Главная страница
Навигация по странице:

  • Культуральный метод

  • Биохимический метод

  • Видовая идентификация стафилококков.

  • Плазмокоагулазу

  • Определение ДНК-азы.

  • Учебно-методическое пособие. Учебнометодическое пособие для самоподготовки и самостоятельной работы студентов лечебного факультета по микробиологии, вирусологии


    Скачать 1.36 Mb.
    НазваниеУчебнометодическое пособие для самоподготовки и самостоятельной работы студентов лечебного факультета по микробиологии, вирусологии
    АнкорУчебно-методическое пособие.doc
    Дата14.09.2017
    Размер1.36 Mb.
    Формат файлаdoc
    Имя файлаУчебно-методическое пособие.doc
    ТипУчебно-методическое пособие
    #8475
    страница28 из 43
    1   ...   24   25   26   27   28   29   30   31   ...   43

    Микробиологические методы идентификации микробов
    рода Staphylococcus


    Целью идентификации является установление рода и вида выделенной чистой культуры. Род стафилококка относится к семейству Micrococcaceae, в которое входят также роды Micrococcus и Planococcus. Общими чертами представителей этого семейства являются: морфология, положительная окраска по Граму; наличие фермента – каталазы.

    Род Staphylococcus состоит из нескольких видов, наиболее важными из которых являются S.аureus, S.epidermidis и S.saprophyticus. Представители последних двух видов являются коагулазоотрицательными и долгое время считались непатогенными. В настоящее время доказано, что эпидермальный стафилококк может вызвать такие заболевания, как эндокардит, сепсис, конъюнктивит, инфекция ран и мочевыводящих путей, послеродовые инфекции, а сапрофитический – острый уретрит, цистит и др. На первом этапе устанавливается принадлежность выделенной культуры к семейству Micrococcaceae и роду Staphylococcus. На принадлежность культуры к семейству микрококков указывает положительная проба на каталазу, так как другие кокки (в частности стрептококки), каталазу не образуют. Для установления принадлежности культуры к роду Staphylococcus основными методами являются культуральный и биохимический.

    Культуральный метод. Основным отличием стафилококков от микрококков является окраска колоний на плотной среде. Для стафилококков характерна золотистая или белая окраска колоний. У микрококков колонии окрашены в желтый или розовый цвет.

    Биохимический метод. Он основан на том, что стафилококки являются факультативными анаэробами, микрококки – облигатными аэробами. В связи с этим стафилококки способны расти и ферментировать глюкозу в анаэробных условиях, а микрококки лишены этой возможности. Для определения этого признака культуру засевают петлёй в столбик полужидкой среды, содержащей 1% глюкозы и индикатор на кислые продукты. Сверху среду заливают стерильным вазелиновым маслом и ставят в термостат при 370С на 5 суток. Рост культуры и изменение цвета среды указывает на принадлежность её к роду Staphylococcus.

    Видовая идентификация стафилококков.S.aureus отличается от других видов наличием золотистого или палевого пигмента (в большинстве случаев), наличием ферментов: плазмокоагулазы, лецитиназы (лецитовителлазы) и ДНК-азы. Плазмокоагулазу определяют путём посева культуры в цитратную кроличью плазму, после чего посевы помещают в термостат при 370С и регистрируют результаты через 1, 2, 4, 6 и 18 часов. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого размера считается положительным результатом реакции. Лецитиназу определяют путём посева культуры на молочно-желточный солевой агар. В составе яичного желтка имеется лецитовителлин, а наличие молока стимулирует образование пигмента. Посевы выдерживают в термостате при 370С 18-24 часа. О наличии лецитиназы свидетельствует образование вокруг колоний радужного венчика.

    Определение ДНК-азы. Принцип метода: под действием ДНК-азы добавленная в плотную среду высокополимерная ДНК распадается на низкополимерные фрагменты. При этом мутная среда, содержащая высокополимерную ДНК, становится прозрачной. Ход исследования: на питательную среду в чашке Петри, включающую от 50 до 200 мг ДНК и 0,5 мл 10% раствора хлористого кальция, штрихами засевают исследуемую культуру и помещают в термостат при 370С на 18-24 часа. После этого на поверхность агара заливают 5-7 мл 3 моль/л раствора соляной кислоты. Если через 2-3 минуты вокруг посевов появляются зоны просветления, то реакция считается положительной

    Если культура имеет золотистый (палевый), пигмент, коагулирует плазму и обладает хотя бы одним из двух других ферментов (лецитиназа, ДНК–аза) – её относят к виду золотистого стафилококка. При отсутствии полного набора указанных признаков (основным является наличие плазмокоагулазы) проводят идентификацию видов эпидермального и сапрофитического стафилококков по трем основным признакам, отличающим эти два вида (см. таблицу).


    Вид стафилококка

    Устойчивость
    к новобиоцину

    Фосфатаза

    Ферментация
    маннита

    эпидермальный

    -

    +

    -

    сапрофитический

    +

    -

    +


    Устойчивость к новобиоцину определяют путём посева культуры на среду, содержащую 2 мкг/мл новобиоцина. Ферментацию маннита проводят в аэробных условиях путём посева культуры бляшкой на поверхность среды в чашке Петри, содержащей 1% маннита и индикатор на кислые продукты. Появление окрашенных колоний (в цвет индикатора) указывает на способность культуры ферментировать маннит. Таким образом, для эпидермального стафилококка характерны:

    - чувствительность к новобиоцину;

    - наличие фосфатазы и неспособность окислять маннит.

    Для сапрофитического стафилококка характерны противоположные свойства.

    Выделенные культуры S.aureus обычно подвергают фаготипированию с международным набором фагов (22 фага). Определение фаготипа стафилококка помогает установить источник инфекции и принадлежность выделенной культуры к госпитальным штаммам.

    Контрольные вопросы

    Опишите по дням ход исследования и результаты при выделении золотистого стафилококка из гноя. Опишите по дням ход исследования и результаты при подозрении на сепсис: сколько крови взять, в какую питательную среду посеять, какое количество питательной среды взять, в каких условиях производится взятие крови и её посев. Дальнейший ход исследования описать отдельно при обнаружении стафилококка и стрептококка. Какие материалы исследуют при подозрении на стафилококковое пищевое отравление, что обнаруживают в исследуемых материалах, на каких животных ставится проба? Идентификация чистой культуры стафилококка: по каким признакам определяют родовую и видовую принадлежность. Методы определения факторов патогенности стафилококка: пламокоагулазы, лецитовителлазы, ДНК-азы. Фаготипирование стафилококков: с какой целью проводится, каким набором фагов, методика фаготипирования. Схема микробиологического исследования при пищевой интоксикации стафилококкового происхождения. Опишите по дням ход исследования и результаты при выделении стрептококка из гноя. Краткая характеристика основных видов из группы грамотрицательных микроорганизмов. Синегнойная палочка: название по–латыни, морфология, культивирование, пигментообразование, основные факторы вирулентности; группы больных, у которых чаще всего наблюдается синегнойная инфекция. Протей: название по-латыни, морфология и физиология, особенности культуральных свойств. Кишечные палочки: наиболее частые формы инфекции (места локализации воспалительных процессов). Характеристика возбудителей анаэробной газовой инфекции (основных трёх видов): название видов по-латыни, морфология (споры, жгутики, капсула). Окраска по Граму, способ биологического окисления, среды для культивирования, характер колоний в толще агара, изменения на среде Вильсон-Блера, изменения на молоке; свойства токсина, действие в организме, серологические типы токсина. Факторы инвазивности. Характеристика неспорообразующих (неклостридиальных) анаэробов. Классификация: семейства, роды, основные виды (названия по-латыни). Основные свойства: морфология, отношение к окраске по Граму, условия культивирования. Ассоциация микроорганизмов (смешанная инфекция) при гнойных и раневых инфекциях: наиболее частые сочетания, особенности микробиологической диагностики при ассоциациях возбудителей.

    Задания для выполнения в процессе самоподготовки

    Написать по-латыни названия видов неспорообразующих анаэробов, грамотрицательных микроорганизмов – возбудителей раневых и гнойных инфекций и названия возбудителей анаэробной газовой инфекции.

    Работа студента на практическом занятии

    1. Продолжение исследования гноя (2-й день). Изучите и опишите колонии стафилококка на чашках с кровяным агаром. С помощью миллиметровой бумажки определите диаметр зон задержки роста вокруг дисков с антибиотиками и сделайте вывод о чувствительности микрофлоры гноя к антибиотикам. Проведите идентификацию выделенной чистой культуры стафилококка:

    а) учтите результаты посева на анаэробное сбраживании глюкозы;

    б) поставьте реакцию плазмокоагуляции: в пробирку с 0,5 мл кроличьей цитратной плазмы в разведении 1:4 (опыт) и в другую пробирку с 0,5 мл раствора хлорида натрия (контроль) внесите по 1 петле исследуемой культуры стафилококка. Пробирки поставьте в термостат. В конце занятия проверьте результат и сделайте вывод, данные запишите в журнал;

    в) учтите результаты посева на лецитовителлазу;

    г) учтите результаты посева на ДНК-азу;

    д) учтите результаты фаготипирования.

    Все результаты запишите в журнал, обобщите полученные данные, сформулируйте заключение, внесите его в графу «Результат».

    2. Продолжение исследования крови на сепсис (3-й день). Изучите колонии на кровяном агаре, обратите внимание на размеры колоний, зоны гемолиза, определите вид стрептококка (по гемолизу). Приготовьте мазок из колоний, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте. Результаты запишите в журнал, сделайте заключение по исследованию крови на данном этапе, а в графе «Примечания» отметьте какие ещё исследования следовало бы провести для определения вида стрептококка и его антигенной структуры.

    3. Продолжение исследования на стафилококковое носительство. Изучите и опишите характер колоний на молочно-солевом агаре. Сделайте мазок и, после окраски по Граму, промикроскопируйте. Результаты запишите в журнал, сделайте вывод. В графе «Примечания» опишите, какие исследования надо провести, чтобы дать заключение о наличии или отсутствии стафилококкового носительства.

    4. Разберите схему исследования при стафилококковой интоксикации.

    5. Изучите профилактические и лечебные препараты, применяемые при стафилококковых и стрептококковых инфекциях. Посмотрите препараты, прочитайте этикетки, охарактеризуйте каждый препарат по схеме: что собой представляет (вакцина, анатоксин, сыворотка, иммуноглобулин и др.), что содержит (антиген, антитело), как приготовлен, для чего применяется. Если препарат лечебно-профилактический – какое оказывает действие на организм. Дозируется ли препарат и в каких единицах? Если диагностический – что выявляют с помощью этого препарата?

    6. Исследование отделяемого раны на возбудителей анаэробной газовой инфекции. Ознакомьтесь с сопроводительной запиской и внесите данные в журнал. Приготовьте мазок из отделяемого раны, окрасьте по Граму, промикроскопируйте. Произведите посев на среду Китта–Тароцци, на среду Вильсон–Блера и на молоко. Проделанную работу и результаты запишите в журнал.
    1   ...   24   25   26   27   28   29   30   31   ...   43


    написать администратору сайта