Иммунология,ответы на тесты. Тесты коллоквиум 2 Верно Возможный ответ Неверно Выберите характеристики, относящиеся к ртга (рзга)

• Название: Тесты коллоквиум 2 Верно Возможный ответ Неверно Выберите характеристики, относящиеся к ртга (рзга)
• Анкор: Иммунология,ответы на тесты
• Дата: 06.07.2022
• Размер: 2.49 Mb.
• Имя файла: IMMUNOLOGIYa_testy-otvety_1.docx
• Тип: Тесты; #625678
• страница: 3 из 13

Гемагглютинирующие антигены и антитела. Значение определения при вирусных болезнях. РГА, РЗГА. РНГА

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Реакция пассивной агглютинации (РПА).

Под РПА понимают реакцию, в которой АТ-а взаимодействуют с высокодисперсными АГ (гаптенами), предварительно адсорбированными на корпускулярных носителях, которые при этом склеиваются.

В качестве корпускулярных носителей применяют эритроциты животных, частицы латекса (полимерные микрошарики), бентонита, сефарозы, клетки St. aureus (штамм Cowan-1, содержащий протеин А).

Различают 3 типа РПА:

1) различные варианты РНГА (РПГА) (реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации);

2) реакция коагглютинации;

3) реакция латексагглютинации.

Реакция непрямой гемагглютинации позволяет решить следующие диагностические задачи:

1) обнаружить антитела и определить их титр в исследуемых сыворотках крови;

2) обнаружить и идентифицировать неизвестный вирусный антиген.

Сущность реакции в том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, способны агглютинироваться в присутствии гомологичных антител или антигенов. Эритроциты выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген-антитело. Регистрируют данную реакцию по характеру образовавшегося осадка эритроцитов, т.о., она является сугубо специфической серологической. Необходимо отметить, что РНГА отличается от РГА. В РГА эритроциты агглютинируются с рецепторами вирусов за счет своих комплементарных рецепторов. В РНГА агглютинация происходит за счет образования комплексов антиген + антитело. Если к поверхности эритроцитов присоединить антигены, получают антигенный эритроцитарный диагностикум, способный в исследуемой сыворотке определять антитела. И, наоборот, эритроциты, сенсибилизированные антителами, называют антительным эритроцитарным диагностикумом и применяют для быстрого обнаружения антигенов в различных субстратах.

Реакция непрямой гемагглютинации

Это серологическая реакция, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на эритроцитах. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РНГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика). С помощью реакции можно выявлять антигены, если предварительно сенсибилизировать эритроциты антителами (эритроцитарный антительный диагностикум). Эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности.

Результатом реакции является склеивание эритроцитов и выпадение их в осадок.

На основе этого феномена разработаны разные модификации РНГА, где в качестве носителей применяются мелкие стандартные инертные частицы (латекс, целлюлоза, полистерол, оксид бария и др.). Если используются стандартные частички латекса, то реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА); если золотистый стафилококк - реакция коагглютинации и т. д.

Достоинства РНГА. Эта реакция обладает высокой чувствительностью, превосходя РИД, РСК и приближаясь к иммуноферментному анализу, отличается простотой техники постановки и быстротой ответа (2...3 ч). Недостаток — определенные трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов.

Компоненты реакции. Для определения антител в исследуемых сыворотках необходимо иметь: а) антигенный эритроцитарный диагностикум; б) исследуемую сыворотку крови; в) разбавитель (в нем ставится реакция). Для определения антигенов в исследуемых биологических жидкостях необходимо иметь: а) антительный эритроцитатный диагностикум; б) исследуемый биологический субстрат; в) разбавитель.

Постановка РНГА включает следующие основные этапы:

Реакция непрямой гемагглютинации

Постановка РНГА включает следующие основные этапы:

а) приготовление растворов и подготовка исследуемых жидкостей;

б) получение эритроцитарных диагностикумов;

в) постановка главного опыта РНГА.

Обычно в лабораториях ставят только главный опыт, а остальные процедуры проводят на предприятиях биологической промышленности.

Подготовка растворов и исследуемых жидкостей. Физиологический раствор, забуференный физраствор (рН 7,2), разбавитель готовят на дистиллированной воде. Физраствор готовят по общепринятой методике. Для приготовления забуференного физ-раствора с рН 7,2 к 1 л последнего добавляют 0,49 г КНаР04 и 1,62 г Na2HP04, стерилизуют 

кипячением, охлаждают и используют в работе. Этот раствор применяют для отмывания эритроцитов, акролеинизации и танизации их. Разбавитель готовят, добавляя к физраствору 0,3% фенола и 1% нормальной лошадиной сыворотки. Его используют для разведения исследуемых сывороток или других жидкостей, а также для хранения эритроцитарного диагностикума. Нормальную лошадиную сыворотку, исследуемые сыворотки и другие жидкости абсорбируют эритроцитами с целью освобождения от неспецифических гемагглютининов. С этой целью к одному объему проверяемой биологической жидкости прибавляют 0,1 объема осадка отмытых эритроцитов, пробирку со смесью встряхивают и выдерживают при 37 °С в течение 30 мин, затем центрифугируют, извлекают надосадочную жидкость и используют в работе.

Приготовление сенсибилизированных эритроцитов включает:

а) получение эритроцитов. Для этого используют кровь барана, крыс, человека. Кровь, полученную из яремной вены, дефибринируют с бусами в течение 20...30 мин и трехкратно отмывают забуференным физраствором. Затем их стабилизируют, подвергают танизации и сенсибилизации. В настоящее время чаще применяют эритроциты птиц — кур, индеек, уток. Приготовленные из них диагностикумы быстрее оседают, что позволяет со­кратить сроки исследования без потери чувствительности;

б) стабилизация эритроцитов. Преимущество стабилизированных эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в суспензии, не подвергаясь гемолизу. Для стабилизации эритроцитов предложено много методов. Чаще всего используют формальдегид, глутаровый или акриловый альдегиды.

Приводим один из методов. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 10%-ную взвесь на забуференном физрастворе рН 7,2. Одновременно готовят 0,2%-ный раствор акролеина на этом же растворителе. Соединяют их в равных объемах и ставят в водяную баню при 37 °С на 30 мин. После стабилизации эритроциты трижды отмывают забуференным физраствором и ресуспендируют в этом же растворе до 10%-ной концентрации, разливают по пробиркам и хранят при 2...4 °С. Срок хранения — 1 год;

в) танизация эритроцитов. Механизм действия танина на эритроциты изучен слабо. Но при этом достигается главное — танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбционной емкостью. Фармакопейный танин должен обладать хорошей растворимостью в воде. Хранят его в прохладном сухом месте в сосуде, обернутом в черную бумагу. Раствор танина готовят непосредственно перед опытом. Для этого берут навеску 0,25 г порошкообразного танина и растворяют в 50 мл забуференного физраствора рН 7,2. Получают разведение 1:200, которое является основным и сохраняется на холоде при 2...4 °С в течение месяца. Из основного разведения готовят рабочее (1:20000). К 5%-ной взвеси акролеинизированных эритроцитов на за­буференном физрастворе добавляют равный объем раствора танина в разведении 1:20000. Смесь выдерживают в водяной бане 20...30 мин при 37 °С. В дальнейшем производят отмывание физраствором 2-3 раза и осадок ресуспендируют в физрастворе до 50%-ной концентрации. Хранят танизированные эритроциты при температуре 2...4 °С. Контроль на их самоагглютинацию ставят через 18...20 ч после приготовления. Для этого в лунке панели смешивают каплю полученной 2%-ной суспензии танизированных эритроцитов и каплю разбавителя. Через два часа эритроциты должны осесть на дно лунки в виде компактной точки. В случае незначительной агглютинации танизированных эритроцитов (+ или ++) суспензию необходимо дополнительно выдержать при 2...4 °С в течение 2...3 суток, после чего повторяют контроль. Если эритроциты и в этом случае оседают в виде "зонтика", то их считают непригодными и готовят заново.

г) Сенсибилизация эритроцитов. Для этого используют антисыворотки или антигены. К 0,2 мл 50%-ной суспензии танизированных эритроцитов на физрастворе добавляют 0,2 мл раствора антигена или антител (концентрация по белку 2 мг/мл) и 0,6 мл физраствора. К данной смеси приливают по каплям 1 мл 0,1%-ного раствора хрома хлорида и оставляют при комнатной температуре не более, чем на 5 мин. Реакцию останавливают прибавлением 20...50 объемов 0,02 М фосфатно-буферного раствора рН 7,2, для приготовления которого берут 50 мл фосфатного буфера и 325 мл дистиллированной воды. Затем трижды отмывают этим же буфером и хранят в рабочей концентрации (2%-ная взвесь в разбавителе). Для конъюгации можно использовать и другие конъюгирующие агенты (глютаровый альдегид, риванол, ализариновый синий).

Полученные таким образом сенсибилизированные эритроциты используют в РНГА

Основной опыт РНГА

Основной опыт РНГА. Реакцию ставят в лунках пластмассовых панелей. В последнее время применяют микрометод с помощью прибора Такачи. Исследуемые и контрольные сыворотки прогревают 30 мин при 56 °С. Исследуемые сыворотки крови разводят разбавителем от 1:2 до 1:256. К каждому разведению добавляют каплю эритроцитарного диагностикума. Смесь компонентов встряхивают и выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции проводят через 2...3 ч, но не раньше полного осаждения эритроцитов в контроле (табл.9).

Одновременно ставят контроли:

1) заведомо положительная сыворотка ++++ эритроцитарный диагностикум; 2) заведомо отрицательная сыворотка + эритроцитарный диагностикум;

3) разбавитель + эритроцитарный диагностикум;

Учет реакции.

Реакцию учитывают по 4-х бальной системе и выражают в плюсах в зависимости от интенсивности агглютинации:

1)                ++++ — хорошо выраженный "зонтик" с загибающимися краями;

2)                +++ — "зонтик" с ровными краями;

3)                ++ — "зонтик" со слабо выраженным кольцом по краю;

4)                + — отчетливо выраженное кольцо на фоне слабо выражен­ного "зонтика";

5)                - — на дне лунки компактная точка эритроцитов. За титр антител в сыворотке принимают наибольшее ее раз­ведение, которое вызывает агглютинацию эритроцитов не ниже, чем на ++. В нашем примере (табл.9) титр антител оставляет 1:64.

Реакция коагглютинации, латексаглютинации

Диагностикум представлен стафилококками для коагглютинации и частицами латекса - для латексреакции, на поверхности которых находятся АТ.

В случае с фиксированными клетками стафилококка связывание АТ происходит за счет взаимодействия Fс-участками IgС с молекулами протеина А.

При получении латексных диагностикумов используют химическое связывание АТ или АГ с полимерной основой частиц или взаимодействие, основанное на гидрофобных силах.

Достоинства: простота постановки.

Недостаток: возможность неспецифической агглютинации.

Реакция коагглютинации (РКОА) находит широкое применение для идентификации стафилоккоков, вирусов гриппа, герпеса, онкогенных вирусов, ротавирусов и др.

Достоинства РКОА: а) высокая экономичность (в 50-250 раз дешевле других методов); б) высокая чувствительность, не уступающая в ряде случаев ИФА; в) простота постановки (отсутствие необходимости в дорогом оборудовании для приготовления реагентов и учета реакции).

Реакция коагглютинации

Сущность РКОА состоит в том, что белок А (видоспецифический протеин) золотистого стафилококка обладает способностью соединяться с Fc-фрагментом IgG человека и ряда млекопитающих, в т.ч. лабораторных животных — продуцентов антител (кроликов, морских свинок, крыс, мышей, коз и т.д.). Белок А способен реагировать не только со свободными молекулами иммуноглобулинов, находящимися в растворе, но и с иммуноглобулинами, фиксированными на клеточных поверхностях, находящихся в составе иммунного комплекса. При этом Fab-фрагменты остаются свободными для реакции с гомологичными антигенами 

Реакция коагглютинации

остаются свободными для реакции с гомологичными антигенами (рис.68).

В постановке данной реакции модно выделить три основных этапа: 1) получение активной и стабильной по содержанию белка А взвеси золотистого стафилококка; 2) определение требований к иммунной сыворотке, используемой для сенсибилизации стафилококка, а также правильное проведение процесса сенсибилизации; 3) постановка реакции и учет ее результатов.

Получение взвеси золотистого стафилококка. Присутствие белка А является видоспецифическим признаком золотистого стафилококка, однако в качестве продуцента чаще используют St. aures (штамм Cowan-1), наиболее богатый этим белком. Приготовление реагента для коагглютинации состоит в предварительной обработке клеток для лучшего закрепления на их поверхности белка А и предупреждения потери активности при длительном хранении суспензии.

Суточную агаровую культуру золотистого стафилококка засевают в жидкую пептонно-дрожжевую среду и выращивают в течение 12…14 ч при усиленной аэрации (встряхивание на шуттель аппарате при 100 толчках в мин). Сокращенное время культивирования обеспечивает максимальное накопление белка А в клетках.

Бактериальные клетки осаждают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин и дважды отмывают от питательной среды фосфатно-буферным раствором (ФБР) с рН 7,2.-.7,4. Из осадка готовят 10%-ную суспензию на ФБР. Эту суспензию микробов фиксируют 1%-ным раствором формальдегида в течение 3 ч при постоянном перемешивании. Затем бактериальные клетки четырежды отмывают ФБР от формальдегида, суспензию разводят до 10 %-ной концентрации и прогревают при 60 °С в течение 1 ч для снижения протеолитической активности. Затем клетки еще раз промывают, суспендируют в ФБР, добавляют мертиолят натрия (1:10000) и хранят до 2-х месяцев при 4...6 °С. Более длительное хранение в жидком виде нежелательно, так как может снизиться активность белка А.

Необходимое условие успешной обработки стафилококковых клеток — проверка биологической активности белка А на всех этапах. Для этой цели предложено несколько препаратов. Все они представляют собой эритроциты или частицы латекса, сенсибилизированные гамма-глобулиновой фракцией сыворотки крови. По степени агглютинации нагруженных частиц определяют титр белка А. Достаточно активными считают стафилококковые препараты с титром 1:2000 и выше.

Реакция коагглютинации

Сенсибилизация стафилококков. Для получения коагглютинирующего реагента взвесь стафилококков обрабатывают иммунной сывороткой против искомого объекта исследования. Сыворотку следует брать от животного, IgG которого обладают сродством к белку А стафилококка. Наиболее активны по отношению к нему иммуноглобулины человека, свиньи, собаки и морской свинки, менее — осла и кролика, а IgG овцы, лошади, козы, крысы и мыши взаимодействуют с ним очень слабо.

Сыворотка должна быть строго специфичной, т.е. не содержать антител к другим компонентам вируссодержащего материала. Это достигается высокой степенью очистки вируса, используемого для иммунизации, либо абсорбцией сыворотки неинфицированной культурой ткани, на которой получен вирус, либо сочетанием обоих этих методов.

Сыворотка, используемая в РКОА, не должна содержать антител к стафилококку, так как это приводит к неспецифическим реакциям. Контроль проводят путем смешивания на стекле по 1 капле сыворотки и 10%-ной суспензии стафилококкового реагента. Если по истечении 3...5 мин не наблюдают образования хлопьев, то сыворотку считают пригодной для реакции.

Если образец сыворотки агглютинирует стафилококк, то проводят абсорбцию сывороток взвесью стафилококковых клеток, не имеющих белка А (например, штаммом Wood-46). Таким путем удаляют антитела, реагирующие со стафилококком за счет Fab -фрагментов, не затрагивая специфических противовирусных антител, реагирующих с белком А за счет Fc-фрагментов. Абсорбцию проводят, смешивая равные объемы сыворотки и 10%-ной суспензии стафилококка штамма Wood-46. Смесь инкубируют 30…40 мин при 20...25 °С, центрифугируют и надосадочную жидкость используют для сенсибилизации стафилококкового реагента.

Методика сенсибилизации стафилококков чрезвычайно проста, не требует специального оборудования и реактивов. Основное условие подбор оптимальных доз и концентраций компонентов, т.е. сыворотки и стафилококкового реагента.

Реакция коагглютинации

Постановка реакции и учет результатов. В отличие от бактериальных объектов, где можно использовать чистую культуру, вирусы всегда определяют в каком-либо биологическом материале. В этом случае для исключения неспецифических реакций необходимо провести абсорбцию этого материала суспензией стафилококка. Для этого смешивают равные объемы 10%-ной взвеси стафилококкового реагента и испытуемого материала, в котором предполагается наличие вируса. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, центрифугируют и надосадочную жидкость используют в РКОА.

Постановка РКОА состоит в смешивании на стекле равных объемов испытуемого материала и коагглютинирующего реагента. Результаты реакции учитывают визуально на темном фоне после 2-3 мин интенсивного перемешивания. Темный фон — необходимое условие учета реакции, так как при наблюдении в проходящем свете может быть заметна мелкодисперсная агглютинация стафилококковых клеток.

Реакцию учитывают по 3-х балльной системе:

+++ — интенсивное просвечивание реакционной смеси с образованием хлопьев (резко положительная реакция);

++ — отчетливое просветление смеси (положительная реакция);

+ — еле заметное просветление смеси (слабо положительная реакция);

- — отсутствие просветления (отрицательная реакция)

Каждый опыт сопровождают следующими контролями:

1) стафилококковый реагент, сенсибилизированный нормальной (или гетерологичной) сывороткой + испытуемый материал;

2) используемый коагглютинирующий реагент + материал, заведомо не содержащий вируса;

3) коагглютинирующий реагент + фосфатнобуферный раствор;

4) испытуемый материал + фосфатно-буферный раствор.

Все контроли должны проработать отрицательно.

Реакция коагглютинации

Модификации постановки РКОА:

1) прямой метод. Коагглютинирующим реагентом обрабатывают инфицированную культуру клеток в течение 30 мин при 20 °С. Затем смесь отмывают и исследуют под микроскопом. Вокруг инфицированных клеток отчетливо виден "ореол" стафилококка, что свидетельствует о наличии вирусных антигенов;

2) непрямой метод. На культуру клеток, инфицированную вирусом, наносят иммунную сыворотку, а затем — стафилококковый реагент. Остальные этапы проводят аналогично прямому методу. Непрямой метод позволяет диагностировать вирусную инфекцию клеток уже через 12 ч после инфицирования, тогда как прямой метод — через 18 ч.

Специфичность РКОА контролируют путем постановки реакции в следующих системах:

1) инфицированные клетки + нормальная кроличья сыворотка + стафилококковый реагент;

2) неинфицированные клетки + иммунная сыворотка + стафилококковый реагент.

Наличие агглютинации в опытной системе и отсутствие ее в двух контрольных свидетельствует о специфичности реакции.

При соблюдении всех требований к иммунным сывороткам, а также оптимальных условий сенсибилизации РКОА высокоспецифична—наблюдается 1-2 % ложноположительных результатов. Чувствительность этой реакции достаточно высока. Она не уступает иммунологическим методам "третьего поколения" (РИМ, ИФМ и др.) и значительно превосходит некоторые реакции "второго поколения".