Иммунология,ответы на тесты. Тесты коллоквиум 2 Верно Возможный ответ Неверно Выберите характеристики, относящиеся к ртга (рзга)

• Название: Тесты коллоквиум 2 Верно Возможный ответ Неверно Выберите характеристики, относящиеся к ртга (рзга)
• Анкор: Иммунология,ответы на тесты
• Дата: 06.07.2022
• Размер: 2.49 Mb.
• Имя файла: IMMUNOLOGIYa_testy-otvety_1.docx
• Тип: Тесты; #625678
• страница: 2 из 13

Имунодиагностика. Преципитирующие антигены и антитела. РП, РДП, РИЭОФ при диагностике бактериальных и вирусных болезней.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП)

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП), как и реакция агглютинации, принадлежит к разряду серологических реакций осадочного типа, но в отличие от РА в них  используют не корпускулярные, а растворимые антигены микроорганизмов. Образование комплексов антиген-антитело сопровождается изменением оптической плотности среды (помутнение) в зоне контакта иммунной сыворотки и растворимого антигена. Через некоторе время комплекс Аг-Ат выпадает в осадок.

Растворимые антигены получают посредством механического разрушения микроорганизмов или термической, химической экстракции.

На основе преципитации разработаны реакции кольцепреципитации и реакции диффузионной преципитации.

Метод кольцеприципитации по Асколи

Реакция кольцеприципитации (РКП)  разработана для диагностики сибирской язвы. Обязательное условие постановки РКП- прозрачность раствора антигена и иммунной сыворотки, поэтому при необходимости компоненты освобождают от взвешенных частиу фильтрованием, например, через асбестовую вату. РКП может быть проведена в трех вариантах:

 Метод «наслаивания» антигена. В уленгутовские пробирки (диаметр 2-3мм) вносят пастеровской пипеткой с тонким капилляром, не смачивая стенок пробирки 0,3-0,4 мл иммунной преципитирующей сыворотки. Затем по стенке пробирки осторожно наслаивают на поверхность сыворотки 0,1-0,2 мл растворимого исследуемого антигена (преципитиногена). Смешивание компонентов не происходит благодаря различию плотности сыворотки и экстракта. Учет результатов проводят на фоне темной бумаги. Через 1-2 мин на границе контакта компонентов происходит помутнение среды, видимое как серо-белый диск (кольцо, преципитат).

 Метод «подслаивания» антител. В пробирку вначале вносят антиген, а затем осторожно при помощи пастеровской пипетки на дно пробирки, под антиген, «подслаивают» иммунную сыворотку.

 Микровариант РКП. Разработан для экономии компонентов. В этом случае используют стеклянные капилляры или тонко оттянутые кончики пастеровских пипеток диаметром 0,5-1мм. Капиляр опускают одним концом во флакон с преципитирующей сывороткой, набирают ее на высоту 1-1,5 см, закрывают верхнее отверстие капилляра указательным пальцем. Затем ватой удаляют излишек сыворотки с наружной стороны капилляра, погружают его в раствор антигена и набирают равное количество антигена. Капилляр переворачивают с таким расчетом, чтобы смесь сыворотки и антигена оказалась в середине капилляра, после чего закрепляют вертикально в пластилиновой пластине. Результаты учитывают, как при обычной РКП.

При постановке кольцевой РП в ходе исследования тканевого материала необходимы следующие контроли: 1)иммунная сыворотка+ стандартный антиген;2)иммунная сыворотка+физиологический раствор;3) иммунная сыворотка+экстракт из тканей здоровых животных. Показания РП считают достоверными, если в первом контроле получают положительный, а в остальных - отрицательный результат 

Реакция иммунодифузии (РИД, синоним: реакция диффузной преципитации в агаровом геле) широко используется в лабора­торной диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рога­того скота, инфекционной анемии лошадей, болезни Ауески, болезнь Ньюкассла птиц, болезнь Марека птиц и др.

Сущность реакции заключается в том, что специфические антигены и антитела диффундируют в геле агара из мест локали­зации навстречу друг другу и, взаимодействуя, образуют полосы преципитации (комплекс: антиген + антитело), которые хорошо заметны на фоне прозрачного геля. Преципитат представляет со­бой барьер с селективными свойствами — в нем связываются только однотипные антигены и антитела, но он легко проницаем для других неродственных компонентов. Скорость диффузии ан­тигена и антител при одинаковой плотности агара обратно про­порциональна размерам их молекул, т.е. чем меньше молекула антигена, тем быстрее он диффундирует в геле и наоборот. Вслед­ствие различий в скорости диффузии отдельных антигенов, а также различного содержания их в исследуемом многокомпо­нентном растворе и специфических антител в иммунной сыворот­ке в агаре возникают многочисленные полосы преципитации, со­ответствующие отдельным системам антиген - антитело.

РИД используют в двух вариантах:

1) для определения видовой принадлежности антигена;

 2) для обнаружения специфиче­ских антител в исследуемой сыворотке крови. Кроме того, ее можно применять для спектрального анализа простых и ложных антигенных систем и установления количественного содержания антигена в разных субстратах, определения общего набора и ко­личественного содержания антител в соответствующих иммунных сыворотках, получаемых в разное время от различных видов жи­вотных и человека, контроля за чистотой получаемых антиген­ных препаратов и диагностических сывороток; изучения антиген­ного родства между вирусами.

Различают простую и двойную иммунодиффузию. В первом случае диффундирует один компонент, во втором — оба. В зави­симости от того происходит ли диффузия по одной общей оси или во все стороны радиально, из резервуара в среду, иммунодиффузия называется линейной или радиальной.

В настоящее время используется ряд методов диффузионной преципитации

1)     метод двойной диффузии в агаровый гель (в капиллярах) по Вязову;

2)      метод простой ради­альной иммунодиффузии по Манчини

3)      метод двойной диффу­зии в агаровый гель по Оухтерлони.

Реакция диффузионной преципитации (РДП) или реакция иммунодиффузии (РИД)

Широко применяется для обнаружения вируса при  диагностике лейкоза КРС, инфекционной анемии лошадей, вирусного гепатита плотоядных, бешенства и др. Реакция одна из простых по технике постановки.

РИД по Оухтерлони проводят в двух модификациях: мак­ропреципитация в агаровом геле в чашках Петри и микропреци­питация в агаровом геле на предметных стеклах. Микро­преципитация протекает быстрее (расходуется меньше реагентов), технически она не сложнее макрометода и по чувствительности не уступает ему.

Макропреципитация в агаре в чашках Петри сводится к сле­дующему. Расплавленный агаровый гель в количестве 25 мл налива­ют в чашки Петри. В остывшей агаровой пластине выштамповывают пробойником или стеклянной трубочкой отверстия (диаметр 4-7 мм и более, в зависимости от цели опыта). В последнем случае для того, чтобы лунки были расположены на равных расстояниях, под чашку необходимо подкладывать трафарет. Лунки должны отстоять друг от друга по меньшей мере на 3 мм, расстояние более 10 мм употребля­ется редко.

Агаровые пробки удаляют иглой, пинцетом или канюлей, соединенной с вакуумной установкой. Необходимо при этом избе­гать отслоения от стекла и повреждения агара.

При исследовании антигенов в центральную лунку левого шестиугольника (1-й вариант расположения лунок) пастеровской пипеткой наливают 2-3 капли преципитирующей сыворотки , в четыре периферийные — иссле­дуемые антигены, в пятую — специфический антиген (контроль №1), в шестую — антиген из нормальной ткани (контроль №2). В центральную лунку правого шестиугольника наливают 2-3 капли нормальной сыворотки, а в остальные — исследуемые антигены, антиген из нормальной ткани, стандартный вирусный антиген (соответственно контроли №3-8). Компоненты РИД вносят с таким расчетом, чтобы у верхнего края образовался несколько вогнутый мениск и жидкость не растекалась по поверхности агара.

После заполнения лунок чашки Петри закрывают крышка­ми и помещают во влажную камеру при температурах, 4 °С, 18...25°, 37...38 °С на 24—72 ч (в зависимости от вида вируса). Ре­акцию оценивают визуально в косопроходящем или отраженно-рассеяном свете, начиная с контрольной. В нашем примере поло­сы преципитации наблюдают в контроле 1, в контролях №2-8 их не должно быть. Если исследуемые антигены (левый шестиуголь­ник) специфичны антителам преципитирующей сыворотки, то между центральной лункой и первыми четырьмя лунками пери­ферии образуются полосы преципитации

При определении антител постановка реакции методически осуществляется аналогично, лишь с той разницей, что в цен­тральную лунку левого шестиугольника наливают стандартный антиген, а в четыре периферические — исследуемые сыворотки, в пятую — стандартную преципитирующую сыворотку (контроль № 1), в шестую — нормальную сыворотку (контроль № 2). В цен­тральную лунку правого шестиугольника вносят контрольный антиген, а в периферические — исследуемые сыворотки, положи­тельную и нормальную сыворотки (контроль № 3-8). Вначале учи­тывают результат контрольной реакции. В нашем примере полосу преципитации наблюдают в контроле № 1, в контролях же № 2-8 их не отмечают. Если в исследуемых сыворотках содержатся преципитины, соответствующие антигену, между центральной лункой и первыми четырьмя лунками, расположенными по периферии, на­блюдают полосы преципитации.

Для микропреципитации в агаре на предметных стеклах

необходимы чистые, тщательно обезжиренные предметные стек­ла. Их помещают на горизонтальную поверхность (стол). Слегка подогретой пипеткой (40...45°) набирают нужное количество (3—4 мл) расплавленного (50...60°) 1%-ного агарового геля и вы­ливают на поверхность стекла. Толщина слоя агара при этом должна быть 1...1.5 мм. После застывания агара на поверхности каждого стекла стандартными штампами выдавливают лунки, из которых затем отсасывают агар. Размеры и форма штампа могут быть различными, в зависимости от цели опыта. Затем в лунки пастеровскими пипетками с тонко оттянутыми концами или микропипетками наливают антигены и антисыворотки (аналогично макрометоду). После за­полнения луночек реагентами стекла помещают во влажную ка­меру (чашка Петри с фильтровальной бумагой, смоченной водой; эксикатор с герметически закрывающейся крышкой и др.) и ос­тавляют при комнатной температуре или ставят в термостат (37 °С).

Предварительный учет результатов РИД производят через 8...10 ч, основной— через 24 ч и окончательный — через 48...72 ч.

При оптимальном соотношении антигенов (АГ) и антител (AT) после окончания диффузии линия преципитации располага­ется примерно на середине расстояния между лунками, перпен­дикулярно к оси, соединяющих центра. Если один из компонен­тов реакции присутствует в большем количестве, чем другой, то линия преципитации сдвигается в сторону лунки с меньшим со­держанием реагента. При достаточно высокой концентрации ком­понентов реакции она может достигать соседнего сектора агаровой пластинки, в котором формируются полосы преципитации другой антигенной системы.    

Метод простой радиальной иммунодиффузии по Манчини

В расплавленный агаровый гель (температура его не должна превышать 56 градусов) добавляют антитела (моноспецифическая антисыворотка) и наносят гель равномерным слоем на стекло. В геле вырезают лунки и вносят в них стандартный объем различной концентрации растворов Аг. Во время инкубации антиген радиально диффундирует из лунки и , встретившись с Ат, образуют кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке сохраняется избыток Аг, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитата, которое прямо пропорционально концентрации антигена.

Содержание антигена определяют относительно стандартного раствора антигена с известной концентрацией. Чаще всего определяют белковые антигены: количество иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови и других жидкостях, секретов желез, спинномозговой жидкости и др.

   Принцип радиальной диффузии положен в основу метода, применяемого для изучения токсигенности бактериальных культур и отбора клонов с высокой степенью токсичности. В этом случае исследуемые культуры засевают в чашки с агаром, содержащим антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных колоний образуются кольца преципитации, диаметр которых прямо пропорционален степени токсичности штамма.

Реакция иммуноэлектроосмофареза (РИЭОФ)

Данный метод диагностики, как и РДП, основан на образовании  иммунного комплекса  в виде хорошо видимых полос преципитации при встрече специфического антигена и антител в агаровом геле. Различаются реакции методами получения линий преципитации.    

    В отличие от РДП, где линия преципитации  образуется посредством свободной диффузии растворов антигена и антител из лунок в агаровом геле равномерно во все стороны, в РИЭОФ  антигены и антитела, имея разные заряды, движутся строго навстречу друг другу под действием электрического поля. Антиген (отрицательный заряд) перемещается к положительному полюсу, а антитело (положительный заряд) к отрицательному.  На образование линии преципитации оказывают влияние: состав и рН буфера (оптимальная рН 8,6-8,9), температура постановки реакции.

   Преимущества РИЭОФ: метод в несколько раз чувствительней РДП; для постановки требуется незначительное количество исследуемого материала; учет реакции можно производить уже через 30 минут.

    Наиболее широко реакция используется для диагностики плазмоцитоза норок (Алеутская болезнь норок).

    Для постановки РИЭОФ необходим специальный прибор для электрофореза, дающий регулируемое напряжение постоянного тока до 300В (ПЭФ-3, ЭФ-3 или аналогичных марок).

Компоненты реакции:

Иммуноспецифические:

- сыворотки: а) контрольная позитивная сыворотка и отрицательная;

                      б) испытуемые.

- антигены:   а) антиген, приготовленный из штамма вируса Алеутской болезни норок; и

                           отрицательный;

                       б) испытуемые.

Неспецифические:
- агароза - для приготовления 0,75%-го агарозного геля;

- набор компонентов для приготовления буфера .

   Можно использовать буферные растворы с рН 8,6-8,9, пригодные для электрофареза белков. Вероналово-мединаловый буфер готовят так: растворяют 10,32 г мединала в 300 мл дистиллированной воды и затем добавляют 1,84 г веронала, выдерживают в водяной бане при 40°С до растворения, затем доводят дистиллированной водой до 1 литра. Если рН раствора получается ниже 8,6 добавляют мединал, а если выше - веронал и так доводят рН до нужной концентрации.

Постановка и учёт результатов.

   На чистую обезжиренную стеклянную пластину наливают расплавленный агар. После застывания в агаровом геле делают лунки при помощи пробойника соединенного трубкой с вакуумным насосом. Диаметр лунок 2,8 мм, глубина 2,5 мм и расстояние между центрами соседних лунок 6 мм. Получается объем лунки, вмещающий 0,01 мл антигена или - сыворотки крови. Лунки располагают горизонтальными рядами, по краям агаровые пластины (на расстоянии не менее 1 см) не должны иметь лунок. Для более точного размещения лунок в агаровой пластине можно, в качестве трафарета, вниз под стеклянную пластину поместить заранее размеченную миллиметровую бумагу. В каждую из лунок вносят пастеровской пипеткой соответствующие компоненты реакции: сыворотки в лунки со стороны подключения анода (плюс); антигены в противоположные лунки (катод-минус).

    Пластины помещают в камеру для электрофареза. К краям пластины прикрепляют полоски фильтровальной бумаги, концы которых опускают в ванну, наполненную на 2/3 объема буферным раствором. Камеру закрывают крышкой и подключают к выпрямителю тока. Сила тока должна быть 10-15 миллиампер, напряжение на выходе - 120-220 В. РИЭОФ проводят в течение 30 минут при комнатной температуре. При наличии в испытуемых сыворотках специфических антител, между лунками с сывороткой  и заведомо положительным антигеном образуются характерные 1-3 полосы преципитации.     

    При этом с отрицательным антигеном полос не должно быть. В контролях полосы преципитации должны быть только между специфическим антигеном и специфической  сывороткой.

    Окончательно реакцию читают после выдерживания стекол с агаровыми пластинами в гипертоническом растворе (12,5%) хлористого натрия и последующего отмывания дистиллированной водой для удаления неспецифических полос сывороточного белка.