1 Цитология ее цели и задачи. Этапы развития цитологии
 Скачать 167.31 Kb.
|
|
1) Цитология - ее цели и задачи. Этапы развития цитологии. Задачи цитологии - цитология изучает: - субмикроскопические структуры, их функции, взаимодействия - способы проникновения веществ в клетку, их выведение - роли мембран в реакциях - реакции клеток на нервные и гуморальные стимулы - взаимодействие клеток - реакции на повреждение, репродукции В зависимости от объектов и методов цитология включает в себя: кариосистематику, цитоэкологию, радиоцитологию, онкологию, иммуноцитологию, цитогенетику. В развитии цитологии выделяют три этапа: 1) XVII – конец XIX в. Период накопления фактов клеточного строения. 1665 год.Р. Гук вводит термин «клетка». 1672 год. Грю, Мальпиги на различных объектах повторяют опыты Гука. В конце XVII века цитология начала становиться. Антон ван Левенгук сконструировал примитивный микроскоп, дававший увеличение в 40 раз. Открыл в 1674 году эритроциты в клетках крови земноводных. 1675 год – одноклеточные растительные организмы. 1683 год – описал бактерии. «Пустота или воздушное пространство в оболочке» - первое определение клетки. Во второй половине XVII века Левенгук подарил Петру I два микроскопа. Тот заинтересовался и в 1698 году собрал русских мастеров для конструирования своего микроскопа. Род Беляевых создавал стекла для микроскопа. В результате исследований в начале XIX века ряда ученых (Линк, Мондельхавер, Ламарк, Нербель, Курпена, Расспая, Пуркинье) утвердился взгляд на клетки как структурные единицы живого организма. В 1838 году ботаник Шлейден и зоолог Шванн в 1839 году сформулировали первую клеточную теорию. Благодаря этой теории сформулировалось представление, что функции организма в целом слагаются из активностей и взаимодействия отдельных клеточных единиц. В 1855 - 1858 году немец Вихров, патологоанатом, применил клеточную теорию на своих объектах и доказал, что каждая клетка образуется в результате деления исходной клетки, а организмы образуются в результате слияния двух клеток, мужской и женской. 1831 Блоуд открыл ядро, описал его как важнейший и обязательный органоид клетки. Была изучена протоплазма клетки, и первоначальное понятие о клетке превратилось в представление о массе протоплазмы, ограниченной в пространстве клеточной оболочкой и содержащей ядро. 1850 – масляный имерсионный объектив (позже водный). Конденсор – многолинзовая система, которая улавливает и направляет лучи света на объект. 1873 год – линза-конденсор, собирающая и направляющая линза микроскопа. Были открыты органоиды: 1876 год – клеточный центр (Эдуард ванн Бенеден, Бовери); 1898 – митохондрии (Бенда и Альтман в животной клетке, Мевес – в растительной клетке); 1898 – аппарат Гольджи, открыл Камилло Гольджи. Были открыты явления: Прямое деление бактерий; Амитоз, прямое деление клетки (Ремак); Митоз, непрямое деление (Флеминг; Страсбургер); Описаны главные особенности митоза – формирования хромосом (1890, Вальдейер). Создана теория индивидуальности хромосом. Гертвиг опубликовал монографию «Клетка и ткани» (1892).В ней были обобщены все биологические деления, исходя из характерных свойств, строения и функций клетки. Монография подвела черту первому этапу развития цитологии. 2) Конец XIX века – 20-е годы XX века. Дальнейшее совершенствование техники. Кроме светлопольного конденсора был предложен темнопольный конденсор. С помощью этого прибора можно было исследовать объекты при боковом освещении. Эффект Тиндаля – видим пылинки в луче света. Был также сконструирован поляризационный микроскоп, который позволял определять ориентацию частиц в клетке. 1903 год – сконструирован ультрафиолетовый микроскоп. 1932 год – фазово-контрастный микроскоп (позволил преобразовать фазовые сдвиги в амплитудные, что позволило смотреть бесцветные структуры) и интерференционный микроскоп. Метод выявления ДНК. Фельгин, Россенбек 1924 год Создаются микроманипуляторы, с помощью которых можно было производить разнообразные операции. В 1909 году Гаррисон положил начало создания метода культуры ткани. 3) В первые два десятилетия 20-го века все усилия были направлены на выяснения функций клеточных структур. Но это стало возможным только тогда, когда в 20-х годах сконструировали электронный микроскоп и появились методы рентгеноскопного анализа. Создания этого микроскопа открыло третий этап в развитии цитологии – современный. Использование электронного микроскопа привело к созданию субмикроскопической морфологии клетки. Разрешающая способность микроскопа – наименьший диаметр видимых частиц. Разрешение микроскопов: Световой микроскоп – не менее 0,2мкм. Электронный – 0,2 нм Были обнаружены неизвестные детали строений клетки. Изучено строение плазматической мембраны. Изучено строение сети мембран – ЭПР.Были изучены лизосомы (гидролитические ферменты), пероксисомы, содержащие фермент каталазу и уринокиназу. Изучено строение рибосом. Открыт цитоскелет (микротрубочки, микрофиламенты, промежуточные филаменты). Сформулировались первые задачи цитологии: 1) изучить ультромикро структуры клетки 2) изучить функции клеточных структур и их взаимодействие; 3) изучить способы проникновения веществ в клетку, выведения их из клетки, роли мембран; 4) реакция клеток на нервные и гуморальные стимулы как окружающей среды, так и внутри; 5) Изучить взаимодействие клеток; 6) Изучить реакцию на повреждения, репродукцию клеток и клеточных структур и апоптоз (запрограммированная гибель клеток). 2) Развитие современной цитологии. Выявление ультрамикроскопических особенностей, присущих специализированным клеткам. В первые два десятилетия 20-го века все усилия были направлены на выяснения функций клеточных структур. Но это стало возможным только тогда, когда в 20-х годах сконструировали электронный микроскоп и появились методы рентгеноскопного анализа. Создания этого микроскопа открыло третий этап в развитии цитологии – современный. В середине 20 в. цитология вступила в современный этап своего развития. Разработка новых методов исследования и успехи смежных дисциплин дали толчок бурному развитию науки. Использование электронного микроскопа привело к созданию субмикроскопической морфологии клетки и приблизило визуальное изучение клеточных структур к макромолекулярному уровню. Были обнаружены неизвестные до этого детали строения ранее открытых клеточных органоидов и ядерных структур; открыты новые ультрамикроскопические компоненты клетки: плазматическая, или клеточная, мембрана, отграничивающая клетку от окружающей среды, эндоплазматический ретикулум (сеть), рибосомы (осуществляющие синтез белка), лизосомы (содержащие гидролитические ферменты), пероксисомы (содержащие ферменты каталазу и уриказу), микротрубочки и микрофиламенты (играющие роль в поддержании формы и в обеспечении подвижности клеточных структур); в растительных клетках обнаружены диктиосомы — элементы комплекса Гольджи. Наряду с общеклеточными структурами выявляются ультрамикроскопические элементы и особенности, присущие специализированным клеткам. С помощью электронной микроскопии показано особое значение мембранных структур в построении различных компонентов клетки. Субмикроскопические исследования дали возможность все известные клетки (и соответственно все организмы) разделить на 2 группы: эукариоты (тканевые клетки всех многоклеточных организмов и одноклеточные животные и растения) и прокариоты (бактерии, сине-зелёные водоросли, актиномицеты и риккетсии). Прокариоты — примитивные клетки — отличаются от эукариотов отсутствием типичного ядра, лишены ядрышка, ядерной оболочки, типичных хромосом, митохондрий, комплекса Гольджи. 3) Современные положения клеточной теории. 1) Клетка - основная единица строения и развития всех живых организмов, наименьшая единица живого. 2) Клетки всех одно- и многоклеточных организмов сходны по строению, химическому составу, основным проявлениям жизнедеятельности и обмену веществ. 3) Размножение клеток происходит путем их деления. Каждая новая клетка образуются в результате деления исходной клетки. 4) В сложных многоклеточных организмах клетки специализированны и образуют ткани. Из тканей состоят органы, которые тесно связаны между собой и подчинены нервным и гуморальным механизмам регуляции. 5) Клетки многоклеточных организмов тотипотентны (обладают генетическим потенциалом всех клеток данного организма). Клетка - ограниченная активной мембраной, упорядоченная структурированная система биополимеров (белков, липидов, улеводов, нуклеиновых кислот), участвующих в единой совокупности метаболических и энергетических процессов, осуществляющих поддерживание и воспроизведение всей системы в целом. Клетка - открытая саморегулирующаяся физическая система с гомеостазом 4) Методы цитологических исследований. Световая микроскопия - основной метод наблюдения клеток. Методы цитологического исследования: 1) Непосредственное наблюдение живых клеток в организме (витальный) или в свежевыделенной ткани (суправитальный). 2) Наблюдение клеток убитых с помощью фиксации, которая сохраняет морфологическую и химическую структуру. После фиксации любой материал подвергают окрашиванию. Красители – натуральные и синтетические. Синтетические – кислые и основные. Основные - соли красящих оснований, содержащие аминогруппы, монометиламиногруппы, иминогруппы. Эти группы определяют щелочность красителей. Попадая внутрь клетки, эти группы образуют солевые связи с кислотами, находящимися в структуре клетки, что приводит к их окрашиванию. Кислотные группы клетки - базофильные. Кислые красители – красящие кислоты или их соли (эозин, пикриновая кислота, азокармин и др.). Кислотные свойства придают нитрогруппы, гидроксильные, карбоксильные группы. Структурные компоненты – ацитофильные или оксифильные. Широкое распространение получило гистохимическое или цитохимическое окрашивание, которое подразделяется на прямое или косвенное. К прямым методам относят приемы, специфичные для вещества, которые хотят определить. Выявление ДНК – с реактивом Шиффа. Чтобы обнаружить активность фермента, используют непрямой гистохимический способ или метод ферментативного переваривания. Для этой цели клетки помещают в среду, содержащую субстрат для данной ферментативной реакции и реагенты, связывающие специфически с конечными продуктами реакций. Краситель Азур связывает и окрашивает цитоплазму, ядро и ядрышко. Предварительная обработка клетки ферментом РНК-азой приводит к тому, что цитоплазма и ядрышко будет окрашиваться слабо, а ядро не изменит в своей окраске. Если же клетку предварительно обработать ДНК-азой, то почти полностью исчезнет окрашивание структур ядра. На современном этапе особое значение имеют точные способы выявления структур – иммунохимические методы. Это реакции с использованием флуоресцентных антител. Для этого на белок, который хотят определить, получают специфическую сыворотку. В сыворотке содержатся антитела, их соединяют с красителями флуоресцентными. Затем, меченый белок вводят в клетку. Таким образом был открыт цитоскелет. Метод фракционирования или дифференциального замещения. Сначала получают чистые клетки, разрушая ткань в гомогенизаторах. Полученную суспензию (гомогенат) подвергают высокоскоростному центрифугированию. Крупные компоненты (ядра или неразрушенные мембранные структуры) оседают при низких скоростях 1-3 тыс.J. При более высоких скоростях (15-30 тыс.) оседают более мелкие макросомы (митохондрии, пластиды, лизосомы, нервные окончания). Более 50 тыс. – микросомы. 15-20% от общей массы. Имеют сложный химический состав. ЭПР, вакуоли. 150 тыс. – в осадок выпадают рибосомы, вирусы, крупные макромолекулы. С помощью раствора сахарозы получают более высокую степень разделения. Плотность раствора постепенно увеличивается сверху вниз, образуя градиент плотности. Гомогенат клеток наслаивают поверх сахарозы, затем центрифугируют и органоиды клетки распределяются в зависимости от своей молекулярной массы по высоте градиента, образуя отдельные полосы, которые можно выделить и изучить. 5) Дифференциальное центрифугирование - метод получения отдельных клеточных компонентов для цитохимического и биохимического анализа. Для того чтобы изучить состав и функции тех или иных клеток, применяют метод дифференциального центрифугирования. Он основан на том, что различные клеточные органеллы и включения имеют различную плотность. При очень быстром вращении в специальном приборе - ультрацентрифуге - органеллы тонко измельченных клеток выпадают в осадок из раствора, располагаясь слоями в соответствии со своей плотностью: более плотные компоненты осаждаются при более низких скоростях центрифугирования, а менее плотные - при более высоких скоростях. Эти слои разделяют и изучают отдельно. Центрифугирование позволяет получить различные фракции субклеточных частиц и исследовать свойства и функции каждой фракции в отдельности. Например, из листьев шпината можно выделить хлоропласты, отмыть их с помощью повторного центрифугирования в соответствующей среде от клеточных фрагментов и исследовать их поведение в различных экспериментальных условиях или же определить их химический состав. Далее можно, применяя различные модификации методики, разрушить эти пластиды и выделить посредством дифференциального центрифугирования (повторного осаждения частиц при различных величинах ускорения) составляющие их элементы. Таким путем удалось показать, что пластиды содержат структуры, отличающиеся очень упорядоченным строением, — так называемые граны; все граны находятся внутри ограничивающей хлоропласт мембраны (оболочка хлоропласта). Достоинства этого метода просто неоценимы, поскольку он позволяет выявить существование функциональных субъединиц, входящих в состав более крупных субклеточных частиц; в частности, используя методдифференциального центрифугирования, удалось показать, что граны являются основным структурным элементом хлоропласта. Применение метода дифференциального центрифугирования сопряжено со многими методическими трудностями. Вопервых, при выделении частиц можно повредить их структуру. Поэтому потребовалось разработать специальные методы разрушения клеток, которые бы не вызывали повреждения структуры субклеточных фракций. Вовторых, поскольку субклеточные частицы обладают мембранами, в процессе их выделения могут возникать разнообразные осмотические эффекты. Следовательно, для того чтобы ультраструктура исследуемых объектов не была разрушена еще при их выделении, необходимо тщательно подбирать состав среды, в которой производится разрушение клеток и осаждение частиц. И наконец, отмывание субклеточных частиц (ресуспендирование их в среде и последующее повторное центрифугирование) может приводить к потере некоторых содержащихся в них веществ, которые под действием сил диффузии переходят в раствор. В связи с этим иногда бывает трудно понять, какие из малых молекул действительно являются элементами исследуемых структур, а какие просто были адсорбированы их поверхностью в процессе выделения. Такое положение затрудняет точное определение некоторых функциональных свойств выделенных объектов. С другой стороны, поскольку результаты исследований оставались неизменными при очень широком диапазоне условий выделения и хорошо коррелировали с данными, полученными иными методами, мы можем сделать общий вывод о том, что большая часть метаболических функций в клетке тесно связана с определенными структурными элементами, которые мы называем субклеточными частицами. Поскольку всегда остаются некоторые сомнения в отношении истинной биологической функции исследуемых субклеточных фракций, весьма желательно располагать методами, которые бы позволили определять функциональные свойства частиц, не выделяя их из клетки. Частично эта задача решается благодаря использованию цитохимического метода анализа. Общие принципы данного метода восходят к старым микроскопическим методам изучения препаратов, окрашенных специальными красителями. В общем задача состоит в том, чтобы подыскать специфическую цветную реакцию, которая выявляла бы интересующие нас соединения, конечные продукты обмена или последовательности химических реакций. Например, присутствие щелочной фосфатазы в клетках можно выявить, инкубируя срезы ткани или суспензии клеток в растворе фосфорного эфира анафтола. Под действием фосфатазы происходит гидролиз эфирных связей этого соединения и выделение анафтола, который в свою очередь в присутствии соли диазония немедленно вступает с ней в реакцию, образуя окрашенное соединение, отчетливо наблюдаемое под световым микроскопом. Если все вещества, необходимые для проведения реакции, присутствуют в клетке, то образующееся в конце концов сильно окрашенное соединение будет осаждаться в тех ее участках, где наблюдается активность этого фермента. Таким образом, локализацию щелочной фосфатазы в клетке можно выявить визуально. Одним из преимуществ такого метода является то обстоятельство, что высокая специфичность окрашивания обусловлена специфичностью фермента, расщепляющего связи соединения, химическое строение которого подобно строению веществ, присутствующих в клетке в естественных условиях, а не наличием молекул анафтола. Следовательно, для выявления в клетке других ферментов могут быть использованы соединения, являющиеся какими-либо иными производными анафтола. В частности, по существу аналогичная методика применяется для выявления эстераз и липаз. 6) Клетки прокариот и эукариот. Особенности и различия в их строении. Прокариоты (доядерные) - бактерии и сине-зеленые водоросли. Появились прокариоты примерно 4 или 3,5 млрд. лет назад в результате спонтанной агрегации органических молекул. Это наиболее простые по строению организмы. Форма бактерий сферическая или удлиненная. Размер в несколько микрометров. У всех есть жесткая защитная оболочка (клеточная стенка). Основной компонент – гликопептид муреин. Под клеточной стенкой находится плазматическая мембрана, плазмалемма, ограничивающая единственный цитоплазматический компартмент, содержащий ДНК, РНК, белки и малые молекулы. ДНК прокариот располагается в центральной зоне цитоплазмы в виде плотно уложенных тонких кольцевидных молекул, содержащих до 5*106 азотистых оснований. Длина молекулы – несколько мм. В процессе транскрипции реплицируется как единое целое, поэтому является одним репликоном. Иногда называют «бактериальной хромосомой». Нуклеоид. Прокариотические клетки не имеют в цитоплазме высокоспециализированных органоидов. В цитоплазме у них находятся в виде мельчайших структур лизосомы и рибосомы прокариотического типа 70S. Состоит из большой и малой субьединиц 50S и 30S соответственно. Для протекания энергетических и биохимических процессов плазмолемма бактерий образует внутренние впячивания, которые называются мезосомы. На этих впячиваниях фиксируются ферменты. Основные способы получение энергии – гликолиз, дыхание, фотосинтез. В природе бактерии занимают все экологические ниши. Среди них различают две группы – эубактерии, которые населяют почву и воду и архибактерии, которые живут в экстремальных условиях среды. Архебактерии: анаэробные условия, горячие кислые среды. в очень соленых условиях, анаэробы, вырабатывающие металл. Эубактерии: есть грамположительные и грамотрицательные и др. |