Микробиология. микра 2. Вопросы для подготовки к экзамену для студентов спо специальность Сестринское дело
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
37. Реакция преципитации, механизм реакции, отличия от реакции агглютинации. Постановка реакции термокольцепреципитации и реакции преципитации в геле, практическое значение. Реакция преципитации. Реакция преципитации (РП) – это осаждение растворимого антигена при действии антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата). РП применяют для обнаружения неизвестного антигена при ряде инфекционных заболеваний: при сибирской язве, туляремии, менингите, оспе. В судебной медицине ее используют для определения видовой принадлежности крови, спермы; в санитарно-гигиенических исследованиях – для установления фальсификации пищевых продуктов. РП отличается очень высокой чувствительностью и позволяет обнаружить антиген в разведении 1:1 000 000 и 1: 10 000 000. Компоненты реакции преципитации. 1. Антиген (преципитиноген) - это антиген молекулярной природы, находящийся в мелкодисперсном (растворимом) состоянии. Преципитиногены – это различные лизаты или экстракты тканей и др. Преципитиноген отличается от агглютиногена размером частиц антигена. Агглютиноген имеет размеры клеток (это не разрушенные целые клетки), а размеры преципитиногена соизмеримы с размерами молекул (это белки и их комплексы с углеводами или липидами). Раствор преципитиногена прозрачный. 2. Антитела (преципитины) находятся в сыворотке крови человека или в иммунных диагностических преципитирующих сыворотках, которые содержат известные антитела. 3. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия. Получение преципитиногена. Получают путем измельчения материала и извлечения из него белковых антигенов кипячением или другими способами. Примеры преципитиногенов: лизаты или экстракты различных органов и тканей, чужеродная сыворотка крови (сыворотка - это раствор, в первую очередь, различных белков), фильтраты бульонных культур микробов, солевые экстракты микробов, аутолизаты и др. Получение преципитирующих сывороток. Получают путем гипериммунизации кроликов соответствующими преципитиногенами. Такие сыворотки содержат антитела к тем преципитиногенам, которыми иммунизировали кроликов. Примеры преципитирующих сывороток: преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (содержит антитела к антигенам возбудителя сибирской язвы), преципитирующая противоменингококковая сыворотка (содержит антитела против антигенов возбудителя менингита) и др. Титр преципитирующей сыворотки – это наибольшее разведение преципитиногена, при котором сыворотка еще дает реакцию преципитации. Способы постановки РП. Реакция кольцепреципитации – проводится в специальных преципитационных пробирках (диаметр – 0,4-0,5 см, высота – 7-8 см). В пробирку вносят 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки и по стенке длинным носиком пастеровской пипетки осторожно наслаивают такое же количество преципитиногена. Затем осторожно из горизонтального положения пробирки ставят вертикально. Учет результатов реакции проводят по появлению белого кольца на границе антиген-антитело. При положительной реакции наблюдается образование такого кольца. В этом случае антиген соответствует антителу и происходит их связывание. Если в качестве преципитиногена используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, то реакция называется реакцией термокольцепреципитации (например, при диагностике сибирской язвы). Реакция преципитации в геле – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в которые помещают антигены или антитела, или и то и другое. Различают 2 метода РП в геле: а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии: один из компонентов реакции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а другой компонент – смешивают с агаром; при положительном результате (антиген соответствует антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата; б) метод двойной иммунодиффузии: и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу; при положительном результате на месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации. Примером РП в геле является реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони при диагностике дифтерии Иммуноэлектрофорез – это метод, который сочетает метод электрофореза и реакцию преципитации. Смесь антигенов (например, белков сыворотки крови) разделяется в геле при помощи электрофореза. Затем, чтобы найти и определить нужный белок (неизвестный антиген), используют диагностическую преципитирующую сыворотку, которая содержит антитела к этому белку (известное антитело). Для этого в канавку параллельно белкам вносится диагностическая сыворотка. Если среди белков имеется тот, который соответствует антителу, находящемуся в сыворотке, то вокруг него образуются линии преципитации. 38. Реакция связывания комплемента (РСК), механизм реакции, практическое использование. Гемолизины, получение гемолитических сывороток. Комплемент и его получение. Ингредиенты, необходимые для постановки реакции РСК. Постановка основного опыта РСК, учет реакции, оценка результатов. В основу реакции легли два явления — бактерилиза и гемолиза. В их проявлении участвует комплемент. Поэтому в РСК применяют две системы компонентов: одна обеспечивает феномен бактериолиза и используется для диагностических целей, другая — гемолитическая, индикаторная, вспомогательная, позволяющая установить, связался или не связался комплемент в первой системе. Ранее в качестве антигена брали взвесь бактерий, поэтому первая система была названа бактериолитической (в положительных случаях происходил лизис бактерий). РСК осуществляют в два этапа. Сначала готовят бактериолитичес- кую систему — в пробирках смешивают по 0,5 мл исследуемой сыворотки и антигена, добавляют комплемент в строго определенной дозе (титре). Смесь антиген—сыворотка—комплемент (бактериолитическая система) помещают в водяную баню (или термостат) и выдерживают при температуре 37—38 °С 20—40 мин. Результат взаимодействия компонентов в пробирке невидим, жидкость остается прозрачной и бесцветной. Чтобы определить, связался ли комплемент в бактериолитической системе, нужен второй этап реакции. В пробирки добавляют компоненты гемолитической системы — отмытые эритроциты барана и инактивированную гемолитическую сыворотку. Все компоненты бактериолитической системы встряхивают для перемешивания в пробирке, помещают в водяную баню и выдерживают при температуре 37—38 °С 20—40 мин. Затем добавляют компоненты гемолитической системы, вторично все встряхивают и вновь помещают в водяную баню на 10—15 мин. Предварительный учет результата: если сыворотка от больного животного, то в ней содержатся антитела, которые соединяются со специфическим антигеном. С этим комплексом (антиген—антитело) связывается комплемент—гемолиза не будет, результат положительный. Если сыворотка от здорового животного, она антител не содержит, комплекса антиген—антитело не образуется, комплемент в бакте- риолитической системе не свяжется. При добавлении эритроцитов и гемолизина (это между собой антиген и антитело) комплемент реагирует с этим комплексом — произойдет гемолиз, результат отрицательный. После этого пробирки оставляют при комнатной температуре на 15—20 ч и учитывают окончательный результат. Если в бактериолити- ческой системе сыворотка была от больного животного, то в пробирке образуется специфический комплекс антиген—антитело, который адсорбирует (связывает) весь добавленный комплемент. Следовательно, во второй, гемолитической, системе гемолиза не произойдет, эритроциты осядут на дно пробирки, надосадочная жидкость прозрачная — результат РСК положительный. Если в исследуемой сыворотке нет специфических антител к используемому антигену (в случаях, когда сыворотка от здорового животного), то в бактериолитической системе комплекс антиген—антитело не образуется и, следовательно, комплемент в данной системе не адсорбируется, он остается свободным в пробирке. При добавлении компонентов гемолитической системы (во второй фазе реакции) комплемент вступает во взаимодействие со вторым комплексом (гемолизин—эритроциты), происходит гемолиз — осадка эритроцитов не образуется, жидкость в пробирке лаково-красная. Результат: РСК отрицательный. РСК используют: 1) для обнаружения в сыворотке больного животного специфических антител (при диагностике бруцеллеза, перипневмонии, сапа, лептоспироза, трипаносомоза и др.); 2) для выявления в исследуемом материале специфического антигена (бактериального или вирусного) при наличии специфической иммунной сыворотки. Для постановки РСК необходимо иметь: пробы сывороток, поступившие для исследования; две сыворотки заведомо позитивные (стандартные, обеспечивающие положительный результат) и две — нормальные (все сыворотки в разведении 1:10 инактивируют при 56—58 °С 30 мин); антиген в разведении согласно титру; комплемент, разведенный в соответствии с установленным тигром при титрации в бактериолитической системе; гемолизин в рабочем титре; эритроциты барана 1:40; физиологический раствор; градуированные пипетки; пробирки; штативы; водяную баню, рассчитанную на 37—38 °С. Перед постановкой РСК кровь барана дефибринируют, эритроциты отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования до полной прозрачности надосадочной жидкости, которую удаляют отсасыванием, а осажденные эритроциты разводят в физиологическом растворе 1:40 (2,5%). Антиген разводят согласно титру, указанному на 166 этикетке биофабрикой. Гемолизин и комплемент перед постановкой РСК титруют. Антиген для РСК готовят на биофабриках. Обычно это экстракты разрушенных микробных взвесей (или вирусосодержащей ткани). Антигены не должны обладать гемолизирующим действием, что контролируется в процессе постановки реакции (в пробирку наливают 1—2 дозы антигена и 0,5 мл взвеси эритроцитов: гемолиза не должно быть). На ампуле с антигеном биофабрика указывает, что он предназначен специально для РСК (сапной, бруцеллезный или другой). На упаковочной коробке ставят номер серии, дату изготовления, срок годности, активность антигена, т.е. в каком разведении его надлежит использовать при постановке РСК (1:100,1:150ит.п.). При отдельных заболеваниях антигеном служат другие материалы. Например, для диагностики перипневмонии крупного рогатого скота антигеном для РСК служит лимфа теленка, экспериментально зараженного подкожно или интраплеврально. При длительном хранении антигенов их титр вновь проверяют в лаборатории по специальной схеме титрации. Испытуемые сыворотки, поступившие для исследования, разводят физиологическим раствором 1:5 или 1:10, для разрушения собственного комплемента инактивируют прогреванием на водяной бане при температуре 56—58 °С (сыворотки ослов, мулов, лошаков — при 61 °С) 30 мин. Гемолизин готовят на биофабриках путем гипериммунизации кроликов отмытыми эритроцитами барана. Для этого кроликам внутривенно 4—5 раз с 2—3-дневными интервалами вводят 40—50%-ю взвесь эритроцитов. Через неделю после последней инъекции у кроликов берут кровь, стерильно отсасывают сыворотку, инактивируют ее, консервируют глицерином 1:1 или 0,5%-м фенолом, титруют, разливают по ампулам. В лабораториях перед постановкой РСК вновь титруют. Схема титрации гемолизина. Для данной реакции необходимо подготовить: 1) комплемент в разведении 1:20; 2) гемолизин в разведении 1:100 (0,2 мл гемолизина + 9,8 мл физраствора); 3) взвесь эритроцитов барана 1 : 40; 4) физиологический раствор NaCl. Для постановки реакции титрации в штативе размещают два ряда пробирок — первый (вспомогательный) нужен для приготовления разведений гемолизина, второй — собственно для титрации. Только в первую пробирку вносят исходное разведение гемолизина 1 : 100, затем производят последовательное разведение (рис. 9.20). Все пробирки встряхивают и помещают на водяную баню, выдерживая при 37—38 °С 10—15 мин. Учет результата: в данном примере наименьшее количество (или его наибольшее разведение), давшее полный гемолиз, — 1: 2000; это фактический титр гемолизина. Рабочий титр в два раза концентрированнее — 1 : 1000. 39. Понятие об иммунотерапии и иммунопрофилактике (определения). Классификация иммунобиологических препаратов (ИБП). Общая характеристика и классификация ИБП Иммунобиологические препараты имеют сложный состав, отличаются по своей природе, способам получения и применения, целевому назначению. Однако, как указывалось выше, их объединяет то, что они действуют или на иммунную систему, или через иммунную систему, или же механизм их действия основан на иммунологических принципах. Действующим началом в ИБП являются или антигены, полученные тем или иным способом, или антитела, или микробные клетки и их дериваты, или биологически активные вещества типа иммуноцитокинов, иммунокомпетентные клетки и другие им-мунореагенты. Кроме действующего начала, ИБП могут, в зависимости от их природы и характера, включать стабилизаторы, адъ-юванты, консерванты и другие субстанции, улучшающие качество препарата (например, витамины, адаптогены). ИБП могут применяться парентерально, перорально, аэрозольно или другими способами, поэтому им придают соответствующую лекарственную форму: стерильные растворы и суспензии или лиофилизированные растворимые порошки для инъекций, таблетки, свечи, аэрозоли и т. д. Для каждого ИБП установлены строго регламентированные дозировки и схемы применения, показания и противопоказания, а также побочные эффекты. В настоящее время выделяют 5 групп иммунобиологических препаратов (А. А. Воробьев): первая группа — ИБП, получаемые из живых или убитых микробов (бактерий, вирусов, грибов) или микробных продуктов и используемые для специфической профилактики или терапии. К ним относятся живые и инак-тивированные корпускулярные вакцины, субклеточные вакцины из микробных продуктов, анатоксины, бактериофаги, пробиотики; вторая группа — ИБП на основе специфических антител. К ним относятся иммуноглобулины, иммунные сыворотки, иммуноток-сины, антитела-ферменты (абзимы), рецепторные антитела, мини-антитела; третья группа — иммуномодуляторы для иммунокоррекции, лечения и профилактики инфекционных и неинфекционных болезней, иммунодефицитов. Сюда относятся экзогенные иммуномодуляторы (адъюванты, некоторые антибиотики, антиметаболиты, гормоны) и эндогенные иммуномодуляторы (интерлей- кины, интерфероны, пептиды тимуса, миело-пептиды и др.); четвертая группа — адаптогены — сложные химические вещества растительного, животного или иного происхождения, обладающие широким спектром биологической активности, в том числе действием на иммунную систему. К ним относятся, например, экстракты женьшеня, элеутерококка и других растений, тканевые лизаты, различные биологически активные пищевые добавки (липиды, полисахариды, витамины, микроэлементы и другие микронутриенты); пятая группа — диагностические препараты и системы для специфической и неспецифической диагностики инфекционных и неинфекционных болезней, с помощью которых можно обнаруживать антигены, антитела, ферменты, продукты метаболизма, биологически активные пептиды, чужеродные клетки и т. д. Иммунотерапия (от иммунитет и терапия) — раздел практической иммунологии, задача которого — лечение иммунологическими препаратами, которые воздействуют прицельно на иммунную систему: препаратами антител или сывороток, моноклональными антителами, препаратами микробного происхождения, цитокиновая и антицитокиновая терапия, клеточная терапия[источник не указан 946 дней]. Иммунотерапию в качестве вспомогательного метода применяют при инфекционных[1], онкологических заболеваниях[2], в этом случае чаще сочетают с лечением антибиотиками и химиотерапией. Иммунотерапия показана при первичном нарушении работы иммунной системы — иммунодефицитах, аутоиммунных заболеваниях. Иммунопрофилактика – единственный надежный способ, позволяющий предупреждать возникновение эпидемий или вспышек инфекционных заболеваний и полностью их контролировать. Она направлена на выработку искусственного активного иммунитета, обеспечивающего невосприимчивость к возбудителям инфекционных болезней. 40. Вакцины: определение, классификация, назначение. Живые вакцины, принципы получения, примеры. Преимущества и недостатки живых вакцин. Вакцины — препараты, служащие для создания активного искусственного приобретенного иммунитета. В настоящее время известны следующие вакцинные препараты: 1) живые вакцины, представляющие собой ослабленные в своей вирулентности различные микроорганизмы; 2) убитые, содержащие инактивированные возбудители заболеваний; 3) химические, состоящие из растворимых антигенов бактерий, извлеченных химическими методами; 4) анатоксины, обезвреженные формалином экзотоксины возбудителей токсинемических инфекций. Препараты, предназначенные для проведения иммунизации против одной какой-нибудь инфекции, получили название моновакцины; против двух инфекционных заболеваний — дивакцины; против трех — тривакцины; против нескольких инфекций — поливакцины. Ассоциированными вакцинами называются препараты, содержащие смесь из антигенов различных бактерий и анатоксинов. Применение ассоциированных вакцин, таких как АКДС или TABte дает возможность создавать иммунитет в отношении нескольких инфекций и сокращать число прививок. Поливалентными вакцинами принято называть препараты, которые включают несколько разновидностей или серологических типов возбудителей одной инфекции (например, противогриппозные, лептоспирозные и др.). Живые вакцины. Получение, применение: достоинства и недостатки. Живые вакцины представляют собой мутанты, то есть вакцинные штаммы микроорганизмов с остаточной вирулентностью, не способные вызывать специфические заболевания, но сохранившие способность размножаться и находиться в организме, приводя к развитию бессимптомной вакцинной инфекции. Вакцинные штаммы для приготовления живых вакцин были получены различными путями: методом отбора (селекции)мутантов с ослабленной вирулентностью, методом экспериментального направленного изменения вирулентных свойств озбудителя, длительным пассированием в организме животных, методом генетического скрещивания (получения рекомбинантов). В последние годы был применен еще один метод для получения вакцинных штаммов, основанный на использовании генетических скрещиваний, результатом которых являются рекомбинанты со сниженной вирулентностью. Так был получен акцинный штамм вируса гриппа А при взаимодействии авирулентного исходного штамма (содержащего гемагглютинин Н? и нейраминидазу N2) и вирулентного штамма Гонконг H3N2). Рекомбинант содержал гемагглютинин Н3 вирулентного вируса Гонконг и сохранил авирулентность исходного вакцинного штамма.Живые вакцины имеют целый ряд преимуществ в сравнении с другими видами вакцин, и связано это свойство с тем, что пребывание и размножение в организме человека и животных аттенуированных вакцинных штаммов приводит к развитию вакцинной инфекции (специфического инфекционного заболевания без выраженных клинических симптомов).Вакцинная инфекция, проявляясь ли в виде местного воспалительного процесса или сопровождаемая общей реакцией организма, всегда влечет за собой перестройку иммунобиологических свойств организма и выражается в выработке специфического иммунитета. Живые вакцины, как правило, вводятся однократно и более простыми способами (перорально, интраназально, накожно, реже подкожно). Способность вакцинного штамма размножаться и присутствие в организме постоянного антигенного раздражителя обеспечивает напряженный, прочный и довольно длительный иммунитет.К вакцинным штаммам предъявляются следующие основные требования:а) наличие остаточной вирулентности;б) достаточная иммуногенность;в) отсутствие возможности реверсии к исходным свойствам.Таким образом, вакцинные штаммы должны обладать стойкими, наследственно закрепленными аттенуированными свойствами. Для сохранения жизнеспособности и стабильности свойств большинство живых вакцин выпускают в сухом виде, что достигается методом лиофилизации — высушивание из-за мороженного состояния под глубоким вакуумом. Сухие вакцины могут сохраняться в течение года и более при температуре холодильника (не выше 4°—8°С). |