Белки. УП Белки (2). Биохимия белки и ферменты учебное пособие
 Скачать 5.92 Mb.
|
|
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ ЧИТИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ БИОХИМИЯ: БЕЛКИ И ФЕРМЕНТЫ УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ Чита, 2020 2 УДК 577.11(075.8) Бондаревич Е.А., Коцюржинская Н.Н., Караваева Т.М. Биохимия: Белки и ферменты. Учебное пособие. – Чита, 2020. – 97 с. Предлагаемое учебное пособие содержит теоретический материал о строении, классификации и механизмах биологического действия белков и ферментов в живых организмах. Для самопроверки полученных знаний в учебном пособии приведены ситуационные задачи. Лабораторный практикум представлен двумя лабораторными работами по качественному и количественному определению полипептидов и особенностей работы ферментов. Учебное пособие предназначено для студентов медицинских вузов, для аудиторной и внеаудиторной работы в блоках тем «Белки и ферменты». Учебное пособие предназначено для студентов медицинских вузов, изучающих дисциплины «Биохимия» (в учебных планах специальностей: 31.05.01 – «Лечебное дело» и 31.05.02 – «Педиатрия») и «Биологическая химия – биохимия полости рта» (специальность 31.05.03 – «Стоматология»). Рецензенты: Заведующий кафедрой химии ФГБОУ ВО «Амурской государственной медицинской академии» Минздрава России, доктор медицинских наук, профессор Бородин Е.А. Доцент кафедры биологии, химии и методики их обучения ФГБОУ ВО «Забайкальского государственного университета», кандидат биологических наук Лесков А.П. 3 Оглавление Введение ......................................................................................................................................... 4 Глава 1. Аминокислоты – свойства и строение .......................................................................... 6 Глава 2. Белки. Уровни организации ......................................................................................... 10 Глава 3. Физико-химические свойства белков и их растворов ............................................... 17 Глава 4. Нарушение и восстановление структуры нативных белковых молекул – денатурация, ренатурация и фолдинг ........................................................................................ 21 Глава 5. Биологические свойства белков .................................................................................. 25 Глава 6. Классификации белков ................................................................................................. 28 Глава 7. Методы изучения белков ............................................................................................. 40 Лабораторная работа № 1. «Исследование свойств белков» .................................................. 47 Ситуационные задачи к разделу «Белки» ................................................................................. 52 Глава 8. Ферменты. Основные понятия .................................................................................... 54 Глава 9. Классификация и номенклатура ферментов .............................................................. 55 Глава 10. Специфичность действия ферментов........................................................................ 62 Глава 11. Структура ферментов ................................................................................................. 64 Глава 12. Каталитическая активность и механизм действия энзимов ................................... 68 Глава 13. Кинетика ферментативного катализа ....................................................................... 70 Глава 14. Факторы, влияющие на ферментативную активность ............................................ 75 Глава 15. Регуляция ферментативной активности ................................................................... 77 15.1. Ингибирование активности ферментов ........................................................................ 78 15.2. Аллостерическая регуляция ........................................................................................... 83 15.3. Ковалентная модификация ............................................................................................ 84 15.4. Частичный протеолиз (активация зимогена) ............................................................... 85 15.5. Белок-белковое взаимодействие (ассоциация-диссоциация четвертичных ферментных комплексов) ........................................................................................................ 86 Глава 16. Изоферменты ............................................................................................................... 86 Глава 17. Ферменты в медицине ................................................................................................ 88 Лабораторная работа № 2. «Изучение свойств ферментов» ................................................... 91 Ситуационные задачи к разделу «Ферменты».......................................................................... 94 Список рекомендуемой литературы ................................ Ошибка! Закладка не определена. 4 ВВЕДЕНИЕ В живых клетках происходит синтез множества органических молекул, среди которых главную роль играют полимерные макромолекулы – белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды. Особая роль в жизнедеятельности живых организмов принадлежит белкам. От родителей детям передаѐтся генетическая информация о специфической структуре и функциях всех белков данного организма. Синтезированные белки выполняют многообразные функции: ускоряют химические реакции, выполняют транспортную, структурную, защитную функции, участвуют в передаче сигналов от одних клеток другим и таким образом реализуют наследственную информацию. На долю белков внутри клетки приходится более половины их сухого вещества. В организме человека насчитывают около 50 000 индивидуальных белков. Видовая и индивидуальная специфичность набора белков в данном организме определяет особенности его строения и функционирования. Набор белков в дифференцирующихся клетках одного организма определяет морфологические и функциональные особенности каждого типа клеток. Полипептидные цепи за счѐт внутримолекулярных взаимодействий образуют пространственные структуры – конформации белков. На определѐнном участке белковой молекулы из радикалов аминокислот формируется активный центр, который может специфично (комплементарно) связываться с молекулами-лигандами. Взаимодействие белков с лигандами лежит в основе их функционирования. Изменения последовательности аминокислот в белках могут приводить к изменению пространственной структуры и функций данных белков и развитию заболеваний. Основу жизнедеятельности любого организма составляют химические процессы. Практически все реакции в живом организме протекают с участием природных биокатализаторов, называемых ферментами, или энзимами. Среди множества энергетически возможных реакций ферменты избирательно преобразуют реагенты, называемые субстратами, по физиологически полезному пути. Таким образом, ферменты управляют всеми метаболическими процессами организма. В научной литературе на русском языке утвердились оба термина: «ферменты» и «энзимы», но предпочтение отдают термину «фермент», хотя наука о ферментах называется энзимология. Становление энзимологии как науки произошло в начале XIX века. Активное еѐ развитие продолжается до настоящего времени. В задачи этой науки входят определение роли отдельных ферментов в ускорении химических реакций, протекающих в организме, выделение и очистка ферментов, установление их структуры, исследование механизма действия, изучение кинетических характеристик и особенностей регуляции активности in vivo. Для практической медицины важность энзимологии обусловлена тем, что она даѐт фармакологам инструмент направленного изменения 5 метаболизма клетки путѐм воздействия определѐнными химическими веществами на активность ферментов. Огромное количество фармацевтических препаратов – ингибиторы ферментов. Другая, не менее важная задача энзимологии для практической медицины – использование методов определения активности ферментов в биологических жидкостях для диагностики заболеваний. Кроме того, выделенные и очищенные ферменты могут использоваться в качестве терапевтических средств. 6 ГЛАВА 1. АМИНОКИСЛОТЫ – СВОЙСТВА И СТРОЕНИЕ Аминокислоты – это гетерофункциональные низкомолекулярные вещества, содержащие в своем составе аминогруппу (–NH 2 ) и карбоксильную группу (–СООН). В зависимости от взаимного расположения функциональных групп аминокислоты подразделяются на α, β, γ, δ и ω. Известно более 300 природных аминокислот различного строения, из них наибольшее значение имеют α-аминокислоты, которые являются мономерами белков. Из всех природных α-аминокислот только 20 постоянно присутствуют во всех белковых молекулах. Они называются протеиногенными аминокислотами и имеют следующие особенности: 1) общая формула – аминокислоты отличаются только строением боковой цепи (R); 2) за исключением глицина (у которого боковая цепь представлена атомом водорода), все аминокислоты содержат не менее одного центра хиральности (α-углеродный атом); 3) все протеиногенные аминокислоты имеют L-конфигурацию; 4) в твѐрдом состоянии и в полярных растворителях существуют в виде биполярных ионов (цвиттер-ионов) или внутренних солей: ; 5) хорошо растворяются в полярных растворителях (вода, жидкий аммиак), при этом более высокую растворимость имеют аминокислоты с гидрофильной боковой цепью; 6) проявляют кислотно-основные свойства (амфотерные), которые зависят от значений рН среды и строениям боковой цепи. В сильнокислой среде преимущественно существуют катионы, а в сильнощелочной – анионы: 7) взаимодействуют друг с другом, образуя пептидную связь: 8) способны связываться с тРНК, которые переносят их к рибосомам и обеспечивают включение в растущую полипептидную цепь в процессе трансляции. Классификация и номенклатура аминокислот 7 Аминокислоты можно классифицировать по различным признакам (рис. 1): 1) По строению углеводородного радикала боковой цепи выделяют – алифатические (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин и пролин); ароматические (фенилаланин, тирозин, триптофан); гетероциклические (пролин, триптофан). В боковой цепи могут содержаться функциональные группы, например: алифатические, содержащие гидроксильную группу (серин, треонин); алифатические, содержащие тиольную группу или серосодержащие (цистеин, метионин); алифатические, содержащие карбоксиамидную группу (глутамин и аспарагин). кислые, содержащие дополнительную карбоксильную группу (аспарагиновая и глутаминовая кислоты); основные, содержащие второй основный центр (лизин, гистидин и аргинин). 2) По полярности радикалов боковой цепи они различают: - неполярные гидрофобные аминокислоты, имеют незаряженный радикал (аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин и пролин, триптофан, фенилаланин). При сближении в пространстве радикалы этих аминокислот обеспечивают гидрофобное взаимодействие. - полярные гидрофильные, незаряженные аминокислоты (глицин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин) – содержат полярные неионогенные функциональные группы. При сближении в пространстве радикалы этих аминокислот образуют водородные связи. Цистеиновые остатки формируют ковалентную связь – дисульфидный мостик. Кислые аминокислоты (отрицательно заряженные) при растворении в воде (рН=7) приобретают анионную форму (аспарагиновая и глутаминовая кислоты). Основные аминокислоты (положительно заряженные), при растворении в воде переходят в катионную форму (лизин, гистидин и аргинин). Радикалы кислых и основных аминокислот образуют друг с другом ионные связи. 3) по пищевой ценности аминокислоты разделяют на группы: - незаменимые (эссенциальные) аминокислоты, синтез которых в организме человека не происходит и они должны поступать с пищей (всего 8 соединений – валин, лейцин, изолейцин, треонин, фенилаланин, метионин, лизин, триптофан). Гистидин и аргинин у новорожденных детей синтезируются в недостаточном количестве, поэтому являются обязательным элементом в питании. У взрослых недостатка в синтезе этих аминокислот обычно не наблюдается. - заменимые аминокислоты – в организме осуществляется их синтез, который полностью или частично удовлетворяет потребности в аминокислоте. 8 Рис. 1. Формулы и классификация по строению и свойствам бокового радикала протеиногенных аминокислот 1 1 Материал с сайта: https://biokhimija.ru/aminoikislota/proteinogennye.html 9 Остатки некоторых протеиногенных аминокислот могут подвергаться ковалентной модификации после синтеза полипептидной цепи, что обеспечивает, прежде всего, стабилизацию и правильную укладку полипептидных цепей в трехмерную нативную структуру. Функции некоторых производных протеиногенных и непротеиногенных аминокислот представлены в таблице 1. Таблица 1. Свойства и функции некоторых «необычных» аминокислот. Аминокислота Формула Биологическая роль 4- Гидроксипролин Входит в состав белка соединительной ткани – коллагена, обеспечивает образование прочной тройной спирали (тропоколлагена). Синтезируется из пролина. Концентрация этого вещества в моче позволяет оценивать уровень разрушения соединительной ткани. 5-Гидроксилизин Образуется при ферментативном окислении лизина. Входит в состав коллагена и некоторые гликопротеины. Необходим для образования водородных связей между α- цепями коллагена. Селеноцистеин 21-я протеиногенная аминокислота, аналог цистеина с заменой атома серы на атом селена. Входит в состав активного центра фермента глутатионпероксидазы, а также в состав селенопротеинов и некоторых других белков, так как обладает мощными восстановительными свойствами. Селенометионин Важный пищевой источник селена. Обладает антиоксидантыми свойствами. Промежуточный метаболит обмена селеноцистеина. Орнитин Промежуточный метаболит, участвующий в обезвреживании аммиака в печени и в метаболизме аргинина. Цитруллин Промежуточный метаболит в цикле обезвреживания аммиака (орнитиновый цикл) и участник синтеза аргинина. γ- Кабоксиглутамин овая кислота Образуется в белках (факторах свѐртывания крови, неколлагеновых белках межклеточного матрикса) при карбоксилировании глутаминовой кислоты. За счет данного вещества факторы свѐртываемости и другие белки связывают ионы кальция и запускают процесс коагуляции или межмолекулярного взаимодействия. γ- Аминомаслянная кислота Образуется путѐм декарбоксилирования глутаминовой кислоты, является тормозным нейромедиатором ЦНС. Тормозит распространение нервного импульса, повышая 10 проницаемость постсинаптических мембран для хлорид-ионов. Таурин Сульфокислота, образующаяся в организме в ходе реакций окисления цистеина. Таурин образует в печени конъюгаты с жѐлчными кислотами (например, таурохолевую и тауродезоксихолевую кислоты) которые, обладая высокой поверхностной активностью, способствуют эмульгированию жиров в кишечнике. Является тормозным нейромедиатором. ГЛАВА 2. БЕЛКИ. УРОВНИ ОРГАНИЗАЦИИ α-Аминокислоты взаимодействуя друг с другом образуют прочные ковалентные связи, которые называются пептидными (рис. 2). Для них характерны следующие свойства: 1) Копланарность – все атомы, входящие в пептидную группу, находятся в одной плоскости. 2) Атом водорода аминогруппы и атом кислорода карбонильной группы находятся в транс-положении. 3) Связь между атомом углерода карбоксильной группы и атомом азота имеет частично двойной характер из-за p,π-сопряжения. Поэтому свободное вращение вокруг пептидной связи невозможно. 4) Пептидная связь является ковалентной и стабильной. Разрушение этой связи идѐт в жѐстких условиях (при нагревании в присутствии концентрированных кислот, щелочей) или в присутствии катализаторов. В биохимических реакциях протекает ферментативный гидролиз. 11 Рис. 2. Схема образования пептидной связи между α-аминокислотами. Полимеры, образованные менее чем 50-ю аминокислотными остатками относятся к пептидам, а более 50-ти – к белкам. Главное отличие между белками и пептидами в том, что белки могут формировать и поддерживать определѐнную пространственную структуру. Белки или протеины – линейные неразветвленные биополимеры, мономерами которых являются α-аминокислоты. Информация о каждом белке организма закодирована в ДНК, и реализуется в ходе процессов матричных биосинтезов. Синтез протеинов (трансляция) происходит с участием рибосом. В основе структурной организации белковых молекул лежит образование пептидных связей между аминокислотами (рис. 2). Таким образом, включенную в молекулу белка аминокислоту называют аминокислотным остатком, а порядок расположения аминокислотных остатков в белковой молекуле – аминокислотной последовательностью. Каждый индивидуальный белок характеризуется специфичной 12 аминокислотной последовательностью, которая называется первичной структурой белка. Некоторые короткие пептиды синтезируются вне рибосом и выполняют свои функции, оставаясь в первичной структуре. К таким соединениям относятся: 1) Глутатион – трипептид, состоящий из γ-глутамата, цистеина и глицина. Его роль связана с мощным антиоксидантным действием (защищает от окисления тиольные группы белков, восстанавливает Н 2 О 2 (при работе в составе фермента – глутатионпероксидазы)). Также этот трипептид участвует в переносе через клеточные мембраны других аминокислот и используется для получения конъюгатов в процессах обезвреживания ксенобиотиков 2 в печени. 2) Вазопрессин и окситоцин – гормоны, состоящие каждый из 9 аминокислот (нонапептиды), синтезируются в гипоталамусе и попадают в нейрогипофиз. Первый участвует в регуляции водно-минерального баланса, увеличивая реабсорбцию 3 воды, второй – стимулирует сокращения гладкой мускулатуры матки при родовой деятельности (однако не запускает роды) и гладкомышечных волокон протоков молочных желѐз. 3) Ангиотензин II – оказывает сосудосуживающие действие 4 и участвует в регуляции водно-минерального обмена. 4) Энкефалины – пентапептиды и эндорфины – 13-31-членные пептиды, участвующие в передаче нервных импульсов, могут оказывать обезболивающий эффект и влиять на эмоциональное состояние. Первичная структура определяет явление полиморфизма белков. Это существование одного и того же белка в нескольких молекулярных формах, отличающихся по первичной структуре, физико-химическим свойствам и проявлениям биологической активности. Причинами полиморфизма являются рекомбинации и мутации генов. Результатом полиморфизма является наличие в пределах одного организма множества молекулярных форм протеина, называемых изобелками. Примерами изобелков являются разные виды гемоглобина, образующиеся в разные периоды онтогенеза (например, фетальный гемоглобин плода, состоящий из α 2 γ 2 -цепей и гемоглобин взрослых из α 2 β 2 -цепей). 2 Ксенобиотики (от греч. чуждый жизни) – любые чуждые для организма вещества, способные нарушать течение биологических процессов, и не являющихся компонентом биотического круговорота веществ. 3 Реабсорбция (лат. re обратное + лат. absorptio поглощение, всасывание) – обратное всасывание жидкости из полостей и полых анатомических структур организма. 4 Вазоконстрикция – сужение кровеносных сосудов и уменьшение кровотока в них. 13 Также в эту группу входят и изоферменты – катализирующие одну и ту же реакцию в разных клетках с разной скоростью и эффективностью (например, лактатдегидрогеназа (ЛДГ), креатинкиназа (КК)). Это связано с их незначительными отличиями в первичной структуре. Некоторые изоформы белков и ферментов являются патологическими и могут приводить к развитию тяжѐлых нарушений обмена веществ. Примерами являются гемоглобины, синтез которых происходил с аллелей, несущих точечные мутации, например, серповидно-клеточный гемоглобин. Вторичная структура белков – это способ укладки полипептидной цепи в более компактную структуру за счѐт образования водородных связей между атомами пептидных групп. Эта локальная конформация полипептидной цепи обусловлена вращением отдельных участков биополимера вокруг одинарных связей. Вторичная структура представлена α- спиралями, β-складчатыми слоями и нерегулярными участками. α-Спираль – это палочкообразная структура, в которой пептидные связи расположены внутри, а боковые радикалы аминокислот – снаружи. α- Спирали стабилизированы водородными связями, которые параллельны оси спирали и возникают между первым и пятым аминокислотными остатками (рис. 3, а). Таким образом, в протяжѐнных спиральных участках каждый аминокислотный остаток принимает участие в формировании двух водородных связей. На один виток спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, шаг спирали 0,54 нм. Угол подъѐма спирали – 26 °. А Б Рис. 3. А. Схема α-Спирали; Б. Схема α-цепей коллагена и тропоколлагена. Наиболее распространѐнными являются правозакрученные α-спирали (закручивание спирали идѐт по часовой стрелке). Образованию спирали 14 препятствует пролин, аминокислоты с заряженными и объѐмными радикалами (электростатическое и механическое препятствие). Другая форма спирали присутствует в коллагене (это главный белок межклеточного матрикса и других соединительнотканных структур организма человека и животных, на долю которого приходится 25 % от массы всех белков организма). В молекулах коллагена присутствуют левозакрученные спирали с шагом 0,96 нм и с 3,3 аминокислотными остатками на один виток спирали, угол подъема более пологий (рис. 3, б). В отличие от α-спиралей между аминокислотными остатками α-цепей коллагена нет водородных связей, и молекула имеет необычный состав – 1/3 содержания приходится на глицин, примерно 10 % на пролин, а также гидроксипролин и гидроксилизин. Такая структура позволяет трѐм α-цепям коллагена образовывать правозакрученную структуру тропоколлагена, стабилизированную поперечными сшивками (ковалентными связями, образованными между остатками лизина, гидроксилизина или гистидина). Молекулы тропоколлагена имеют высокую прочность при растяжении (больше чем у стальной проволоки такого же диаметра) и представляют сверхвторичную надмолекулярную структуру (являющуюся аналогом четвертичной). По мере старения организма между фибриллами коллагена появляется большее количество поперечных сшивок, что делает тропоколлаген хрупким. β-Складчатый слой – это плоские структуры, в которых полипептидная цепь стабилизирована внутри- и межмолекулярными водородными связями и имеет форму сложенного «гармошкой» листа (рис. 4, а). Если цепи ориентированы в одном направлении, то образуется параллельный β-складчатый слой, если в противоположных – то антипараллельный (рис. 4, б). Радикалы аминокислотных остатков ориентированы почти перпендикулярно плоскости β-слоя. β-Складчатый слой стабилизируется валином, изолейцином и фенилаланином, следовательно характер вторичной структуры зависит от аминокислотного состава сегмента первичной структуры. Примером белка, где преимущественно имеются β-слои является фиброин шелка, синтезируемый пауками и насекомыми. Этот полипептид содержит много остатков аланина и глутамата, что способствует плотной упаковке слоѐв и взаимному проникновению их радикальных групп. Кроме того, вся структура стабилизирована протяжѐнными водородными связями, по этой причине шѐлк не тянется и обладает высокой прочностью. 15 А Б Рис. 4. А. Структура β-складчатого слоя; Б. Строение антипараллельной и параллельной структуры β-складчатого слоя. Нерегулярные вторичные структуры или беспорядочные клубки – образуют специфическую для каждого белка конформацию, состоящую из петлеобразных и кольцеобразных структур. В молекуле белка, состоящего из ряда спиральных и складчатых участков, обязательно встречаются нерегулярные вторичные структуры. В их составе присутствет от 3 до 10-15 аминокислотных остатков. Их значение состоит в компактизации белковой молекулы и правильной организации третичной структуры. Третичная структура – способ укладки полипептида в трехмерном пространстве. Образуется за счет взаимодействия между радикалами аминокислот, которые могут находится в первичной структуре на любом расстоянии друг от друга. Функционально активную конформацию называют нативной структурой белка. Стабилизация третичной структуры обусловлена образованием ковалентых (дисульфидной, псевдопептидной, координационной и других), ионных и водородных связей, а также гидрофобных взаимодействий (рис. 5). По форме третичной структуры белки делятся на глобулярные (имеющие элипсовидную форму) и фибриллярные (нитевидные, вытянутые). При образовании глобулярных белков гидрофобная часть полипептидной цепи располагается внутри структуры, а гидрофильная – снаружи. 16 Рис. 5. Примеры взаимодействий, стабилизирующие третичную структуру белковой молекулы. Важным понятием при описании третичной структуры белков является домен. Домен – это часть молекулы протеина, которая стабильна вне зависимости от остальной цепи или может перемещатся относительно целого белка как самостоятельная единица. Они имеют самостоятельную третичную структуру, аналогичную глобулярным белкам (рис. 6). Так полипептиды, состоящие из нескольких сотен аминокислотных остатков, часто состоят из двух и более доменов, которые могут различаться по функциям. Отмечается, что домены крупных белков сохраняют свою нативную структуру даже при отделении от другой части белка. Рис. 6. Доменная структура мембранного белка и этапы формирования глобулы. 17 При формировании нативной структуры белка большинство молекул подвергается процессу модификации, путѐм ковалентного присоединения определѐнных групп к некоторым аминокислотным остаткам. Примерами таких процессов являются: ацилирование (присоединения остатка карбоновой или жирной кислоты), гликозилирование (присоединение глюкозы, других моносахаридов или олигосахаридных цепей), гидроксилирование (окисление пролина или лизина в гидроксипролин и гидроксилизин), фосфорилирование, метилирование и т.д. Четвертичная структура – пространственное взаиморасположение нескольких полипептидных цепей, объединѐнных слабыми (гидрофобными, водородными, электростатическими) взаимодействиями. В результате формируется единая функциональная молекула белка. Четвертичной структурой обладают протеины с молекулярной массой более 5 кДа. Отдельные полипептидные цепи в таких белках называются протомерами, а сами белки олигомерами (мультимерами). Субъединица олигомерного белка может состоять из одного или нескольких протомеров (рис. 7). Она способна выполнять часть функций белка только в составе олигомера. При разрушении связей между протомерами мультимер теряет функции. Рис. 7. Четвертичная структура гистонов, формирующих нуклеосомы с ДНК. Различные протомеры гистонов формируют октамерный кор (основу). При формировании четвертичной структуры строго соблюдается принцип комплементарности – пространственное и химическое соответствие поверхностей субъединиц. В процессе образования третичной структуры белка на его поверхности возникают уникальные контактные участки. Это позволяет сложным надмолекулярным структурам взаимодействовать с высокой специфичностью и исключать ошибки сборки и функционирования. |