает очень быстро. Вирус очень чувствителен к действию УФ-лучей и ультразвуку. Он устойчив к действию глицерина, в котором может сохраняться несколько месяцев. Источники инфекции. Больной человек. Пути передачи. Воздушно-капельный (при разговоре, кашле, чиханье). Патогенез. Вирус попадает на слизистую оболочку верхних дыхательных путей. Проникнув в организм человека, он внедряется в эпителиальные клетки верхних дыхательных путей, откуда проходит в кровь и вызывает явления интоксикации. В слизистой оболочке вирус вызывает гибель клеток. Это создает условия для проникновения других микроорганизмов, вызывающих вторичную инфекцию - пневмонию, бронхит и др. Активируются бактерии, локализующиеся в верхних дыхательных путях, - возникает аутоинфекция. Кроме того, вирус гриппа активирует хронические заболевания, такие как туберкулез и др. Иммунитет. Формируется главным образом за счет антигемагглютининов, которые обладают вируснейтрализующими свойствами - препятствуют адсорбции вирусов на чувствительной клетке. Большую роль играют антинейраминидазные антитела. Защита организма обусловливается также интерфероном и другими ингибиторами, находящимися в сыворотке крови человека. Обычно иммунитет носит типо- и штаммоспецифический характер. Смена подтипов вируса А исключает надежную защиту организма от этой инфекции, так как перекрестного иммунитета нет, а прогнозировать направление изменчивости пока не удается. Профилактика. Изоляция больного, проветривание помещения, влажная уборка и т. д. Важно также предупреждение охлаждения, которое снижает выработку такого защитного фактора как интерферон. Специфическая – вакцинация. ВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА Вирусологический метод – выделение и ориентировочная идентификация вируса на куриных эмбрионах, в культурах клеток, в организме чувствительных животных. После специальной обработки собранных смывов и прибавления к ним по 500 МЕ пенициллина и 250 ЕД стрептомицина их используют для заражения 9-11дневных куриных эмбрионов. Размножение вирусов обнаруживают через 3 дня при помощи реакции гемагглютинации. Антигеном служит аллантоисная жидкость куриных эмбрионов, в которых размножился вирус. Штаммовую принадлежность определяют по РТГА с соответствующими иммунными сыворотками (сыворотки получают от животных, иммунизированных соответствующими типами вирусов). Риноцитоскопический метод. Это исследование является ориентировочным. Отпечатки, взятые с поверхности нижней носовой раковины, окрашивают по Романовскому и микроскопируют. При гриппе в препаратах обнаруживают измененный цилиндрический эпителий, клетки которого лишены ресничек. Кроме того, в цилиндрических клетках находят включения, окрашивающиеся по Романовскому в фиолетовый цвет. Изменения цилиндрического эпителия и выявление включений обнаруживают обычно в первый период заболевания. К ускоренным методам относится также метод иммунофлюоресценции. Мазки-отпечатки обрабатывают иммунофлюоресцентными типоспецифическими антисыворотками. Наличие вируса гриппа в эпителиальных клетках вызывает желтовато-зеленое свечение. Серологическая диагностика Для ретроспективной диагностики используют метод парных сывороток. У больного берут кровь в начале заболевания и в период выздоровления. С полученными сыворотками ставят РСК и РТГА. Антигеном служат диагностические гриппозные антигены. Положительный сероднагноз гриппа учитывается по четырехкратному и более нарастанию титра антител во-вторых порциях сывороток (реакция парных сывороток). 3. Из гноя фурункула выделена культура микроорганизмов, которая является факультативным анаэробом, хорошо растёт на 1) S. aureus 2) Р-ию плазмакоагуляцию, расщип маннита в анаэроб условиях, лецитовитилазнаяактивность, ДНК-за, чувть к новобиозу, гемолиз эртьроцитов. 3)Фурункулы, карбункулы, понариции, цисты, ангины, маститы. От поражения кожи до сепсиса. 20 билет. 1.Методы микробиологической диагностики (перечислить, охарактеризовать). Для обнаружения возбудителя в материале от больного с диагностической целью применяют: 1) микроскопические (бактериоскопические, микоскопичес-кие, вирусоскопические) методы; 2) микробиологические (бактериологические, микологичес кие, вирусологические) методы; 3) биологические методы, или биопробы. 1. Микроскопические методы.Микроскопические методы применяют для обнаружения возбудителей (бактерий, грибов, простейших, вирусов) непосредственно в исследуемом мате риале. Для выявления бактерий (бактериоскопические ис следования), а также грибов и простейших применяют све товые методы микроскопии окрашенных или нативных пре паратов, приготовленных из материала, полученного от боль ного (см. тему 1.1 иглаву 2). Преимущество микроскопическихисследований состоит в быстроте (осуществление требует не более 30—60 мин), про стоте и дешевизне. Основным недостатком метода является низкая специфичность — невозможность видовой идентифика ции обнаруженных микроорганизмов, а в ряде случаев — их дифференциации между собой (например, эшерихий, сальмо нелл и шигелл). Чувствительность также невысока: микроско пический метод позволяет обнаружить возбудителя при его концентрации не менее 10б микробных клеток в 1 мл или 1 г исследуемого материала. В большинстве случаев микроскопический метод имеет ори ентировочное значение и позволяет получить предварительные данные о микробах, присутствующих в материале, и наметить пути дальнейших исследований. Вместе с тем при некоторых бактериальных инфекциях, а также при микозах и протозой- Микробиологические методы.Основаны на выделении чистой культуры возбудителя из материала, полученного от больного, и ее последующей идентификации (см. главу 3). Микробиологические методы отличаются высокой чувстви тельностью и специфичностью. Располагая чистой культурой возбудителя, можно определить его родовую ивидовую при надлежность иосуществить внутривидовое типирование, обна ружить факторы вирулентности, а также определить чувстви тельность к антибиотикам, что необходимо для рационального выбора этиотропной терапии. Для эпидемиологического анализа вспышек инфекционных заболеваний проводят типирование культур возбудителей, вы деленных от разных больных и из внешних объектов — веро ятных источников заражения (вода, пищевые продукты ит.д.), т.е. определение их биовара: серовара (серотипирование, см. тему 10.1), фаговара (фаготипирование, см. тему 5.3) ит.д. Кроме того, микробиологические исследования проводят для выявления носительства патогенных микробов среди детей и взрослых, а также среди работников медицинских учреждений, предприятий пищевой промышленности и общественного пи тания. Бактериологическое исследование является ведущим в диагностике большинства бактериальных инфекций. Труд ности метода могут быть связаны с низкой скоростью размно жения бактерий-возбудителей, сложными ростовыми потреб- 3. Биологические методы (биопробы).Биопробу осуществля ют путем заражения лабораторных животных материалом, по лученным от больного. Этот метод применяют для выделения чистой культуры возбудителя в тех случаях, когда микроорга низмы не растут или плохо культивируются, когда микробио логические методы не дают однозначно положительного ре зультата, а также для дифференциации патогенных микроор ганизмов и определения их вирулентности. Дифференциация возбудителей основана на неодинаковой чувствительности раз ных лабораторных животных к определенным микроорганиз мам. В настоящее время биопробы применяют только в случае крайней необходимости, что определяется в первую очередь гуманным отношением к животным, а также связано с повы шенным риском заражения персонала диагностической лабо ратории. |