Иммунология,ответы на тесты. Тесты коллоквиум 2 Верно Возможный ответ Неверно Выберите характеристики, относящиеся к ртга (рзга)
 Скачать 2.49 Mb.
|
Комплемент, классический и альтернативный способы активации. Роль системы комплемента в иммунологических реакциях. РСК, РДСК.СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА В ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХВ 1898 году Ю. Борде (Bordet) установил, что бактерии лизируются при добавлении к ним иммунной сыворотки животных. Однако способность лизировать бактерии исчезала после прогревания сыворотки при 560 С, хотя антитела в такой сыворотке сохранялись. Литическую активность можно было восстановить добавлением свежей, нормальной, сыворотки. Эти опыты показали, что лизис бактерий зависит от двух факторов: антител и термолабильного, содержащегося как в иммунной сыворотке, так и в нормальной. В отсутствии комплемента иммунный лизис (лизис антителами) эритроцитов не наступает. Комплемент — это термолабильные сывороточные белки, которые при активации вызывают лизис мембран клеточных антигенов. В последующем были установлены и др. биологические функции комплемента: активация фагоцитоза, освобождение биологически активных аминов из гранул тучных клеток (гистамина, серотонина, брадикинина), повышение проницаемости клеточных мембран, снижение сосудистого тонуса, положительный хемотаксис, иммунное прилипание, опсонизация. Система комплемента – одна из основных систем белков врожденного иммунитета. Комплемент — система белков, включающая около 20 взаимодействующих компонентов: С1 (комплекс из трех белков), С2, СЗ, …, С9, фактор В, фактор D и ряд регуляторных белков. Все эти компоненты — растворимые белки с мол. массой от 24 000 до 400 000, циркулирующие в крови и тканевой жидкости. Белки комплемента синтезируются в основном в печени и составляют приблизительно 5 % от всей глобулиновой фракции плазмы крови. Компоненты, входящие в состав системы комплемента, обозначаются буквой С с порядковым номером от 1 до 9. Например, С1, С4, С2, С3. Первый компонент комплемента С1 состоит из трех фрагментов (субкомпонентов, белков), которые обозначаются С1q, C1r, C1s, т.о. система комплемента представлена 11 белками. При расщеплении компонентов комплемента образуются субъединицы и фрагменты, которые обозначаются номерами с малыми буквами: С2а, С2b, С4а, С4b и т.д. Фрагменты, обозначаемые буквой «а» имеют меньший размер, фрагменты, обозначаемые буквой «b» – больший размер. Эти, как и все остальные фрагменты обладают высокой биологической активностью. Биологические функции Опсонизирующая функция. Сразу вслед за активацией системы комплемента образуются опсонизирующие компоненты, которые покрывают патогенные организмы или иммунные комплексы, привлекая фагоциты. Наличие на поверхности фагоцитирующих клеток рецептора к С3b усиливает их прикрепление к опсонизированным бактериям и активирует процесс поглощения. Такое более тесное прикрепление С3b-связанных клеток или иммунных комплексов к фагоцитирующим клеткам получило название феномена иммунного прикрепления. Солюбилизация (то есть растворение) иммунных комплексов (молекулой C3b). При недостаточности комплемента развивается иммунокомплексная патология (СКВ-подобные состояния). [СКВ = системная красная волчанка] Участие в воспалительных реакциях. Активация системы комплемента приводит к выделению из тканевых базофилов (тучных клеток) и базофильных гранулоцитов крови биологически активных веществ (гистамина, серотонина, брадикинина), которые стимулируют воспалительную реакцию (медиаторов воспаления). Функции С3а: Ø выступать в роли хемотаксического фактора, вызывая миграцию нейтрофилов по направлению к месту его высвобождения; Ø индуцировать прикрепление нейтрофилов к эндотелию сосудов и друг к другу; Ø активировать нейтрофилы, вызывая в них развитие респираторного взрыва и дегрануляцию; Ø стимулировать продукцию нейтрофилами лейкотриенов. Ø Цитотоксическая, или литическая функция. В конечной стадии активации системы комплемента образуется мембраноатакующий комплекс (МАК) из поздних компонентов комплемента, который атакует мембрану бактериальной или любой другой клетки и разрушает её. Лимфоциты, нейтрофилы и тромбоциты содержат на своих мембранах рецепторы для С3. Посредством этих рецепторов к ним могут прикрепляться комплексы антигенов с Ig M или Ig G, адсорбировавшие на себе комплемент. Последний при активации приводит к лизису клетки. Пути активации комплемента.Существует два основных пути активации комплемента, приводящих к лизису клеток. Первый путь - классический, через каскадную активацию С1q, C1r, C1s, C4, C2 c последующим вовлечением центрального компонента комплемента - С3. Второй путь - обводной (альтернативный) — непосредственной активации С3 без вовлечения в процесс первых трех компонентов (С 1,4,2). КЛАССИЧЕСКИЙ ПУТЬ активации комплемента осуществляется с участием Ig M и Ig G, входящих в комплекс АГ-АТ. Запомните, этот путь активации начинается с первого компонента, а активатором является комплекс АГ-АТ. Комплемент не активируется и не связывается со свободными антителами, циркулирующими в крови. Центр связывания первого компонента комплемента (dq) на антителах, расположенный в СН2 домене, прикрыт. Он становятся доступными для него вследствие конформационных изменений в молекулах антител, наступающих только после присоединения их к антигену. Таким образом, первый компонент комплемента С1 активируется комплексом АТ-АГ (Ig-АГ). Связывать С1 (точнее dq) могут не все классы антител. Только антитела классов Ig M и Ig G(1, 2, 3) обладают такой способностью, а антитела классов IgE, IgD, IgA и IgG4 - нет. Различают три стадии активации комплемента: 1) инициации, 2) вовлечения в процесс ферментных систем 3) мембранной атаки. В системе комплемента различают образование трех макромолекулярных комплексов: 1) C1q,r,s -ответственный за фиксацию на иммуноглобулине, входящем в состав комплекса АГ-АТ, 2) С4в2а3в — активирует литические ферменты, 3) терминальный комплекс белков от С5 до С9 - осуществляет лизис сенсибилизированных клеток. Инициация активации комплемента по классическому пути происходит путем связывания dq в области СН2 домена молекул IgM, IgG1, IgG2, IgG3 (IgG4 комплемент не фиксирует и не активирует его), которые соединились с антигеном. Сущность последовательных взаимодействий состоит в том, что каждый из первых пяти белков в результате активации превращается в фермент, расщепляющий последующий компонент и придающий ему свойства фермента (энзима). Возникает аутокаталитический процесс. Последний этап — терминальный, приводит к образованию атакующего мембрану комплекса, индуцирующего осмотический лизис клетки Схема №4 КЛАССИЧЕСКИЙ АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ I AT + IgG (М) Липополисахариды Вирусы Запомните последовательность связывания и активации первых четырех компонентов комплемента - С1, С4, С2, С3 (четвертый находится на втором месте), а остальные пять активируются по порядку их номеров С5, С6, С7, С8, С9. (Порядок активации компонентов таков: С1, С4, С2, С3, а открыты эти компоненты были в последовательности их номеров 1 - 4). Факторы, активирующие комплемент по альтернативному пути: 1. Бактериальные субстанции: липополисахариды, пептидогликаны, зимозан, инулин. 2. Вирусы (гриппа и др.); 3. Полисахариды грибов; 4. Паразиты; 5. Фактор яда кобры; 6. Клетки некоторых опухолей; 7.Нефритический фактор (аутоантитела, стабилизирующие С3 b). Агрегированные иммуноглобулины А, Е, G4. В отличие от классического пути активации системы комплемента, альтернативный механизм начинается с С3 компонента, в связи с этим не требуется активации С1, С4, С2. Иммунные комплексы в активации альтернативного пути участия не принимают. Однако альтернативный путь протекает с обязательным участием БЕЛКОВ ПРОПЕРДИНОВОЙ СИСТЕМЫ. Альтернативный путь срабатывает сразу после внедрения антигенов, т.е. вышеуказанных факторов активирующих комплемент. Пропердиновая система представлена группой белков: пропердин (Р), факторы D и В. Пропердин - гамма-глобулин. Он присоединяется к фиксированному на цитомембране фрагменту С3 b . Последний совместно с факторами Ви D образует Р-С3 конвертазу. Фактор D находится в сыворотке крови в виде активного фермента, субстратом которого является фактор В. Расщепление последнего сопровождается образованием активного фрагмента. После активации С3 компонента классическим или альтернативным путем происходит последовательная не ферментативная сборка компонентов С5, С6, С7, С8, С9, которые образуют МЕМБРАНОАТАКУЮЩИЙ КОМПЛЕКС (МАК, МАС). Мембраноатакующие комплексы погружаются в билипидный слой мембраны клетки-мишени и создают в стенке клетки отверстия, поры как «дыры», которые нарушают обмен ионов, аминокислот, воды. Вода поступает в клетку, что приводят к осмотической гибели клетки. Формула МАК - С5-9. Причем в состав МАК входит несколько белков девятого компонента комплемента (С9). Кроме указанных двух основных путей активации системы комплемента существует еще третий. Называется он лектиновый. Активатором этого пути являются ряд грам-положительных и грам-отрицательных бактерий. Бактерии связываются в организме человека с сывороточным белком, который называется маннансвязывающий лектин. Маннансвязывающий лектин, провзаимодействовав с поверхностью бактериальной клетки (маннозные остатки есть на поверхности микробов), приобретает способность к связыванию с C1q. И таким образом активируется система комплемента с первого компонента. Этот путь очень похож на классический, но активация происходит без участия антител. Биологически активные фрагменты комплемента:Напомним, при активации системы комплемента компоненты расщепляются на фрагменты, обладающие важным биологическим эффектом. Фрагменты компонентов комплемента обозначаются буквами a, b. 1.Фрагмент С1q - активирует свертывающую и кининообразующую системы, повышает проницаемость сосудов и играет инициирующую роль в активации системы комплемента по классическому пути. 2.Фрагмент С2 b - усиливает проницаемость кровеносных и лимфатических сосудов. 3.Фрагмент С3 b - опсонирует бактерии, агрегирует тромбоциты. 4.Фрагмент С3а - способствует освобождению гистамина из тучных клеток и тромбоцитов (дегрануляция тучных клеток с высвобождением гистамина приводит к увеличению проницаемости сосудов). 5.Фрагмент С4а - способствует освобождению серотонина. 6.Фрагмент С4в - стимулирует иммунное прилипание, опсонирующий эффект. 7.С 5а - вызывает, наряду с С3а, дегрануляцию тучных клеток, сосудистые реакции характерные воспалению, активирует клетки миелоидного ряда в очаге воспаления. С3а и С5а называют анафилатоксинами комплемента, так как являются мощными индукторами воспалительной реакции. Они обеспечивают экстравазацию из сосудов в очаг жидкости и клеток крови. Активируют нейтрофилы и моноциты. Для них имеются рецепторы на тучных клетках и гладких мышцах. При массивной внутрисосудистой активации комплемента, что наблюдается при сепсисе, возникает сосудистый коллапс и бронхоспазм. Эта реакция напоминает анафилаксию и поэтому их назвали анафилатоксинами. Ингибиторы системы комплемента. Ингибиторы регулируют каскадную реакцию активации комплемента. К ним относятся: 1. Ингибитор С1-эстеразы (ИС1Э, C1inh - О-ингибитор) - гликопротеин сыворотки. Он связывается с активированными фрагментами С1г и Os и подавляет их протеиназную активность. Тормозится активация С2 и С4. Ингибитор С1- эстеразы играет важную роль не только в регуляции системы комплемента, но и в регуляции сосудистой проницаемости, свертывающей системы, т.к. подавляет плазмин, калликреин, фактор Хагемана. При генетическом дефекте ингибитора С1-эстеразы развивается наследственный ангионевротический отек, который передается по аутосомно-доминантному признаку. Для этого заболевания характерно периодическое возникновение ограниченного отека различных частей тела. Особенно опасен отек дыхательных путей. 2.Ингибитор С3 b (С3в-инактиватор) - расщепляет С3 b и С4 b. Ингибитор анафилатоксина - инактивирует как С3а, так и С5а фрагменты комплемента. Рецепторы комплементаНа многих клетках организма содержатся рецепторы к компонентам комплемента. Рецептор к компоненту комплемента обозначается CR (complement receptors). CR1 (по международной классификации кластеров дифференцировки - CD35) - содержится на В-лимфоцитах, нейтрофилах, моноцитах/макрофагах, эритроцитах, клетках почечных клубочков. Лигандом является C3b, т.е. CR1 рецепторно связывается с указанным фрагментом компонента. Этот рецептор ещё называют рецептором иммуноадгезии. CR2 (CD21) - содержится на В-лимфоцитах, дендритных клетках. Участвует в активации В-лимфоцитов. Связывается с C3b и с вирусом Эпштейна-Барр (можно сказать является лигандом) для названных объектов. CR3 CR4 - являются молекулами клеточной адгезии, связывают фрагменты С3, имеются на моноцитах, макрофагах, нейтрофилах, обеспечивают опсонирующий эффект комплемента. Реакция связывания комплемента (РСК).РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для: 1) серологической диагностики инфекционных заболеваний; 2) идентификации бактерии и др. микробов. РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ и АТ, ещё гемолитическая система, выявляющая результат реакции. РСК проводится в два этапа при участии двух систем: первая система – АГ+АТ+комплемент – обуславливает связывание комплемента в том случае если АТ соответствует АГ. В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным; вторая система (индикаторная) – гемолитическая сыворотка (гемолизины) + эритроциты – показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т. к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент (рис.8). а Рис. 8. Реакция связывания комплемента: а - РСК с сывороткой больного; б - РСК с сывороткой здорового животного Компоненты реакции: 1) испытуемая сыворотка (предварительно инактивируют нагреванием при 56 °С в течение 30 минут); 2) антиген (изготавливается из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экстрактов тканевых липидов); 3) комплемент; 4) гемолитическая сыворотка; 5) 3 % взвесь эритроцитов барана; 6) физиологический раствор; 7) контрольная сыворотка. В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы. Титр комплемента – наибольшее разведение комплемента которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. Рабочая доза комплемента – количество комплемента, которое выше тира на 25 %. Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50 % взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 °С. Определяют титр и рабочую дозу. Титр сыворотки – максимальное разведение сыворотки которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре. Условия постановки РСК: 1) перед постановкой РСК сыворотки обязательно инактивируют прогреванием в водяной бане при температуре 56 - 650С (для разных видов животных) 30 мин, чтобы разрушить комплемент; 2) реакцию ставят в строгой последовательности: сначала вносят компоненты баксистемы (А/г + А/m + К) и помещают в водяную баню при 37-380С на 20 мин, затем вносят гемсистему (Г + ЭБ) и повторно помещают в водяную баню при 37-380С на 20 мин; 3) компоненты реакции перед постановкой РСК титруют и вносят в пробирки по 0,2 смз в рабочих титрах; 4) общий объём жидкости в пробирке должен быть 1,0 смз (5 компонентов по 0,2 смз). Если какой-либо компонент не вносят (в контролях, при титрации), вместо него вносят такой же объём физиологического раствора; 5) все сыворотки исследуют в двух разведениях 1:5 и 1:10; 6) перед постановкой главного опыта РСК готовят рабочие разведения всех компонентов и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность. В реакции используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемолитическими свойствами; 7) физиологический раствор берут чистый, свежий, прокипячённый, без консервантов. Сущность РСК (см. схему № 4): В реакции участвуют две системы: бактериолитическая – диагностическая (А/г + А/m + К) и гемолитическая - индикаторная (Г+ЭБ), связующим компонентом является комплемент. Схема №4 Процесс взаимодействия комплемента в диагностической системе является невидимым, поэтому для учёта результатов реакции используют вторую систему – индикаторную (заведомо специфичную). Если в баксистеме образуется комплекс А/г + А/m, то К связывается с этим комплексом и свободного К для гемсистемы не остаётся. Положительная реакция РСК характеризуется задержкой гемолиза, эритроциты находятся во взвеси – жидкость мутная, через некоторое время они оседают и надосадочная жидкость становится прозрачной. Если в баксистеме комплекс не образуется – комплемент переходит в гемсистему и соединяется с комплексом гемолизин + эритроциты барана. В результате происходит гемолиз эритроцитов барана – РСК отрицательная (жидкость в пробирке прозрачная, красного цвета или лакового). Титрование гемолизина в гемолитической системе. Результаты титрования необходимы для определения оптимальной концентрации гемолизина в РСК с целью обеспечения работы индикаторной системы. Титром гемолизина называют его максимальное разведение, при котором в присутствии оптимального количества комплемента гемолизин способен обеспечить полный лизис взвеси эритроцитов барана в течение 10 мин при температуре 37-380С. При титровании готовят вспомогательные разведения гемолизина (см. табл. 1). Полученные разведения переносят в 8 пустых пробирок и добавляют другие компоненты. Гемолизин титруют в лаборатории при получении новой партии и через каждые три месяца работы. Таблица 1. Вспомогательные разведения гемолизина
Таблица 2 Схема титрования гемолизина
Титрование комплемента в гемолитической системе. Титром комплемента в гемолитической системе считают минимальное его количество, вызывающее полный гемолиз взвеси эритроцитов в пробирках с отрицательной сывороткой и антигеном и с положительной сывороткой без антигена, в течение 20 мин в водяной бане при температуре 37-380С. Комплемент титруют в день постановки главного опыта РСК, так как он нестойкий и быстро разрушается. В качестве рабочего титра берут количество комплемента на 0,02 больше. Таблица 3 Схема титрования комплемента в гемолитической системе
Титрование комплемента в бактериолитической системе. Проводят на трёх сыворотках: положительной /бруцеллёзной/, отрицательной, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии. Главный опыт РСК с сывороткой больного животного бруцеллезом Схема № 6 Таблица 4 Схема титрования комплемента в бактериолитической системе
Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки). При постановке реакции на каждую пробу сыворотки готовят три разведения. В первую из трёх пробирок вносят 0,1 смз сыворотки и 0,4 смз физиологического раствора, после перемешивания 0,2 смз переносят во вторую и 0,1 смз в третью пробирки. Затем в третью пробирку добавляют 0,1 смз физиологического раствора. При этом объём во всех трёх пробирках составляет по 0,2 смз, а разведения сывороток соответствуют в 1-й и во 2-й пробирках 1:5, а в третьей - 1:10. Сыворотки инактивируют. Затем во вторую и третью пробирки вносят антиген в рабочем титре по 0,2 смз, а в первую по 0,2 смз физиологического раствора (вместо антигена), после чего добавляют комплемент в рабочем титре. При массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке с А/г и разведением сыворотки 1:5. Контроли: 1) отрицательная сыворотка в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и без антигена (реакция отрицательная); 2) положительная бруцеллёзная сыворотка в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном (реакция положительная) и без антигена (по схеме главного опыта); 3) гемолитическая система - 0,6 смз физиологического раствора и 0,4 смз гемолитической системы (реакция отрицательная). Учёт и оценка РСК. Оценку реакции проводят в плюсах, учитывают цвет надосадочной жидкости и наличие осадка из эритроцитов на дне. + + + + - полная задержка гемолиза. Жидкость прозрачная, бесцветная на дне осадок эритроцитов. + + + - гемолиз 25% эритроцитов. Жидкость жёлто-розового цвета на дне осадок из эритроцитов. ++ - гемолиз 50% эритроцитов. Жидкость красная прозрачная с осадком эритроцитов. + - гемолиз 75% эритроцитов. Жидкость красная, на дне незначительный осадок из эритроцитов. - 100% гемолиз эритроцитов. Жидкость прозрачная красная (лаковая). Осадка эритроцитов нет. Диагностическая оценка. Реакцию считают положительной при задержке гемолиза на 2- 4 плюса в разведении сывороток (1:5 или 1:10). Сомнительной – если реакция прошла на 1плюс. При получении сомнительного результата через 15-30 суток, от животных, давших сомнительный результат, проводят повторное исследование сыворотки крови в РСК. При повторном исследовании реакцию ставят в трёх пробирках, с разведениями сыворотки 1:5, 1:10 с А/г и 1:5 без с А/г. Дважды сомнительный результат считают положительным. Главный опыт РСК при определении типа вируса ящура. В пробирки последовательно вносят компоненты тест-системы (вируссодержащая жидкость + антитело + комплемент). Помещают в водяную баню при 37-38°С 20 минут (РСК) или при +4° С в холодильнике в течение 16-18 часов (РДСК). Затем добавляют компоненты гемсистемы (антиген + антитело), выдерживают при температуре 37-38°С 30 минут, после чего учитывают реакцию. Таблица 5 Главный опыт РСК при определении типа вируса ящура
В данном примере антиген относится к типу О. Одновременно ставят контроли: со стандартной позитивной сывороткой без антигена, с испытуемым антигеном без добавления сыворотки, с диагностической стандартной позитивной сывороткой и стандартным антигеном. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||