МУ бт микр. лаб 2014. Методические указания к лабораторным работам по дисциплине биотехнология микроорганизмов для студентов специальности 5В070100 Биотехнология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени ШАКАРИМА г.СЕМЕЙ Кафедра «Стандартизация и биотехнология» МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ к лабораторным работам по дисциплине «БИОТЕХНОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ» для студентов специальности 5В070100 «Биотехнология» Семей 2014
Утверждено на заседании кафедры «Стандартизация и биотехнология», протокол № ___ от ____________ 2014 г. Заведующая кафедрой ______________Ж. Какимова СОДЕРЖАНИЕ
Лабораторная работа № 1 Тема: Приборы и аппараты лаборатории «Биотехнология микроорганизмов» Электронная микроскопия. Правила работы в лаборатории. Цель работы: Ознакомиться с приборами и аппаратами лаборатории «Биотехнология микроорганизмов». Изучить правила работы и техники безопасности в лаборатории. Задание: 1. Изучить конструкцию и принцип работы суховоздушного электрического термостата, автоклава. 2. Изучить принцип работы сушильного шкафа, центрифуги, рн-метра, рефрактометра. 3. Изучить требования к стеклянной посуде лаборатории. 4. Приготовить ватные пробки и петли для работы. 5. Изучить устройство и принцип работы электронного микроскопа. 6. Изучить правила работы и техники безопасности в лаборатории «Биотехнология микроорганизмов». 7. Законспектировать основные положения техники безопасности в тетрадь для лабораторных работ. Аппараты и приборы. Термостаты (воздушные — рис. 1) предназначены для выращивания микроорганизмов на питательных средах при постоянной заданной температуре. В лабораторий устанавливают несколько термостатов с разной температурой, благоприятной для развития отдельных групп микроорганизмов: мезофилов—28—30 °С, термофилов—43—55, патогенных видов —37 °С. Термостаты бывают различной формы, размеров и конструкций: от небольшого шкафчика до поли-. термостата с несколькими отделениями или отдельной термостатной комнаты. Автоклавы служат для стерилизации посуды, питательных сред и других материалов насыщенным паром под давлением выше атмосферного. Автоклавы бывают разных конструкций (вертикальные, горизонтальные), но принципиальная схема их устройства одинакова (рис. 2).   Сушильный шкаф (рис.3) с терморегулятором предназначен для сушки и стерилизации лабораторной посуды, для высушивания различных материалов до постоянной массы. Сушильный шкаф изготовляют из термостойких материалов (металла и асбеста) и рассчитывают на диапазон температур в рабочей камере от 40 до 200 °С. Длительность разогревания до предельной температуры около 1,5 ч. Внутри шкаф оборудован полками из дырчатых листов металла, на которых размещают посуду или высушиваемый материал. Холодильник используют для хранения при температуре около +4 °С музейных и рабочих культур микроорганизмов, питательных сред, некоторых реактивов и растворов. Центрифуга служит для разделения жидких и твердых фаз суспензий и взвесей. Центрифуга снабжена двумя роторами, которые попеременно насаживаются на вал электродвигателя: ротором-крестовиной с четырьмя стаканами и ротором углового типа с гнездами для стеклянных или полиэтиленовых пробирок. Скорость вращения роторов от 3000 до 6000 об/мин. Лабораторный рН-метр (марки рН-340) предназначен для измерения активности ионов водорода (рН) и окислительно-восстановительного потенциала (Eh). Рефрактометр используют для определения содержания сухих веществ, Сахаров, спиртов, аминокислот, витаминов, экстрактивных веществ. Шкала указывает показатель прелом- Фотоэлектроколориметр применяют для измерения оптической плотности и коэффициентов пропускания окрашенных и коллоидных растворов. Прибор снабжают набором узкополосных светофильтров в области спектра 315—630 нм. Колориметр-нефелометр позволяет оценивать по степени мутности растворов концентрацию клеток микроорганизмов.  3—5 мм и диаметром 33—140 мм, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой. С увеличением содержания целлюлозы пористость фильтра возрастает. Выпускаются фильтры марки Ф2 и, СФ (стерилизующие). Фильтры вставляются в воронку (рис. 4), как правило, из никелированного металла. Воронка состоит из двух частей: верхней цилиндрической и нижней конусообразной, между которыми на металлической сетке укладывают асбестовый фильтр. Затем воронку завинчивают или туго зажимают специальными винтами, а узкий тубус вставляют в резиновую пробку колбы Бунзена. Посуда. Для микробиологических исследований необходима различная стеклянная посуда. Чашки Петри {диаметр 10 см, высота 1,5 см) применяют для выделения чистых культур, количественного учета микроорганизмов, анализа микрофлоры на плотных питательных средах и других исследований; колбы Виноградского, плоские бутыли-матрацы, качалочные колбы для выращивания аэробных микроорганизмов, пробирки и колбы с поплавками (рис. 5)—для изучения процессов брожения. Кроме специальной микробиологической посуды широко используют обычную химическую посуду: колбы плоскодонные конические Эрленмейера, круглодонные, мерные (на 25, 50, 100, 200 мл); пипетки градуированные (на 1, 2, 5, 10 мл), пипетки Мора (на 1, 2, 5, 10, 20, 25, 50, 100 мл), пастеровские пипетки с оттянутым капилляром, пробирки биологические (без ранта) 18x2,0; 18X1,5; 15x1,5 см; бюретки, ка пельницы, воронки, мензурки, цилиндры, бюксы, склянки. Приготовление ватных пробок. Колбы и пробирки, используемые для приготовления и стерилизации питательных сред и выращивания культур микро организмов, закрывают ватными пробками (рис. 6). Пробки изготовляют вручную или при помощи специальной машины. Правильно изготовленная пробка должна иметь длину 3—4 см, умеренно туго входить в пробирку, быть плотно! и не менять своей формы при многократном применении. Ватная пробка лучше сохраняется, если ее обернуть кусочком марли, концы которой в верхней части плотно завязать ниткой.  Инвентарь. В микробиологической практике применяют петли, иглы, пинцеты, ножницы, сверла для пробок, металлические цилиндры для пипеток, проволочные или металлические с отверстиями корзины для стерилизации пробирок, пластмассовые или металлические штативы для пробирок и др. Петли и иглы изготовляют из платиновой, никелевой или хромоникелевой проволоки длиной 8 см, диаметром 0,4—0,5 мм и впаивают в стеклянные или металлические держатели. Свободный конец проволоки аккуратно загибают в виде петли с плотно прижатым концом (рис. 7), иначе жидкость в кольце не будет удерживаться. Электронная микроскопия. Разрешающая способность оптических микроскопов составляет 0,2 мкм и зависит от длины волн используемых лучей света. Увеличить разрешение в 100 и более раз можно, если вместо световых лучей с длиной волны 350-600 нм применить поток движущихся электронов. Высокая разрешающая способность современных электронных микроскопов (15-10-5А и даже 3 и 1,5 А) позволяет наблюдать и изучать объекты, невидимые в световом микроскопе: вирусы, фаги, микоплазмы, тонкое строение клеток прокариот и эукариот, их макро- и микроструктурные элементы, другие субмикроскопические органеллы. Электронный микроскоп состоит из нескольких сложных узлов: колонные, в которой находятся осветительная система (электронная пушка и конденсорная линза), камера объекта (предметный столик, объективная, промежуточная и проекционная линзы), экран, фотокамера; вакуумной системы; установки для электропитания, размещенной в металлическом шкафу за колонной; вспомогательных устройств (рис.1). Выпускаются электронные микроскопы нескольких систем и классов. В электронных микроскопах «просвечивающего типа» использована схема светового микроскопа, повернутая окуляром вниз, но все оптические элементы заменены электромагнитными линзами. Они создают электромагнитное поле, управляющее движением потока электронов. Применять стеклянные линзы нельзя, так как стекло непроницаемо для электронов. Источником электронов служит вольфрамовая нить диаметром 0,1 мм, потенциал которой равен 30-100 кВ. Воздух препятствует движению электронов, поэтому внутри микроскопа необходимо поддерживать вакуум. Вылетающий из электронной пушки поток электронов высокой энергии (60 кВ, длина волны равна 0,05 А) концентрируется конденсорной линзой и направляется на исследуемый объект. Пучок электронов пронизывает объект, рассеивается и фокусируется в электромагнитном преломляющем поле объективной линзы. Получается первое увеличенное действительное изображение объекта, которое можно наблюдать через специальное смотровое стекло. Затем поток электронов попадает в электромагнитное поле проекционной линзы (аналогичной линзе окуляра), которая увеличивает первое изображение и позволяет получить увеличение объекта в 40000-50000 Х. Конечное изображение, увеличенное еще в 5-6 раз, получают на флуоресцирующем экране или на фотопластинке, для чего под экраном монтируют фотокамеру. Общее увеличение может составить 200 000-300 000 и даже 1000000-2000000 Х. Препараты для электронной микроскопии должны быть прозрачными и прочными. Их готовят на специальных тончайших пленках – подложках из коллодия. Толщина пленок около 1 мкм. Для их получения пользуются 0,5-2%-ным раствором коллодия в амилацетате. Пленки осторожно укладывают на опорную металлическую сетку с очень мелкими ячейками (4-10 ячеек на 1 мм). Приготавливают препарат, тщательно промывают его дистиллированной водой от посторонних примесей (остатков среды, солей), сушат, напыляют металлом (хромом) или контрастируют фосфорно-вольфрамовой кислотой, уранилацетатом, уранилнитратом и др. Для изучения структуры клеток, выявления локализации вирусов после специальной обработки готовят очень тонкие срезы на специальных ультрамикротомах. Следовательно, в электронных микроскопах микроорганизмы исследуют не в живом состоянии, а в виде фиксированных препаратов. В световом микроскопе при работе с иммерсионной системой глубина фокуса составляет 0,25 мкм. Увеличить глубину фокуса более чем в 100 раз можно с помощью сканирующего электронного микроскопа. Он позволяет получать трехмерные (объемные) снимки поверхностной структуры объективов вместо двумерных (плоских) изображений, которые дают обычно световые и электронные просвечивающие микроскопы. Работа сканирующего микроскопа основана на принципе телевизионной развертки пучка электронов по поверхности исследуемого объекта. Это позволяет определить его пространственный рельеф. Хотя разрешающая способность сканирующего микроскопа ниже, чем у электронного просвечивающего микроскопа почти на целый порядок, качество изображения выигрывает за счет высокой глубины резкости и объемности изображения (рис. 2). |