Вирусы бактерий%0D. Учебное пособие для студентов Валеева Ю. В., Савинова А. Н. Казань кгму, 2018 с. 34 Учебное пособие предназначено для студентов медицинских вузов специальности
 Скачать 0.88 Mb.
|
|
2. Взаимодействие умеренного бактериофага с бактериальной клеткой Феномен лизогении. При изучении явления бактериофагии исследователи обратили внимание на то, что иногда встречаются культуры бактерий, которые содержат фаги, хотя на эти культуры фагами и не воздействовали. Другими словами, получалось, что вирулентных свойств фага оказывалось недостаточно для разрушения бактерий. Подобные вирусы, известные как умеренные бактериофаги, претерпевают любопытные превращения, известные как редукция фага. Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции, с частью из них они вступают в «симбиоз», в результате чего ДНК фага встраивается в нуклеоид бактериальной клетки. Геном бактериофага, пребывающий в таком состоянии, называется профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении, реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса, а также передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков. Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом получило название лизогения. Это название (от греч. lysis, 12 разложение, genea, происхождение) отражает способность профага самопроизвольно либо под действием ряда физических и химических факторов реактивироваться и запускать полный репродуктивный цикл, т.е. вести себя как литический бактериофаг. По своим основным свойствам лизогенные культуры принципиально не отличаются от исходных, но они невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом и, кроме того, приобретают дополнительные свойства, контролируемые генами профага. При размножении лизогенной культуры какая–то часть клеток популяции лизируется и освобождает зрелые частицы специфичного для этой популяции умеренного фага. Сохранение способности к инфицированию у умеренного фага зависит от низкомолекулярного белкового репрессора, кодируемого вирусной ДНК и «выключающего» все вирулентные функции бактериофага. Таким образом, белок ингибирует считывание информации с генов бактериофага, вследствие чего не происходит его репродукции. Переход умеренного фага на литический цикл развития происходит при нарушениях синтеза белкового репрессора. При этом встроенный в геном бактерии вирус проявляет все свои вирулентные свойства, репродуцируется и лизирует клетки, а также может инфицировать другие бактерии. Образование лизогенными культурами зрелых частиц фага получило название спонтанной индукции. Количество лизируемых клеток и количество образовавшихся зрелых частиц фага зависят от особенностей данной культуры и условий выращивания. В то же время количество клеток, освобождающих фаги, может быть резко увеличено при воздействии на лизогенную культуру некоторыми физическими и химическими факторами, или при создании в среде избытка некоторых питательных веществ и витаминов. При индукции некоторых лизогенных культур удавалось вызывать образование зрелых частиц фага почти у всех клеток. К индуцирующим агентам относятся ультрафиолетовые (УФ) и гамма- излучения, перекиси, урацил, многие антибиотики. Наиболее эффективные и широко применяемые индуцирующие факторы – УФ–облучение и антибиотик митомицин С. Лизогенная конверсия. Нередко под влиянием профага происходит изменение свойств бактерий. Такое изменение генетических свойств, вызванное вирусной ДНК, обозначают терминами «инфекционная наследственность» или «лизогенная (фаговая) конверсия». В отличие от истинной трансдукции, где фаг выступает в роли «механического» переносчика генетического материала, при лизогенизации сам фаг (вернее, его нуклеиновая кислота) является тем генетическим материалом, который в виде профага дополнительно придается генетическому материалу клетки. Изменение генотипа и, соответственно, фенотипа в результате фаговой конверсии отмечено у многих бактерий и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к антибиотикам и др. Известны бактерии (например, дифтерийная палочка, холерные вибрионы, сальмонеллы, клостридии и др.), вирулентные свойства которых (обычно в виде экзотоксинов 13 или адгезинов) кодируются лизогенными фагами. Иными словами, лизогенная бактерия будет вирулентной, тогда как её нелизогенный «двойник» останется безвредным. Кроме того, лизогения широко распространена среди стрептококков, актиномицетов, микобактерий. Таким образом, умеренные фаги являются важным фактором изменчивости бактерий. При лизогении происходит изменение наследственных свойств не только бактериальной клетки, но и фага; размножаясь в клетке, он способен захватывать некоторые гены бактерии и, инфицируя другую клетку, передаёт приобретённые гены новому хозяину. Подобная передача (трансдукция) во многом аналогична генетической рекомбинации у высших растений и животных. Например, µ–бактериофаг сходен с вставочными последовательностями (IS-элементами) и транспозонами, так как способен включаться практически в любой участок бактериальной хромосомы, привнося свой генетический материал и вызывая мутагенный эффект. При наличии всех типичных свойств фага, µ–бактериофаг можно рассматривать как гигантский транспозон. При трансдукции фаг играет роль лишь механического переносчика; при этом лизогенизация клетки не обязательна. Один и тот же фаг может переносить разные свойства. Трансдукция происходит довольно редко: из одного и более миллионов фаговых частиц только одна способна осуществлять трансдукцию. При помощи трансдукции удавалось перенести от клеток – доноров клеткам – реципиентам различные свойства: токсичность, устойчивость к антибиотикам, способность продуцировать определенные ферменты, антигенные и другие свойства. Есть все основания утверждать, что абсолютное большинство бактерий являются лизогенными. Ни про одну культуру нельзя с уверенностью сказать, что она не лизогенная. К настоящему времени накоплен большой объём данных о том, что многие лизогенные культуры содержат 2, 3, 4 и более умеренных фагов, т.е. являются полилизогенными. Как уже отмечалось, профаг лизогенной культуры способен превратиться спонтанно или при индукции в зрелую полноценную фаговую частицу. Однако в ряде случаев под влиянием различных факторов у профага возникают стойкие наследуемые изменения (мутации), в результате которых он при индукции не способен превращаться в полноценную частицу. Поэтому у таких культур возникают частицы, состоящие только из головки или только из одного отростка. Возможны и другие нарушения в структуре фаговой частицы. При индукции таких культур лизогенная клетка лизируется, но образовавшиеся частицы как неполноценные не способны к размножению на индикаторной культуре. Наиболее детально изучены дефектные фаги, у которых образуются одни лишь отростки. Такие фаги способны адсорбироваться на клетке, вызвать её лизис, но не способны к репродукции. В последние годы такие дефектные фаги привлекают внимание исследователей, так как было установлено, что многие описанные в литературе бактериоцины (вещества, убивающие бактерии) представляют собой дефектные фаговые частицы. 14 Умеренные фаги широко применяют в генной инженерии, их используют для изучения опухолевого роста, как фактор изменчивости микроорганизмов и в других исследованиях. Так как лизогенные культуры в отличие от «здоровых» чувствительны к радиации, они служат для определения надежности защиты космических кораблей от космических лучей – при ненадежной защите профаг переходит в вирулентную форму и лизирует культуру. Оценка действия вирулентных бактериофагов. На твёрдых средах в бактериальных культурах, засеянных сплошным «газоном», размножение фагов сопровождается лизисом бактерий и образованием зон просветления – «стерильных пятен». Для их обозначения предложен термин «негативные колонии бактериофага». У разных фагов они имеют строго определённые размеры и форму, например, звёздчатую у дизентерийных фагов (рисунок 4). При заражении бульонных культур литическим фагом наблюдают просветление среды. Способность образовывать негативные колонии в культурах чувствительных бактерий широко применяют в качестве метода фагодифференцировки при идентификации возбудителей инфекционных болезней. Рисунок 4. Негативные колонии сальмонеллёзного (А) и дизентерийного (Б) бактериофагов На чашках Петри, засеянных исследуемыми культурами, бактериофаги образуют негативные колонии, что указывает на род и даже вид бактерии (в зависимости от специфичности фага). Методы изучения вирулентных фагов Для выделения фага из объектов внешней среды, органов и выделений человека и животных, культур бактерий и т. д.,материал из которого получают фаг,обычно фильтруют с помощью бактериальных фильтров. 15 Подготовка культур бактерий (известных или изучаемых): Для выявления фагов применяют 20 – 24 часовые агаровые культуры бактерий, или 2 – 6 часовые бульонные культуры, из которых готовят взвесь бактерий в изотоническом растворе хлорида натрия. Качественные методы выявления бактериофагов Вирулентные бактериофаги лизируют чувствительные к ним бактериальные культуры (тест – культура). Выявление фага на плотных средах. Приготовленную взвесь тест– культуры засевают «газоном» в чашку Петри на поверхность агара. Посев подсушивают в термостате 30 – 40 мин при открытой крышке, затем наносят на чашку каплю изучаемого материала. Когда жидкость впитается, чашки с посевами помещают в термостат при 37 °С на 18 – 20 часов. При наличии фага в изучаемом материале, произойдет лизис тест – культуры и на месте, куда была нанесена капля, культура или совсем не вырастет (сплошной лизис) или образуются отдельные колонии фага. Выявление фага в жидких средах. Для опыта используютдве пробирки с мясо – пептонным бульоном, в которые вносят по одной капле культуры бактерий, в отношении которых изучают фаг. В первую пробирку добавляют исследуемый фаг или фильтрат материала, в котором его определяют, а вторая пробирка служит контролем роста культуры. Посевы термостатируют 12 – 20 часов при 37 °С. Результаты учитывают только при наличии роста культуры в контроле (помутнение среды). Отсутствие видимого роста или последующее просветление среды в пробирке с изучаемым материалом подтверждает присутствии фага. Если в этой пробирке отмечается помутнение, то исследование необходимо дополнить посевом на плотную среду, так как помутнение могло произойти из–за роста культуры, устойчивой к фагу. Если в посеве на МПА фаг не будет обнаружен, то можно сделать вывод, что его нет в изучаемом материале. Практическое применение фагов Использование бактериофагов в медицинской практике основано на их строгой специфичности к бактериальным клеткам. В соответствии с этим бактериофаги применяют при диагностике бактериальных инфекций для идентификации и типирования их возбудителей, а также для профилактики и лечения бактериальных инфекций. Фагодиагностика – метод, заключающийся в выделении фага из организма больного (например, из испражнений), что косвенно свидетельствует о наличии в материале соответствующих бактерий. Фагодиагностику проводят для определения неизвестного фага с помощью известной тест – культуры бактерий. Например, если исследуемый бактериофаг лизирует культуру возбудителя холеры, то это холерный бактериофаг. Таким образом, опосредованно, без выделения бактерий, можно сделать вывод о наличии возбудителя холеры организме больного. 16 Фагодифференцировка –метод идентификации выделенных культур бактерий, основанный на способности диагностических фагов лизировать определенные виды чувствительных бактерий. В основе лежит принцип совместного культивирования выделенных бактерий с соответствующими видовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым фагом. Например, если лизис колоний вызван дизентерийным бактериофагом, то выделенные бактерии являются культурой шигелл. Диагностические бактериофаги широко применяют для идентификации бактерий, выделенных от больного или из инфицированных объектов внешней среды. С помощью бактериофагов вследствие их высокой специфичности можно определить виды бактерий. Особое значение имеет их применение в экспресс-диагностике особо опасных инфекций (чума, сибирская язва и др.), т.к. позволяет быстро идентифицировать возбудитель и своевременно организовать карантинные мероприятия. Фаготипирование проводят для определения отдельных вариантов (фаговаров) выделенных бактерий, что помогает установить источник инфекции, изучить эпидемиологические связи, отличить спорадические случаи заболеваний от эпидемических. В настоящее время широко применяют фаготипирование бактерий родов Salmonella, Vibrio и Staphylococcus aureus. В основе фаготипирования лежит принцип совместного культивирования выделенных бактерий с соответствующими типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с одним из типовых фагов. Например, для типирования S.aureus, культуру испытуемого штамма (после определения принадлежности к виду S.aureus), выращивают в мясо- пептонном бульоне до появления помутнения. Затем бульонную культуру засевают на чашки Петри с агаром с помощью пастеровской пипетки «газоном». Дно засеянной чашки расчерчивают маркером на23 квадрата (по числу типовых бактериофагов) и в каждый квадрат засеянной чашки петлей или тонко оттянутой пастеровской пипеткой наносят каплю соответствующего бактериофага (обозначены номерами). После подсыхания капель бактериофагов чашку переворачивают крышкой вниз и инкубируют 18 – 20 часов при 30°С. Учет и регистрация результатов. Учет результатов проводят, выявляя негативные колонии бактериофагов (рисунок 6). Результаты типирования регистрируют, записывая против названия штамма номера бактериофагов. 17 Рисунок 6. Учет результатов культуры S.aureus при фаготипировании. На чашке образовались негативные колонии на квадратах №77 и №81. Лечебно – профилактическое применение бактериофагов Фагопрофилактика – способ предупреждения развития заболеваний в очагах инфекции посредством применения коммерческих препаратов бактериофагов. Фаготерапия – метод лечения инфекционных заболеваний посредством применения коммерческих препаратов бактериофагов, к которым чувствительны возбудители. Существует мнение, что фаготерапия инфекционных заболеваний недостаточно эффективна. Тем не менее, многие аспекты подобной точки зрения являются следствием недостаточно и не должным образом изученных фактов. Причины такого недоверия к фаготерапии могут быть обусловлены: – Неправильным или недостаточным пониманием гетерогенности и экологии бактериофагов, а также чувствительных к ним бактерий. Например, бактериальную дизентерию могут вызывать различные виды шигелл и неадекватно выбранный фаг не будет эффективен. – Низкой эффективностью селекции фагов, высоковирулентных против соответствующих бактерий. – Неудовлетворительными результатами применения моновалентных бактериофагов при инфекциях, вызванных, на самом деле, несколькими возбудителями. – Появлением бактерий, резистентных к заражению бактериофагами. Такие штаммы могут возникнуть в результате селекции устойчивых мутантов (это часто происходит, при использовании только одного штамма фага против 18 определенного штамма бактерий) или за счет лизогенизации (при инфицировании умеренным фагом). – Неправильной систематизацией бактериофагов, либо ошибками в производстве (в отношении титра) препаратов, некоторые из которых были полностью неактивны. – Инактивацией многих бактериофагов в условиях низкого рН желудка при применении препаратов внутрь, а также неспецифическим ингибирующим действием различных факторов в жидкостях организма. – Избыточным высвобождением эндотоксинов вследствие массивного лизиса грамотрицательных бактерий в организме больного, что может привести к токсическому шоку (феномен Яриша–Херцхайера). Но подобная проблема также может возникнуть и при применении антибиотиков или антибактериальных химиопрепаратов. – Недостаточной готовностью бактериологических лабораторий для надежной и тщательной идентификации этиологически значимых бактерий, что делает фаготерапию слабо эффективной ввиду ее строгой специфичности. Тем не менее, существуют и очевидные преимущества фаготерапии. – Репродукция бактериофагов регулируется естественным путем, поскольку она поддерживается до тех пор, пока имеются чувствительные бактерии, а затем они постепенно элиминируются из организма и окружающей среды. – Действие бактериофагов строго специфично, по сравнению с антибиотиками, и не вызывают выраженных нарушений в составе микробных сообществ в нестерильных полостях организма человека, что особенно важно в педиатрической практике. В то же время дисбиотические нарушения, вызванные применением многих антибиотиков, могут приводить к развитию серьезных вторичных инфекций. Наиболее яркими примерами являются неспецифические псевдомонозы, трудно поддающиеся лечению, и псевдомембранозные колиты, вызываемые Clostridium difficile. Несомненно, что такие осложнения увеличивают затраты на лечение, а также могут быть причиной летальных исходов. – В сравнении с антибиотиками, число мутантных штаммов, резистентных к бактериофагам значительно ниже. – Фаготерапия дает мало побочных эффектов и особенно показана для лиц с гиперчувствительностью к антибиотикам. – Бактериофаги можно использовать и для санации лечебно – профилактических учреждений и поликлиник, а также для борьбы с госпитальными инфекциями. – Бактериофаги можно применять как в виде монотерапии, так и в сочетании с антибиотиками, что значительно снижает риск селекции резистентных штаммов бактерий. – Несомненные преимущества имеет местное использование бактериофагов, поскольку они продолжают репродуцироваться и проникать глубже в очаг поражения до тех пор, пока в нем остаются жизнеспособные бактерии. В 19 противоположность им, концентрации антибиотиков или антисептиков быстро снижаются по мере удаления от поверхности. С терапевтической целью бактериофаги применяют самыми разными способами. Для коррекции кишечных дисбиозов жидкие препараты применяют внутрь или per rectum при помощи клизмы. Таблетированные формы принимают внутрь. Также возможно использование бактериофагов в форме ректальных свечей. При кожных и раневых инфекциях их применяют в форме примочек на очаги поражения. При фарингитах, ларингитах и тонзиллитах препараты используют для орошения или полосканий. Для лечения отитов препараты закапывают в уши. При лечении абсцессов практикуют введение в его полость ватного шарика, пропитанного препаратом. Больным, страдающим хроническими остеомиелитами, препарат вводят непосредственно в пораженный участок кости. Также препараты можно вносить в различные полости – брюшную, плевральную и суставные, а также применять в форме аэрозолей при легочных поражениях. При инфекциях мочевыводящих путей бактериофаги вливают непосредственно в пораженный орган с помощью зонда. При гинекологических заболеваниях препарат вливают в матку либо применяют влагалищные тампоны, пропитанные ими. Особое направление составляет фагопрофилактика – применение бактериофагов для предупреждения инфекционных болезней в эпидемических очагах путем применения бактериофагов среди лиц с высоким риском заражения. Для профилактики инфекционных заболеваний бактериофаги назначают лицам, имеющим контакт с больным в очаге заболевания. |