Биохимия. Предмет биохимии
 Скачать 0.58 Mb.
|
|
Предмет биохимии. Химия-наука изучающая свойства материи и ее изменения. Можно выделить несколько перекрывающихся областей: органическую, неорганическую, физическую, коллоидную, аналитическую химию и другие. Биохимия, как это следует из ее названия, изучает химию живой природы во всех ее проявлениях: от животных до бактерий и вирусов. Биохимия отличается от органической химии рядом особенностей химических процессов, протекающих в клетке. В клетке химические реакции протекают с гораздо более высокими скоростями и при температуре равной 37 градусов по Цельсию. Одно и то же химическое соединение может претерпевать множество химических превращений в зависимости от физико-химических и физиологических условий, реализующихся в клетке. Такая множественность реакций делает необходимым существование регуляторных механизмов. И действительно, ферменты- обуславливающие особенности биохимических реакций, меняют свою активность от целого ряда факторов. На этом механизме мы остановимся позднее. От физиологии биохимия отличается тем, что изучает не функцию органа, ткани или клетки, а все многообразие химических процессов, которые и определяют выполнение этой функции . Поскольку структурной единицей живых систем является клетка, можно сказать, что биохимия изучает химические компоненты живых клеток, а также реакции и процессы, в которых они участвуют. Клетки делят на автотрофные(утилизируют углекислый газ как источник углерода)- -клетки растений, некоторые микроорганизмы. Гетеротрофные- не могут использовать углекислый газ как источник углерода -животные клетки, большая часть бактерий. Аэробные организмы(клетки)-используют для различных окислительных процессов кислород(живут только в кислородной среде). Анаэробные - существуют в условиях отсутствия кислорода. Факультативные клетки - могут использовать кислород и обходится без него. Упомянув здесь традиционные области химии, необходимо отметить, что биохимия в большей степени опирается на органическую химию, а также связана с неорганической, физической и аналитической химией. Фундаментом для биохимии является и физиология-наука, изучающая функции органов, тканей и клеток. Но если органическая химия и физиология развиваются более 200 лет, то биохимия наука сравнительно молодая и как наука началась около 100 лет назад. В развитии биохимии большую роль сыграли российские ученые: А.Л. Данилевский, И.П. Павлов, М.Е. Ненцкий, В.С. Гулевич, А.Н. Бах, А.В. Палладин и другие. Огромное значение для успешного развития биохимии сыграли работы зарубежных ученых: Уотсона, Крика, Эдмана, Сэнджера и многих других. Основные вехи в развитии биохимии: 1) Само понятие “биологическая химия” введено в середине 19 века В.Клетцинским. 2) Киркгофф еще в 1814 году впервые осуществил ферментативную биохимическую реакцию( расщиплял крахмал до глюкозы под действием препарата полученного из зерен ячменя. 3) Бюхнер в конце 19 века выделил из дрозжей ферментативный препарат.) 4) Данилевский в 1863 году организовал кафедру в Казанском университете, а затем в Санкт-Петербургской военно-медицинской академии. 5) В 1883 году было организовано общество биохимиков. 6) В 1921 году в Москве А.Н. Бах организовал первый биохимический институт. 7) Первые учебники по биохимии были переводные. Первый отечественный учебник написал в 1847 году профессор Харьковского университета Ходнев. Биохимия не просто теоретическая наука. Она имеет большее прикладное значение для биологии и медицины. Так, например, определение активности ферментов играет важную роль в развитии диагностики. Содержание определенных ферментов в сыворотке крови может служить ценным критерием при диагностике, например, перенесенного инфаркта миокарда, при дифференциальной диагностике различного рода желтух. Кроме того, биохимия создает основу для рационального назначения лекарственных препаратов. Биохимия позволяет вычислить молекулярные механизмы большого числа врожденных нарушений метаболизма. Быстрое развитие биохимии позволило исследователям приступить к изучению самых острых, коренных проблем биологии и медицины: рост и дифференциация клеток, механизм памяти, возникновение нервного импульса и т.д. ХИМИЯ БЕЛКОВ. Значение белков. Ткани организма в своем составе содержат большое количество макромолекул. Белки количественно преобладают над всеми другими макромолекулами и составляют более половины сухого веса большинства организмов. Не случайно белки называют протеины, что в переводе с греческого означает “первые” или “главные”. В организме человека насчитывается около 5000000 различных белков. Точное строение и структура известны примерно для 1000 белков. Первые сведения о белках появились в конце 19 века, когда были выделены из клеток сложные азотсодержащие соединения. Тогда же выявилось, что белки состоят из аминокислот. Гликокол открыли в 1820 году, а к концу 19 века открыли почти все аминокислоты. Белки – высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот. Как уже упоминалось, в организме почти половину сухого остатка составляют белки, на сырую массу приходится- 10-20%. Однако различные органы и ткани содержат разное количество белка. Так, мышцы, легкие, почки, селезенка содержат 70-80% от сухой массы, жировая ткань –14-15%, кости, зубы-18-20%белка от сухой массы. Такая разница в содержании белка в различных тканях и органах обусловлена многообразием функций, выполняемых белками. Согласно выполняемым функциям, выделяют следующие группы белков: 1) каталитические белки - ферменты, ускоряющие и регулирующие реакции. 2) структурные белки - не обладая динамическими функциями, они играют роль матрицы для различных частей организма, например, коллаген, входящий в состав соединительных тканей(составляет 1/3 общего белка организма). 3) сократительные белки – молекулы этих белков способны плотно сжимать и расслаблять свою структуру, например, актин и миозин в мышцах. 4)защитные белки – например, антитела из гамма-глобулиновой фракции крови, интерфероны – белки, участвующие в защите от вирусных инфекций. 5) белки, участвующие в пищеварение – различные ферменты, например, трипсин, выделяемые в процессе желудочно-кишечной секреции, они катализируют расщепление пищевых продуктов на менее сложные соединения. 6) транспортные белки – среди них можно назвать прежде всего гемоглобин- переносчик кислорода и углекислого газа в крови, другие белки-переносчики обнаружены в клеточной мембране и участвуют в переносе соединений через мембрану. 7) белки крови – например, фибриноген, участвует в процессе свертывания крови. 8) белковые гормоны – белки, подобные инсулину, регулируют клеточную активность. 9) белки, связанные с ДНК(РНК) – регулирующие наследственные процессы. 10) дыхательные белки – например, цитохромы, участвующие в переносе электронов к соответствующим акцепторам, у аэробов – к кислороду. 11) белки – рецепторы – содержаться в мембране, способны передавать информацию внутрь клетки, после связывания с определенными соединениями на внешней поверхности клетки. Элементарный и аминокислотный состав белка. В состав белка входят 5 основных элементов: 1) углерод-52-55% 2) кислород-21-23% 3) азот-15-17% (16% )-эту цифру используют при количественном определение белка 4) водород-7-8% 5) сера-0,5-2,5% В составе некоторых белков в небольших количествах встречаются и другие элементы: фосфор, железо, марганец, магний, медь, йод и другие. Все белки состоят из 20 различных альфа-аминокислот. Общая формула этих аминокислот: R-CH-COOH | NH2 Как видно из общей формулы все альфа-аминокислоты, участвующие в построении белка, отличаются друг от друга только химической природой радикала – R. Все эти аминокислоты изучались в курсе биоорганической химии. При подготовке к практическим занятиям необходимо повторить связи: выделяют прочные ковалентные связи (это пептидная, дисульфидная) и менее прочные – нековалентные ( ионная, водородная, гидрофобная). Типы связей в белковых молекулах. В молекулах белка аминокислоты связаны между собой пептидными связями R R1 R R1 | | HOH | |  CH – COOH + CH – COOH CH – CO – NH – CH - COOH | | | пептидная NH2 NH2 NH2 связь  Таким образом образуются пептиды (в данном случае – дипептид). Присоединение следующей аминокислоты происходит к свободной карбоксильной группе с образованием новой пептидной связи. При соединении большого числа (обычно более ста) аминокислот путем образования пептидных связей , формируется полипептидная цепь , а каждая аминокислота в этой цепи называется аминокислотным остатком. Полипептидная цепь имеет определенное направление. Принято считать, что они начинаются с N – конца, то-есть конца несущего свободную аминогруппу и заканчивается С – концом, где есть свободная карбоксильная группа. Необходимо отметить некоторое своеобразие пептидной связи. Так атомы углерода и азота, образующие пептидную связь, находятся примерно в одной плоскости, а атомы водорода и радикалы направлены к этой плоскости под углом 109 градусов 28минут . O || -C –N – | H Кислород и водород находятся в транс положении. Вот так выглядит пептидная связь. Вращение вокруг пептидной связи ограничено. Кроме того, расстояние между атомами углерода и водорода в пептидной связи равно 0,132 нанометра, втовремя как одинарная связь H3С – NH2 длину 0,147 нанометров, а в двойной связи = С = N – это расстояние равно 0,125 нанометров. Это создает предпосылки для осуществления таутомерных (лактам-лактимных) превращений, что повышает реакционную способность полипептидной цепи. Н2N – CH – C – NH – CH – COOH Н2N– CH – C = N – CH - COOH | || | | | | R1 O R2 R1 OH R2 Разорвать связь можно кипячением с кислотой или щелочью, или под действием ферментов. Пептидная связь участвует в формировании первичной структуры белка. 2) Второй вид связи – дисульфидная – эта связь образуется за счет двух атомов серы - S – S - . Эту связь могут дать только серосодержащие аминокислоты. За счет дисульфидной связи связываются две или более полипептидных цепи или образуются циклические структуры.   --|----------|-----  SH SH S S ( образуется циклическая структура) | | |-S-S-| сшиваются две цепи, например у инсулина | | Дисульфидная связь участвует в формировании третичной и четвертичной структуры.  3) Водородная связь – это связь водорода с электроотрицательными группировками. Она слабая (в десять раз слабее ковалентной), но если этих связей много, то они сильно влияют на пространственную конфигурацию белковых молекул. Водородные связи возникают между соседними изгибами цепи, притягивая их друг к другу и предавая повторяемую периодичность цепи. С Они определяют вторичную, третичную, четвертичную | Структуры. Разрушаются при денатурации. O | | H | N 4)Ионные связи – образуются между заряженными частями белка, определяет общую пространственную конфигурацию. ------|----------------|--------- NH2 COOH (аргинин, (глутаминовая кислота, лизин) аспарагиновая кислота) 5)Гидрофобные связи – образуются неполярными радикалами в полярных растворителях. При этом отсутствует взаимодействие с водой. Гидрофобные группировки в водной среде объединяются в единые центры (энергетически очень выгодно, этим определяется энтропия). При формировании структуры белковых молекул гидрофобные связи играют очень большую роль.   ---|-------|-------|-- R1 R2 R3 R R- R | Определяют третичную и четвертичную структуру. Разрушаются при денатурации белков. Помимо белков, высокой биологической активностью обладают и низкомолекулярные пептиды, которые как и белки так же состоят из аминокислот. Природные пептиды и зависимости от характера действия и происхождения принято делить на 4 группы: 1) Пептиды, обладающие гормональной активностью (вазопресин, окситоцин, адренокортикотропный гормон, меланоцитстимулирующий гормон, глюкагон,кальцитонин, меланоцитостимулирующий гормон и другие). Подробнее о них будет говориться в соответствующих разделах биохимии. 2) Пептиды, принимающие участие в пищеварении (гастрин, секретин). Эти гормоны синтезируются в желудке и стимулируют секрецию соляной кислоты и выделение воды и солей в поджелудочной железе. 3) Пептиды, имеющие своим источником альфа-2-глобулиновую фракцию сыворотки крови (ангиотензин – регулирует кровеносное давление, брадикинин – мощное сосудорасширяющее средство, ренин – активирует ангиотензин). 4) Нейропептиды – оказывают большое влияние на передачу нервных импульсов(энкефалины) Очень важное значение имеет трипептид глютатион. Он участвует в транспорте аминокислот через клеточные мембраны. Поддерживает восстановленное состояние железа(+2) в гемоглобине. Сохраняет интактными –SН- группы многих белков мембраны, предохраняя их от окисления. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. Они определяются структурой белка. Белки – высокомолекулярные соединения, их молекулярная масса колеблется (в зависимости от вида белка) от нескольких тысяч до нескольких миллионов дальтон. Принято считать белками такой полипептид, молекулярная масса которого превышает 5000 дальтон и при этом он несет ту или иную биологическую функцию. Например, молекулярная масса инсулина составляет около 6000 дальтон, гемоглобина – 68000 дальтон, каталазы около 250000 дальтон, миозин – 500000, белки вируса табачной палочки – до 1000000 дальтон. Определение молекулярной массы белков проводят, используя различные методы. Рассмотрим некоторые из них: 1) Аналитическое ультрацентрифугирование – относится к седиментационным методам (от слова седиментация – осаждение под действием гравитационных сил). Принцип метода: на поверхность буферного раствора, помещенного в кювету, наносят тонкий слой белка и кювету помещают в ротор центрифуги. Вращение ротора происходит со скоростью от 100000 до 500000 оборотов в минуту. При этом молекулы белка как более плотные начинают перемещаться в направлении от оси вращения. Это регистрируется специальным оптической системой по показателю преломления, который выше в зоне белка. На основании результатов вычисляют коэффициент седиментации(S). dx 1 S= ---- * ---------- dt W2Х Где dx/dt – Скорость седимнетации W – угловая скорость, выраженная в рад/сек. X – расстояние от оси вращения до зоны белка. За единицу коэффициента седиментации условно принята величина десять в минус тринадцатой степени секунд, называется сведбергом и обозначается S* Получаются величины (для белка) в диапозоне от 1 до 200 сведберг. 2) Метод ионообменной хроматографии. Стеклянную колонку заполняют смолой, несущей группировки SO3HNa. Известно, что в кислой среде белки заряжаются положительно и способны вытеснять часть ионов Na, занимая их место. Затем через колонку пропускают элюент( жидкость, способную разрывать связь белка с анионом SO3H). Поскольку прочность связи с SO3H у разных белков различна, они выходят из колонки поочередно. Поэтому их легко выделить и определить их количество и молекулярную массу. 3) Метод гель-фильтрации. Колонку заполняют декстраном ( например, сефадексом), имеющим поры. При этом молекулы, имеющие большие размеры, или совсем не проникают, или проникают только в часть пор и вымываются из колонки раньше, чем мелкие молекулы. Таким образом можно разделить смесь белков и измерить их молекулярную массу. 4) Электронная микроскопия. В настоящее время электронная микроскопия дает разрешение в 20 ангстрем, что позволяет видеть белки. Подсчитывая число белковых глобул, можно получить приблизительную величину молекулярного веса. Для этого достаточно знать концентрацию белка в растворе и объем, который наблюдается в микроскоп. 5) Метод рентгеноструктурного анализа. 6) Метод электрофореза. 7) Физические методы всегда дают приближенные результаты, поэтому их лучше дополнять данными, полученными с помощью химических методов, основанных на определении концентрации вещества. Размеры белковых молекул зависят от ряда факторов (число аминокислотных остатков в полипептидной цепи, молекулярный вес белка, наконец, его форма) и колеблется от 0,001 до 0,1 мкм , то-есть в принципе, соизмеримы с коллоидными частицами, и, соответственно обладают некоторыми свойствами, близкими к свойствами коллоидных растворов: 1)низкая скорость диффузии белков в растворах (при этом глобулярные белки более подвижны чем фибриллярные). 2)Высокая вязкость (увеличение вязкости белков плазмы крови создает дополнительную нагрузку на миокард). Вязкость белковых растворов связана с большой молекулярной массой, связями в белковых молекулах, и наличием гидратной оболочки. 3)Белки неспособны проходить через полупроницаемую мембрану. В участках с высокой концентрацией белка создается избыточное гидростатическое давление. Притягивая воду, белки создают онкотическое давление. Это очень важный фактор для перераспределения воды между сосудистым руслом и тканями. Изменение ( уменьшение) онкотического давления может привести к отекам, а увеличение может привести к увеличению объема циркулирующей крови. 4)Некоторые белки (особенно фибриллярные) способны к гемообразованию (например, коллаген – это повышает его прочность). По форме белковые молекулы делятся на фибриллярные и глобулярные. Фибриллярные белки – это устойчивые, как правило нерастворимые в воде и в разбавленных солевых растворах вещества. Располагаясь параллельно друг другу вдоль одной оси, полипептидные цепи образуют длинные волокна – фибриллы. Это основные структурные элементы соединительной ткани (коллаген, кератин, эластин). У глобулярных белков полипептидные цепи плотно свернуты в компактные сферические структуры. Большинство этих белков растворимы в воде и слабых солевых растворах. Это почти все ферменты, антитела, альбумины, гемоглобин. Некоторые белки принадлежат к промежуточному типу. Подобно фибриллярным, они состоят из длинных палочковидных структур, в тоже время они, как и глобулярные, растворимы в водных солевых растворах. Это миозин, фибриноген. Белки обладают и свойствами истинных растворов. Растворимость. Большинство белков растворимы в воде и водных солевых растворах, образуя растворы высокомолекулярных соединений (истинные растворы), по своим свойствам напоминающие коллоидные, так-как размеры белковых молекул сопостовимы с размерами коллоидных частиц. Растворы белков устойчивы. Растворимость белка тем выше, чем больше гидрофильных групп на его поверхности . На растворимость белков влияет добавление солей: так альбумины хорошо растворимы в воде, глобулины растворяются в присутствии 5-10% KCl или NaCl. Присутствие соли уменьшает(ослабляет) внутренние ионные связи. Факторы стабилизации белковых растворов: 1) Наличие заряда. 2) Высокая степень гидротации. Наличие заряда обусловлено способностью к ионизации гидрофильных группировок аминокислот, входящих в состав белка. Это группы –СООН, -ОН, -SH, -NH2 и т.д. Основной фактор ионизации – величина pH среды. Чем щелочнее среда, тем больший отрицательный заряд приобретает белковая молекула. Это можно изобразить схемотично:  Белок Белок -СООН щелочная среда -СОО -  -ОН -О - -SH >pH -S - и наоборот, чем кислее среда, тем больше положительный заряд:  белок Белок -NH2 кислая среда -NH3+ -NH2 -NH3+ В большей степени ионизации подвергают группы –СООН и –NH2, в меньшей –ОН и –SH –группы. То значение рН, при котором группы -СООН или –NH2 ионизированы на 50%, называется показатель ионизации(Рк). Для карбоксильных групп Рк=2-4, для аминогрупп 10-12. Появление заряда на белковой молекуле приводит к образованию ионных связей. Способность к ионизации обуславливает буферное свойство белков( (при защелачивании среды белки могут являтся донорами протонов – в основном за счет карбоксильных групп, при закислении среды белки являются акцепторами протонов, при этом Н+ присоединяется к аминогруппам). В щелочной среде белок ведет себя как анион, и если раствор такого белка поместить в постоянное электрическое поле, то он мигрирует по направлению к аноду. Напротив, в кислой среде белок ведет себя как катион и в постоянном электрическом поле двигается по направлению к катоду. Эти свойства белков использовал Тизелиус, который в 1937 году предложил новый метод разделения сложных белковых смесей – электрофорез. В медицине явление электрофореза широко используется. Он применяется для разделения белков в сыворотке крови на фракции, для введения лекарственных веществ и т.д. При определенном значении рН среды количество положительных и отрицательных зарядов становится равным(т.е. суммарный заряд молекул белка равен 0). Такое состояние белка называется изоэлектрическим. Значение рН, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой и обозначается Pi. Изоэлектрическая точка белков варьирует между значениями рН от 1 (для пепсина)до 10 (для гистонов).Для большинства белков изоэлектрическая точка лежит в более узких пределах: от 4 до 7. Снять заряд можно добавлением электролита или приближением рН к Pi (т.е., по сути, подкислением раствора). Гидратация объясняется полярными взаимодействиями гидрофильных групп белков (-COOH,-OH,-SH,-NH2) с диполями воды, при этом вокруг молекулы белка образуется «водная шуба», которые препятствует взаимодействию молекул белка между собой. Гидратацию можно уменьшить, изменяя конформацию белка (то-есть нарушая третичную структуру) – убирая гидрофильнуые группы внутрь белковой молекулы или добавляя вещества, жадно поглощающие воду (спирт, соли серной кислоты). Таким образом, для осаждения белка необходимо снять заряд и убрать гидратную оболочку. Вязкость растворов белка во многом определяет его оптические свойства. Оптические свойства. Оптические свойства белков определяются размерами белковых молекул, аминокислотным составом наличием пептидных связей, степенью спирализации и так далее. 1)Для белковых растворов характерна рефракция (преломление света). Если через раствор белка пропустить свет, то луч света отклоняется. Причем величина отклонения прямо пропорциональна концентрации белка в растворе. 2) Растворы белков способны вращать плоскость поляризованного света. Это обусловлено тем, что аминокислоты, из которых состоит белок, содержит ассиметричный атом углерода (то-есть все связи у этого атома заняты разными группами), например это альфа-углеродный атом. При этом возможны разные оптические изомеры (L,D). Все природные аминокислоты является L-производными. При хранении останков животных L-изомеры постепенно переходят в D-изомеры. Это свойство используют в экспертизе по определении времени сохранности останков. Как правило, растворы белка вращают плоскость поляризации влево, так как большинство аминокислот левовращающие. 3) Белковые растворы рассеивают свет. Это явление обусловлено тем, что размеры белковых молекул соизмеримы с длинной волны света как маленькие зеркала, повернутые во все стороны, куда они и рассеивают падающий свет. 4) Растворы белков поглощают свет (в ультрафиолетовой части спектра) в диапазоне 250 –300 нанометров. Также поглощение идет в диапазоне 210 - 230 нанометров. Поглощение в диапазоне 250 - 300 связано с наличием в составе белковых молекул ароматических (циклических) аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана) . Поглощение же света в диапазоне 210 – 230 нанометров определяется наличием пептидных связей. Белковые растворы обладают дихроизмом, то-есть красные лучи (как более длинные) проходят через белки, а голубые (короткие) – рассеиваются.Все оптические свойства имеют практические значение. На использовании этих свойств основана работа соответствующих приборов, позволяющих определять концентрацию белка в растворах. |